一種雙酶梭菌z-13及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種雙酶梭菌Z_13(Clostridium bifermentans)及其應(yīng)用，屬于微生 物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于抗生素菌渣對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在危害性，國家已將其明確列為危 險(xiǎn)廢物，禁止用于飼料和肥料。抗生素菌渣如按危險(xiǎn)廢物處置，所產(chǎn)生的高額處置費(fèi)用將使 企業(yè)無法承受。另一方面，抗生素菌渣含水率一般在70 %~93 %，干基中含有大量的菌體蛋 白（約40%以上）、粗脂肪（約2~20%)、多糖（約10%以上）、多種氨基酸（如天門冬氨酸、谷氨 酸、纈氨酸、白氨酸等）、微量元素及培養(yǎng)基殘留物等營養(yǎng)物質(zhì)。如果直接丟棄，不僅會(huì)造成 極大的資源浪費(fèi)，而且由于其極易腐敗，引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染。
[0003] 抗生素菌渣含有豐富的有機(jī)物質(zhì)，是厭氧發(fā)酵的優(yōu)良原料。厭氧發(fā)酵技術(shù)也是抗 生素菌渣無害化、資源化處理的一種有效途徑。但是抗生素菌渣厭氧發(fā)酵系統(tǒng)運(yùn)行有機(jī)負(fù) 荷偏低，處理能力與產(chǎn)生量嚴(yán)重不匹配，遠(yuǎn)不能滿足處理需求。投加高效功能微生物是提高 有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵效率的有效方法，篩選能夠高效降解抗生素菌渣的微生物是其關(guān)鍵所 在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種編號為Z-13的雙酶梭菌，其代謝產(chǎn)物具有降解蛋白的 能力，并且該菌可利用多種物質(zhì)產(chǎn)揮發(fā)性有機(jī)酸，如乙酸、丁酸等。另一方面本發(fā)明還提供 了上述菌株的用途。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為： 本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13于2015年10月30日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物菌種保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號為:CGMCC No. 11561。
[0006] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13合成蛋白酶，具有降解蛋白質(zhì)能力。
[0007] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13能利用碳源產(chǎn)乙酸。
[0008] 進(jìn)一步的，所述碳源優(yōu)選葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、丙酸鈉或丁酸鈉。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述雙酶梭菌Z-13的應(yīng)用，用于含蛋白有機(jī)廢棄物處理。
[0010] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13應(yīng)用于抗生素菌渣厭氧發(fā)酵、沼氣發(fā)酵或含蛋 白有機(jī)廢水處理。
[0011] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13應(yīng)用于抗生素菌渣厭氧發(fā)酵、沼氣發(fā)酵或含蛋 白有機(jī)廢水處理時(shí)菌液的接種量為1~20%(菌液與接種后料液的體積比），且雙酶梭菌Z-13 菌的含菌量不低于1〇 8個(gè)/mL。
[0012] 本發(fā)明所述的雙酶梭菌Z-13(CGMCC No. 11561)，在LB培養(yǎng)基上生長，菌落圓形、 乳白色、四周光滑、濕潤、不透明、菌落邊緣整齊。菌體桿狀，革蘭氏陽性、形成芽孢，嚴(yán)格厭 氧生長。VP試驗(yàn)陰性，可使明膠液化，水解酪蛋白，水解淀粉，硝酸鹽還原和H 2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn) 陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性。
[0013] 本發(fā)明所述的雙酶梭菌Z-13適宜生長溫度為25~35 °C，pH值為6.8~7.5。
[0014]本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13在常溫和中溫條件下，可提高抗生素菌渣沼氣產(chǎn)量30%以 上。其次，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13,可利用多種底物產(chǎn)生蛋白酶、揮發(fā)性有機(jī)酸，顯著提高含 多種有機(jī)混雜底物的降解效率。再者，本發(fā)明的雙酶梭菌Z-13除用于抗生素菌渣厭氧發(fā)酵 外，還可有效提高其他含蛋白的廢棄物或廢水厭氧發(fā)酵水解及產(chǎn)沼氣效率。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)， 不僅可以有效提高抗生素菌渣厭氧發(fā)酵效率，而且對促進(jìn)有機(jī)廢棄物無害化、資源化和能 源化利用有重要意義，有著切實(shí)的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。
[0015] 生物樣品保藏信息 雙酶梭菌2-13，分類命名為01〇81：1^(1;[1111113丨€61'11161^3118，已于2015年10月30日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，菌種保藏號為CGMCC No. 11561。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明雙酶梭菌Z-13的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1雙酶梭菌Z-13分離和保藏 雙酶梭菌Z-13是從石家莊市某污水處理廠厭氧污泥中，通過富集培養(yǎng)、傳代、梯度稀釋 方法分離獲得。
[0018] 具體方法是:從石家莊某污水處理廠取厭氧污泥，取少量污泥放到裝有富集培養(yǎng) 基的厭氧瓶中，35 °C富集培養(yǎng)。傳代穩(wěn)定后，采用改良Hungate滾管技術(shù)，用蛋白酶產(chǎn)生菌 初篩培養(yǎng)基進(jìn)行分離篩選，35 °C培養(yǎng)48~72 h，挑選透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)之比D/ d值較大的菌落，接種于LB培養(yǎng)基，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0019] 通過酶活測定法進(jìn)行復(fù)篩。將分離得到的菌株接到LB液體培養(yǎng)基中，于35 °C培養(yǎng) 箱培養(yǎng)48~72 h，發(fā)酵液在溫度4 °C，轉(zhuǎn)速8000 r/min下離心10 min，取上清液測定蛋白 酶活力。測定方法采用國標(biāo)GB/T 23527-2009(蛋白酶測定方法）。獲得菌株Z-13的蛋白酶 活力達(dá)25~3〇 u/mL。
[0020] 采用培養(yǎng)基： (1)富集培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨2.5,酪蛋白3,酵母提取物5,蛋白胨2.5，L-半胱氨 酸鹽酸鹽〇.5，NaCl 5，KH2P〇4l，MgS〇4 0.5,0.1%的刃天青指示劑2滴，去離子水定容，pH值 7.0~7.2〇
[0021] (2)蛋白酶初篩培養(yǎng)基(g/L):脫脂奶粉10,瓊脂粉15,去離子水定容，pH 7.0~ 7.2。
[0022] (3)LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,氯化鈉10,瓊脂15,去離子水定容， pH 7.0~7.4〇
[0023]該菌株Z-13,在LB培養(yǎng)基上生長，菌落圓形、乳白色、四周光滑、濕潤、不透明、菌落 邊緣不整齊。菌體桿狀，革蘭氏陽性、形成芽孢，嚴(yán)格厭氧生長。VP試驗(yàn)陰性，可使明膠液 化，水解酪蛋白和淀粉，硝酸鹽還原和H 2S產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)陰性，吲哚實(shí)驗(yàn)陽性?？衫闷咸烟恰Ⅺ?芽糖、蔗糖、乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)H2。
[0024] 菌株16S rDNA序列分析:選取處于對數(shù)生長期的菌液，用天根公司細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA，以其為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0025] 擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物： 正向引物為Pf: 5'-AGAGTTTGACC TG