專利名稱：一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的pcr引物及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農(nóng)作物真菌病原物分子檢測新技術，具體涉及采用多重PCR檢測小麥田5種土傳真菌病原物的方法的建立及應用。
背景技術：
小麥土傳真菌病害包括紋枯病、全蝕病、根腐病及莖基腐病等，這些病害均可以造成小麥的嚴重減產(chǎn)，是目前威脅小麥安全生產(chǎn)的重要病害。而且這些病害經(jīng)?；旌习l(fā)生，弓丨起更大的損失。早期診斷可以為病害的防控提供依據(jù)，但是這些真菌病害均屬于土壤習居菌，引起癥狀在苗期很難區(qū)分，傳統(tǒng)的早期鑒定手段無法快速準確得到結果。分子生物學的發(fā)展和PCR技術的誕生為快速、準確檢測病原菌提供了基礎。根據(jù)微生物基因組的保守區(qū)段設計特異性引物用于檢測病原菌的方法已得到了廣泛的應用。根據(jù)asiaticum 和/7. graminearum tri6區(qū)域和tri3區(qū)域序列差異，設計篩選了特異性引物，構建了這兩種病原菌的多重PCR檢測體系，方便、快捷的將/7. asia ticum和F. graminearum區(qū)分開來。目前的研究結果表明，引起小麥紋枯病、全蝕病、根腐病及莖基腐病等的病原物主要有7J'麥紋才古病菌cereali5 )>lif (Gaeumannomyces graminis var.tri tici )、禾谷鐮刀菌(F. graminearum )、假禾谷鐮刀菌(F. pseudograminearum )和根腐
(.Bipolaris sorokiniana )

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種同時快速檢測小麥紋枯病菌、全蝕病菌、禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌和根腐蠕孢菌等5種土傳真菌病原的方法，合成同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的PCR引物，優(yōu)化了多重PCR反應體系，可以同時特異性檢測5種土傳真菌病原，此方法具有實驗周期短、靈敏度聞、準確性聞等優(yōu)點。本發(fā)明的技術方案是
一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的PCR引物，
紋枯病菌引物的序列如下
上游引物 Pl :5' - TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3'；
下游引物 P2:5' - CGGirGAGCTGGGTCITTTA -3'；
假禾谷鐮刀菌引物的序列如下
上游引物 P3:5' - CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3'；
下游引物 P4:5' - GAGAATGTGATGACGACAATA -3'；
小麥全蝕病菌引物的序列如下
上游引物 P5:5' - TATGTCAGAGCGGTGAACG -3'；
下游引物 P6:5' - ITCGGTGCCTGGATAGTGA -3'；
根腐蠕孢菌引物的序列如下上游引物 P7 :5' - CGAGCAAGITGTCAAGGAG -3'；
下游引物 P8 :5' - GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3'；
禾谷鐮刀菌引物的序列如下
上游引物 P9:5' - ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3'；
下游引物 PlO :5' - TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3'。一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的檢測方法，提取病原菌的DNA后，進行多重PCR檢測，多重PCR反應體系為10XPCR buffer 2. 5u L,3. 125UTaq酶，dNTP Mixture0. 4mM, Mg2+ 3mM, Pl 0. 4 u L, P2 0. 4 u L, P3 I. 4u L, P41. 4u L, P51. 4u L, P61. 4u L,P70. 7u L, P80. 7 u L, P9 0. 7 u L, PlO 0. 7 u L, ddH20 補至 25 u L。 多重PCR反應條件為94°C預變性4min ;94°C變性Imin、58. 5°C退火lmin、72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;于4°C條件下保存。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明建立的多重PCR檢測體系，可以同時檢測小麥紋枯病菌、全蝕病菌、禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌和根腐蠕孢菌等5種病原真菌。本發(fā)明擴增產(chǎn)物片段大小與預期結果一致，并且5對引物僅對目標特異，無非特異條帶產(chǎn)生，因而能很好的區(qū)分5種病原菌。簡便快速4小時完成樣品制備和檢測，同時檢測出小麥紋枯病菌、全蝕病菌、禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌、根腐蠕孢菌等5種病原物；靈敏度高可以檢測出0. 39ng的病原物DNA樣品；準確檢測結果準確性高于傳統(tǒng)的分離鑒定和癥狀鑒定方法。


圖I為五種病原菌單重PCR檢測結果，泳道M :分子量標準DL2000 ;1，2 :禾谷鐮刀菌；3，4 :紋枯病菌；5，6 :假禾谷鐮刀菌；7，8 :全蝕病菌；9，10 :根腐蠕孢菌N空白對照；
圖2為多重PCR檢測結果，M :分子量，1，2，3泳道為三次重復多重檢測結果，N:陰性對照；
圖3不同濃度DNA多重PCR檢測結果，M:分子量標準DL2000，I :1/2 2 :1/4，3 :1/8，4:1/16，5:1/32，6:1/64，7:1/128。
具體實施例方式一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的PCR引物，
紋枯病菌引物的序列如下
上游引物 Pl :5' - TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3'；
下游引物 P2:5' - CGGirGAGCTGGGTCITTTA -3'；
假禾谷鐮刀菌引物的序列如下
上游引物 P3:5' - CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3'；
下游引物 P4:5' - GAGAATGTGATGACGACAATA -3'；
小麥全蝕病菌引物的序列如下
上游引物 P5:5' - TATGTCAGAGCGGTGAACG -3'；
下游引物 P6:5' - ITCGGTGCCTGGATAGTGA -3'；
根腐蠕孢菌引物的序列如下
上游引物 P7:5' - CGAGCAAGITGTCAAGGAG -3'；下游引物 P8 :5' - GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3'；
禾谷鐮刀菌引物的序列如下
上游引物 P9:5' - ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3'；
下游引物 PlO :5' - TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3'。一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的檢測方法，提取病原菌的DNA后，進行多重PCR檢測，多重PCR反應體系為10XPCR buffer 2. 5u L,3. 125UTaq酶，dNTP Mixture0. 4mM, Mg2+ 3mM, Pl 0. 4 u L, P2 0. 4 u L, P3 I. 4u L, P41. 4u L, P51. 4u L, P61. 4u L,P70. 7u L, P80. 7 u L, P9 0. 7 u L, PlO 0. 7 u L, ddH20 補至 25 u L。多重PCR反應條件為94°C預變性4min ;94°C變性lmin、58. 5°C退火lmin、72°C延
伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;于4°C條件下保存。本發(fā)明具體操作如下
I.材料和方法
I.I實驗材料
I.I. I菌株5種菌株都由河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室和河南農(nóng)業(yè)大學植物病理學科實驗室提供。I. I. 2 試劑Taq 酶、dNTP、Mg2+均購自 TaKaRa Bio 公司，引物由 Invitrogen 試劑公司合成。I. I. 3儀器美國ABI Veriti 96孔熱循環(huán)儀-梯度PCR儀，DYY 6C電泳儀，凝膠成象分析系統(tǒng)UVI
1.2實驗方法
1.2.1病原菌培養(yǎng)取保存的菌株接種于PDA平板上，25°C下生長3 d，挑新鮮菌絲。接種于250mL裝有I / 3體積PDB的三角瓶中。25V 120 r / min,培養(yǎng)3_4天，至生成大量菌絲團為止。雙層紗布過濾，IOOml蒸餾水連續(xù)沖洗，濾紙吸干水分，置于I. 5ml離心管-20°C保存?zhèn)溆谩. 2. 2病原菌DNA的提取采取傳統(tǒng)的CTAB法，做適當改動。取IOOmg左右吸干的新鮮菌絲，液氮研磨，移入I. 5ml離心管中，加入700ii L65°C預熱的CTAB溶液，65°C水浴Ih0之后加入等積極的抽提液1(苯酹氯仿異戍醇=25:24: l)12000rpm離心IOmin,吸上清，重復I次。加入600微升氯仿異戍醇24:1,輕輕顛倒幾次，12000rpm, 4度,離心IOmin,吸上清；再加入_20°C預冷的異丙醇，_20°C沉淀lh，12000rpm離心lOmin，倒上清，用75%酒精洗滌沉淀3次，超凈工作臺上風干20min，在吹干的離心管中加入20-200微升ddH20，4度保存?zhèn)溆谩?.2. 3引物設計禾谷鐮刀菌及假禾谷鐮刀菌引物參考Nicholson及Aoki&0’Donnel,禾谷絲核菌引物參考陸瓊嫻。根據(jù)P-tubulin基因設計全蝕病菌引物，約440bp，根據(jù)ITS區(qū)設計根腐蠕孢菌引物，約372bp。如表I所示。表I小麥莖基常見真菌病菌PCR引物
權利要求
1.一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的PCR引物,其特征在于 紋枯病菌引物的序列如下 上游引物 Pl :5' - TCCTCCCGCTTATTGATATGC -3'； 下游引物 P2:5' - CGGirGAGCTGGGTCITTTA -3'； 假禾谷鐮刀菌引物的序列如下 上游引物 P3:5' - CGGGGTAGTTTCACATTTCCG -3'； 下游引物 P4:5' - GAGAATGTGATGACGACAATA -3'； 小麥全蝕病菌引物的序列如下 上游引物 P5:5' - TATGTCAGAGCGGTGAACG -3'； 下游引物 P6:5' - ITCGGTGCCTGGATAGTGA -3'； 根腐蠕孢菌引物的序列如下 上游引物 P7:5' - CGAGCAAGITGTCAAGGAG -3'； 下游引物 P8:5' - GTGAAAGTCTCAATAGCACCC -3'； 禾谷鐮刀菌引物的序列如下 上游引物 P9:5' - ACAGATGACAAGATTCAGGCACA -3'； 下游引物 PlO :5' - TTCTTTGACATCTGTTCAACCCA-3'。
2.一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的檢測方法，提取病原菌的DNA后，進行多重PCR檢測，其特征在于，多重PCR反應體系為=IOXPCR buffer 2. 5 ii L，3. 125UTaq酶，dNTP Mixture 0. 4mM, Mg2+ 3mM, Pl 0. 4 u L, P2 0. 4 u L, P3 I. 4u L, P41. 4 u L, P51. 4u L,P61. 4u L, P70. 7u L, P80. 7 u L, P9 0. 7 u L, PlO 0. 7 u L, ddH20 補至 25 u L。
3.根據(jù)權利要求2所述的同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的檢測方法，其特征在于，多重PCR反應條件為94°C預變性4min ;94°C變性lmin、58. 5°C退火lmin、72°C延伸lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;于4°C條件下保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時檢測小麥田5種土傳真菌病原物的PCR引物，紋枯病菌引物的序列如下上游引物P15′-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3′；下游引物P25′-CGGTTGAGCTGGGTCTTTTA-3′。本發(fā)明建立的多重PCR檢測體系，可以同時檢測小麥紋枯病菌、全蝕病菌、禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌和根腐蠕孢菌等5種病原真菌。本發(fā)明擴增產(chǎn)物片段大小與預期結果一致，并且5對引物僅對目標特異，無非特異條帶產(chǎn)生，因而能很好的區(qū)分5種病原菌。簡便快速4小時完成樣品制備和檢測，同時檢測出小麥紋枯病菌、全蝕病菌、禾谷鐮刀菌、假禾谷鐮刀菌、根腐蠕孢菌等5種病原物；靈敏度高可以檢測出0.39ng的病原物DNA樣品；準確檢測結果準確性高于傳統(tǒng)的分離鑒定和癥狀鑒定方法。
文檔編號C12Q1/68GK102796812SQ20121013045
公開日2012年11月28日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權日2012年4月28日
發(fā)明者李洪連, 陳清清, 孫炳劍, 張煜, 施艷, 袁虹霞, 邢小萍 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學