檢測植煙土壤黑脛病菌定殖量的鎖核苷酸增敏實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測植煙±壤黑腔病菌定殖量的鎖核 巧酸增敏實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測方法，適用于各種植煙±壤中的煙草黑腔病菌抱子數(shù)量的 定量檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草黑腔病是一種毀滅性±傳真菌病害。有報(bào)導(dǎo)表明在我國煙草黑腔病平均發(fā)病 率為10 %~20%，發(fā)病率高的田塊高達(dá)75 %該叫堯霞等，2004)，較為嚴(yán)重的甚至造成絕收 (陳瑞泰等，1997 ;蘇德成，1992)。我國每年煙草因黑腔病引起的損失超過2億元(趙振山， 2005)，煙草黑腔?。═obaccoblackshank)是疫霉菌煙草變種引起的一種±傳病害，其中 受±壤環(huán)境和栽培措施影響較大，在河南、山東和安徽、云南、貴州、四川、湖南、廣東、廣西、 福建等煙區(qū)發(fā)生。
[0003]W前較為傳統(tǒng)的植物病害診斷方法常根據(jù)病組織的癥狀和病原菌的特征進(jìn)行，但 是效率較低且耗時(shí)較多。近年來血清學(xué)和核酸技術(shù)的應(yīng)用，為植物病原的快速檢測提供了 不少新技術(shù)。有人采用RFLPs技術(shù)對(duì)邱.jOisi的3個(gè)生理小種進(jìn)行研究，差 異明顯（Coddington，1992)。Kistle;r(1989)等人對(duì)mtDNAs的差異進(jìn)行分析，能夠區(qū)別出 尖鑲抱巧wariiM? 〇巧巧οατω?的不同轉(zhuǎn)化型；謝勇等根據(jù)從GeneBank數(shù)據(jù)庫獲得的引起黑 腔病的疫霉屬真菌rDNAITS區(qū)段序列，合成了 1對(duì)17bpDNA特異引物進(jìn)行了不同病原菌、 病組織及±壤中寄生疫霉菌rar.nico化Mae)的特異擴(kuò)增試驗(yàn)，包I制了一套 快速檢測的PCR方法。目前的檢測方法靈敏度較低，研制敏感性更高的煙草黑腔病菌檢測 方法是當(dāng)務(wù)之急。
[0004] 鎖核酸化ockednucleicacid,LNA)是一種近年來開始被人們關(guān)注的新型的寡 核酸衍生物，在藥學(xué)研究方面引起了人們的廣泛關(guān)注，有望成為分子治療一些疾病如癌癥 的突破口。其結(jié)構(gòu)中B-D-巧喃核糖的2-0，4-C位通過縮水作用構(gòu)成環(huán)形的氧亞甲基橋、 硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，巧喃糖的結(jié)構(gòu)鎖定在C3內(nèi)型的N構(gòu)型，形成了剛性的縮合結(jié) 構(gòu)。L環(huán)形橋鎖定了巧喃糖的N構(gòu)型，降低核糖結(jié)構(gòu)的柔初性，增加憐酸鹽骨架的穩(wěn)定 性。在寡核巧酸中加入鎖（LNA)修飾堿基可顯著增強(qiáng)寡核巧酸與DNA的結(jié)合能力；含有 LNA修飾的堿基的引物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于巧光PCR反應(yīng)體系。但目前尚未發(fā)現(xiàn)此類技術(shù)應(yīng)用 于煙草黑腔病菌在植煙±壤中的檢測方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的正是基上述現(xiàn)有狀況提供了一種LNA增敏的植煙±壤黑腔病菌抱 子數(shù)量的巧光定量PCR檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的： 一種檢測煙草黑腔病菌在植煙±壤中定殖數(shù)量的方法，包括如下步驟， (1) W黑腔病菌數(shù)量對(duì)數(shù)值為X軸，巧光PCR擴(kuò)增儀讀出的Ct值為Υ軸，繪制數(shù)量對(duì)數(shù) 與Ct值的標(biāo)準(zhǔn)曲線： 巧采用LNA增敏的定量PCR方法將煙草黑腔病菌特異區(qū)DNA進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增出基因 片段為25化P時(shí)，即得到煙草黑腔病菌特異區(qū)DNA; 潭將黑腔病菌特異區(qū)DNA插入到感受態(tài)大腸桿菌載體PMD18-T載體后，接種到含有氨 節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，氨節(jié)青霉素在LB培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度為l(K)ng/mL;培養(yǎng)24h后 采用質(zhì)粒試劑盒（TAKARA公司）制備煙草黑腔病菌特異區(qū)DNA質(zhì)粒(制備過程按照該公司 提供的說明書）； 霸將奠步制備好的質(zhì)粒經(jīng)紫外分光光度計(jì)A26〇定量，測得質(zhì)粒母液質(zhì)量濃度，然后用 滅菌后的超純水稀釋，得到母液逐級(jí)稀釋液； i將步得到的逐級(jí)稀釋液，采用巧光定量PCR擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增，每級(jí)稀釋液擴(kuò)增出 25化Ρ產(chǎn)物時(shí)，記錄該Ct值，W每級(jí)稀釋液拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為X軸，CT值為Υ軸，即繪制出拷 貝數(shù)與Ct值得標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2) 從煙區(qū)進(jìn)行感染黑腔病煙株附近±壤的取樣后，提取DNA; (3) 采用LNA增敏的巧光定量PCR擴(kuò)增法對(duì)待測DNA進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)擴(kuò)增出基因片段為 25化P的產(chǎn)物時(shí)，記錄此時(shí)待測DNA的Ct值，將該Ct值帶入到步驟（1)繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線 當(dāng)中，得到PCR反應(yīng)體系中黑腔病菌拷貝數(shù)，根據(jù)如下公式計(jì)算出黑腔病菌在±壤中的定 殖數(shù)量； Copies=CpcRX (Vd,a/Vpcr) X (1/Wext) Cptf為PCR反應(yīng)得到的黑腔病菌數(shù)量，VwA為植煙上壤提取DM得到的最終溶解量，VPC,為定量PCR的加樣量，WexT為提取DM所使用的植煙±壤重量。
[0007] 所述步驟（1)和步驟（3)中巧光定量PCR擴(kuò)增方法中所用的試劑包括12. 5μ1 的2Χ巧光定量PCR反應(yīng)混合液(購買于羅氏公司），濃度均為lOumol/L的正向引物、反向 引物各1μ1，lul的黑腔病菌特異區(qū)DNA質(zhì)粒溶液或待測黑腔病菌DNA溶液，超純水補(bǔ)至 25μ1〇
[000引所述的LNA修飾的正向引物和反向引物的序列如下：正向引物為： 5'-TGAACGCATA王TGCACTTCC-3'；反向引物：5' -GACAAACCAGTCGCCAATTT-3'；LNA修飾位點(diǎn)W 下劃線表示。
[0009] 所述的步驟（1)和步驟（3)的反應(yīng)條件為95°C熱啟動(dòng)8分鐘預(yù)變性后；進(jìn)入擴(kuò)增 循環(huán)：95°C30秒，60°C10秒，72°C20秒循環(huán)45次。
[0010] 本發(fā)明的重要效果是，通過對(duì)煙草黑腔病菌特異區(qū)域DNA進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，能夠準(zhǔn) 確地單一檢測出黑腔病菌的定殖量，而且采用的LNA增敏的巧光定量PCR擴(kuò)增方法，黑腔病 菌在每個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)上都有相應(yīng)的Ct值，該P(yáng)CR檢測方法高效省時(shí)，操作方便快捷。
[0011] 本發(fā)明W5.8SribosomalRNA及其相鄰的口S區(qū)域片段為目標(biāo)檢測序列，采 用LNA技術(shù)合成覆蓋目標(biāo)片段的引物序列，結(jié)合定量核酸擴(kuò)增技術(shù)，建立了一種鎖核巧酸 (LNA)增敏的煙草黑腔病菌實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測方法。
[0012] 本發(fā)明的鎖核巧酸（LNA)增敏的煙草黑腔病菌實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測方法適用于 各種植煙±壤中的黑腔病菌定殖量的定量檢測，且具有W下優(yōu)勢： 劈靈敏度較高配置好的標(biāo)準(zhǔn)品為例，檢測闊值可W達(dá)到10個(gè)拷貝/μ1。
[0013] 變檢測時(shí)間短，從植煙±壤DM的提取到結(jié)果獲得，可在4~5小時(shí)之內(nèi)完成。
[0014] 錫本發(fā)明的方法對(duì)模板DNA的要求較低，無論是沙質(zhì)±，壤±、紅±等都能取得較 好的檢測結(jié)果。
[001引囊定量PCR檢測的樣本量較大，在4~5小時(shí)內(nèi)最多可W檢測384例。
[0016] 鬻本發(fā)明建立的鎖核巧酸（LNA)增敏的煙草黑腔病菌實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測方 法，具有較高的檢測靈敏度，對(duì)于上壤中極微量的黑腔病菌定殖量的檢測能夠起到極大的 促進(jìn)作用。
【附圖說明】
[0017] 圖1、PCR反應(yīng)中不同溫度梯度對(duì)LNAPCR擴(kuò)增的影響； 圖 1 中：Μ為DL500marker,泳道 1~7 分別為 55 °C、55. 8 °C、57. 4 °C、59. 7 °C、62. 6 °C、65 °C、66. 3°C的退火溫度下菌絲DM擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，泳道8為陰性對(duì)照。
[001引 圖2、普通DNA引物和LNA引物在不同退火溫度下的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖像； 圖2中：Μ為化500marker, 1為LNA引物的陰性對(duì)照，2為普通DNA引物的陰性對(duì)照，L1~L7 和D1~D7 分別為LNA引物和DNA引物在 55°C、55. 8°C、57. 4°C、59. 7°C、62. 6°C、65°C、 66. 3°C退火溫度下的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0019] 圖3、含有5. 8SribosomalRNA及其相鄰的口S區(qū)域片段質(zhì)粒的10倍稀釋液的 擴(kuò)增曲線； 圖3中：曲線1~5表示黑腔病菌質(zhì)粒濃度分別為1.0Xl〇6，1.0Xl〇5，l.〇Xl〇4，1.0X103，1.0X102個(gè)/μl。
[0020] 圖4、根據(jù)含有5. 8SribosomalRNA及其相鄰的口S區(qū)域片段質(zhì)粒的10倍稀釋 液定量PCR擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021] 圖5、植煙±壤DNA定量PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[002引圖6、植煙±壤DNA定量PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] W下結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
做進(jìn)一步的說明。
[0024] 實(shí)施例1、±壤取樣與±壤DNA的提取 選取黑腔病發(fā)病較重的田塊，在感染黑腔病煙株靠近根莖結(jié)合部附近取樣2~3克± 壤，將其裝入50ml離屯、管W備DNA提取使用。
[00巧]實(shí)驗(yàn)中對(duì)植煙±壤0臟的提取采用美國M0BI0公司的P0WERS0ILDNAisolation kit(專口用于提取DNA的試劑盒），提取方法如下：將0. 25g