專利名稱：非標記熒光pcr結合hrm分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種非標記熒光PCR以及高分辨率熔解曲線(HRM)分析檢測阪崎腸桿菌的方法，屬于微生物檢測領域。
背景技術：
阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是腸桿菌科的一種，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌，最近，國際上有學者建議將其更名為克羅諾桿菌屬(Cronobacterspp)，但未得到官方正式確認。阪崎腸桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和茵血癥，死亡率高達50%以上。國際有眾多學者針對阪崎腸桿菌生化特征和核糖體間隔序列等，將其分為兩大分支，其代表菌株分別為美國菌種保藏中心的ATCC 51329和ATCC 29544。熒光PCR檢測技術大致分為兩大類熒光探針法(標記熒光PCR)和通用型的熒光 染料法(非標記熒光PCR)。前者則利用熒光標記的特異性探針或者引物來識別模版，優(yōu)點是特異性更高，適用于擴增序列專ー檢測，不過檢測成本要高很多。而后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA分子結合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的増加，其優(yōu)點是無需另外設計熒光探針，簡便易行，成本較低。其中，熒光染料又分為非飽和染料(如Sybr Green)和飽和染料(如 LC Green 等)。相對Sybr Green等非飽和染料來說，Eva Green、LC Green、SYT09等飽和染料具有以下優(yōu)點①飽和的染料對PCR反應沒有任何抑制作用，因此可以在PCR反應之前加入，而其它非飽和熒光染料若較多加入到反應液中會抑制PCR反應，因此只能限量加入，從而對熒光PCR反應的指示收到限制。②DNA高溫變性吋，非飽和熒光染料加入則會造成DNA雙鏈高溫變性吋，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對于高GC含量的PCR產(chǎn)物，Tm值較高，在DNA雙鏈高溫熔解吋，飽和突光染料結合核酸更穩(wěn)定。高分辨熔解曲線(high-resolution melt, HRM)分析技術是近幾年來在國外興起的一種用于基因突變掃描和基因分型的最新遺傳學分析方法。它是ー種高效穩(wěn)健的PCR技術，不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結束后直接運行高分辨熔解曲線分析，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、甲基化、基因分型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現(xiàn)了真正的閉管操作，HRM技術受到普遍關注。HRM利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結合情況記錄熔解曲線，從而對樣品進行檢測。雖然帶HRM模塊的熒光PCR儀與普通熒光PCR儀購買價格相差不大，但其溫度均一性要高很多。如普通定量PCR儀溫度均一性±0. 25 °C，溫度分辨率為O. I °C，而Rotor-Gene 6000溫度均一性為±0.01° C，溫度分辨率為0.02° C。其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達到對單個堿基差異的區(qū)分，加上飽和性染料(LC Green、Eva Green等)的出現(xiàn),使得HRM這ー技術的普及使用成為可能。
目前，阪崎腸桿菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和分子檢測方法。其中傳統(tǒng)的阪崎腸桿菌分離檢測方法，依賴于生化和形態(tài)學特點，國際上通常以美國FDA頒布的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離計數(shù)”作為經(jīng)典方法。2008年我國也參照制定頒布了阪崎腸桿菌檢驗國家標準(GBT 4789. 40-2008)，并于2010年進行了修訂(GB4789. 40-2010)，規(guī)范了阪崎腸桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法和分子檢測方法。但傳統(tǒng)的檢測方法存在操作繁瑣、耗時長、易漏檢等缺點。分子檢測方法中，包括了常規(guī)PCR方法，但是常規(guī)PCR需要擴增后進行電泳，操作復雜而且極易引起污染。而探針法PCR則存在檢測成本很高，試劑保存期短等缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供ー種操作簡便、快速，檢測結果準確，使用成本低的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下方案—種非標記突光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法,其特征在于包括以下步驟A、根據(jù)阪崎腸桿菌OmpA基因設計引物對；B、提取樣本DNA后，利用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增；C、應用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分型分析，確定阪崎腸桿菌的基因型。進ー步地，本發(fā)明按以下反應步驟進行(I)采用PRMER等軟件，根據(jù)GeneBank發(fā)布的序列，針對阪崎腸桿菌OmpA基因設計的引物對，設計非標記熒光PCR擴增阪崎腸桿菌上游引物序列為5 ‘-GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3’序列，其下游引物為5 ‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’(2)標準品模板的制備以常規(guī)PCR方法擴增阪崎腸桿菌OmpA基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分析，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞，篩選得到單菌落，挑選但菌落至含含抗生素的液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質粒，以提取的重組質粒DNA為模板進行PCR鑒定，并對重組質粒進行測序鑒定。提取驗證正確的陽性重組質粒，并測定其濃度，將其10倍倍比稀釋。(3)非標記熒光PCR擴增和HRM分析提取阪崎腸桿菌樣本DNA后，利用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增；應用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀(包括Corbett Rotor公司的Gene 6000、Roche公司LightCycler 480等)對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定擴增產(chǎn)物的Tm值和基因型。本發(fā)明中制備所述熒光定量PCR反應中所采用的反應液20 μ L，包含下列成分權利要求
1.一種非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于包括以下步驟 A、根據(jù)阪崎腸桿菌OmpA基因設計引物對； B、提取樣本DNA后，利用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增； C、應用帶HRM模塊的熒光PCR儀對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分析，確定擴增產(chǎn)物的Tm值和基因型。
2.根據(jù)權利要求I所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于所述的阪崎腸桿菌OmpA基因為阪崎腸桿菌外膜蛋白基因A，所述引物對的上游引物序列為5 ‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’，所述引物對的下游引物序列為5 ‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。
3.根據(jù)權利要求I所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于步驟B中進行非標記熒光PCR擴增過程中是在反應液中進行的，其中制備20 UL的反應液由以下組分組成PCR 反處液(IOX)2 UL 測TPs混合液(各2. 5mM) L 5 2. 5 ML Taq 聚介Pft(5U/ p L)() I ().6 P L丄游引物(IOpM)p L下游 1JI物(IOpM)0.5 1.0 HlDM模版I PL熒光染料(20 X)I PL水補齊至20 P L0
4.根據(jù)權利要求3所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于所述的熒光染料為DNA飽和性染料。
5.根據(jù)權利要求4所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于所述的DNA飽和性染料為Eva Green染料、LC (;reeni) PLUS染料、SYTO 9染料中的一種或兩種以上的混合物。
6.根據(jù)權利要求3所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于所述dNTP混合液為由IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP組成的混合液。
7.根據(jù)權利要求I或3所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于步驟B中非標記熒光PCR擴增的擴增反應按以下步驟進行 (1)92°C 96°C預變性 30s ； (2)92°C 96°C變性 10 30s, 55-63°C退火 10 30s, 72°C 10 30s,共進行 40 50個循環(huán)；(3)72°C延伸 10 30s。
8.根據(jù)權利要求I所述的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于步驟C中對PCR擴增產(chǎn)物進行Tm值和基因型分析，按以下步驟進行 (1)92°C 96°C變性 Imin ； (2)40°C復性Imin ； (3)然后初始熔解溫度60 65°C，開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實時檢測突光信號，15 25次/秒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法，其特征在于包括以下步驟A根據(jù)阪崎腸桿菌OmpA基因設計引物對；B提取樣本DNA后，利用設計的引物對進行非標記熒光PCR擴增；C應用帶HRM模塊的熒光定量PCR儀對PCR擴增產(chǎn)物進行HRM分型分析，確定阪崎腸桿菌的基因型。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，檢測結果準確，使用成本低的非標記熒光PCR結合HRM分析技術檢測阪崎腸桿菌的方法。
文檔編號C12R1/01GK102732612SQ20121016720
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權日2012年5月25日
發(fā)明者伍朝暉, 張憲臣, 朱興全, 楊潔雅, 柏建山, 簡志華, 蔡先全, 邱德義 申請人:張憲臣, 蔡先全