一種基于免標(biāo)記無酶dna機(jī)器熒光放大策略檢測尿嘧啶-dna糖基化酶活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種基于免標(biāo)記無酶DNA機(jī)器巧光放大策略檢測尿喀晚-DNA糖基化 酶活性的方法，屬于蛋白定性和定量檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 尿喀晚-DNA糖基化酶扣DG)是一種DNA修復(fù)酶，它在保持細(xì)胞基因組完整性中起 著關(guān)鍵作用。它能通過催化水解連接著尿喀晚和脫氧核糖的N-糖巧鍵，移除DNA中尿喀晚 損傷。異常的UDG活性將抑制細(xì)胞對尿喀晚損傷的響應(yīng)并與各種疾病直接相關(guān)，包括人類 免疫缺陷癥，淋己瘤和布魯姆綜合征。研究結(jié)果表明對于該些疾病，UDG活性已成為一種有 前途的生物標(biāo)志物，并且對UDG活性的檢測方法在UDG功能研究和臨床診斷中是一種有潛 力的候選工具。
[0003] 檢測UDG活性的常用方法是凝膠電泳法，電化學(xué)法和比色法。除了該些方法，基于 巧光的UDG活性檢測方法，由于其具有安全、簡單和靈敏等優(yōu)點(diǎn)而引起了研究者的廣泛關(guān) 注。目前已設(shè)計(jì)出許多用于UDG活性檢測的巧光方法，它們用含尿喀晚的DNA探針進(jìn)行目 標(biāo)物的識別和信號輸出，實(shí)現(xiàn)了簡單檢測UDG活性。然而，已報(bào)道的用于檢測UDG活性的巧 光方法的靈敏度并不完全令人滿意，因此信號放大方法開始被引入到UDG活性巧光檢測法 中。俞課題組提出了一種基于自催化的DNA酶放大方法用于巧光檢測UDG活性，提高了檢測 的靈敏度，該方法的檢測限為0. 002U/血。另外，Lu及其同事證明了一種放大巧光策略用于 UDG活性的定量檢測，通過UDG-相關(guān)的DNA酶的失活或活化，產(chǎn)生低的檢測限為0. 0034U/ rnL 〇
[0004] 盡管上述檢測UDG活性的巧光放大方法已實(shí)現(xiàn)了很好的性能，但是該些方法依靠 雙標(biāo)記的巧光探針，或/和蛋白酶。對于共價(jià)標(biāo)記有巧光團(tuán)和巧滅團(tuán)的雙標(biāo)記巧光探針而 言，巧滅團(tuán)可能不能完全巧滅供體的巧光，導(dǎo)致高的背景信號并限制了檢測靈敏度的進(jìn)一 步提高。另外，蛋白酶對反應(yīng)條件敏感并易失活，該會干擾信號的放大能力并導(dǎo)致檢測結(jié)果 重現(xiàn)性差的問題。
[0005] DNA機(jī)器是超分子核酸結(jié)構(gòu)，當(dāng)存在合適的引物時(shí)，它能在分子水平上表現(xiàn)出類似 機(jī)器的功能。DNA機(jī)器已被用作開關(guān)、步行器或放大傳感器。特別地，因?yàn)镈NA機(jī)器僅在簡單 操作下就能進(jìn)行自主和有效地放大，所W它們已被用于放大檢測核酸，小分子和金屬離子。 但目前尚未有基于DNA機(jī)器的靈敏巧光放大策略用于UDG活性檢測的公開文獻(xiàn)報(bào)道，因此， 發(fā)展一種新的巧光策略用于免標(biāo)記、無酶和靈敏檢測UDG活性是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于免標(biāo)記無酶DNA 機(jī)器巧光放大策略檢測尿喀晚-DNA糖基化酶活性的方法。本發(fā)明采用包含尿喀晚堿基和 引發(fā)序列的雙鏈DNA(dsDNA)探針識別UDG目標(biāo)物并伴隨引發(fā)鏈的釋放，該引發(fā)鏈可激活免 標(biāo)記無酶DM機(jī)器，產(chǎn)生放大的巧光信號。由于dsDNA探針及特定DM機(jī)器設(shè)計(jì)，本發(fā)明的 檢測方法成功實(shí)現(xiàn)了背景降低和信號放大，產(chǎn)生了低的檢測限化〇〇〇44U/mL)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測宮頸癌化ela)細(xì)胞裂解液中的UDG活性的方 法。
[000引為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0009] 一種基于免標(biāo)記無酶DNA機(jī)器巧光放大策略檢測尿喀晚-DNA糖基化酶活性的方 法，包括W下步驟：
[0010] (1)用于UDG的識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的探針的制備：
[0011] 首先設(shè)計(jì)一個(gè)含尿喀晚堿基和引發(fā)序列的雙鏈DNA(dsDNA)探針P1-P2,其中P1鏈 為抑制鏈，其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示；P2鏈為含尿喀晚DNA序列與引發(fā) 序列的嵌合共輛鏈，其核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所示；P1鏈和P2鏈部分互補(bǔ)形 成雙鏈 DNA(dsDNA)探針 P1-P2 ;
[001 引 P1 ;5' -GAAATTCTTAAGTAGTCAG-3' ；
[0013] P2:5 ' -CGACATCTAACCTAGCTGACTACUUAAGAAUUTC-3 ' ；（其中，斜體部分為引發(fā)序列）
[0014] (2)免標(biāo)記無酶的DNA機(jī)器運(yùn)行部分的構(gòu)建：
[0015] 根據(jù)P2鏈的引發(fā)序列，設(shè)計(jì)兩個(gè)部分互補(bǔ)的發(fā)夾探針H1和肥用于構(gòu)建免標(biāo)記無 酶的DNA機(jī)器的運(yùn)行部分，發(fā)夾探針H1的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO. 3所示；發(fā)夾 探針肥的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所示；G-四聯(lián)體佑4)序列嫁接在發(fā)夾探針 H2的末端；
[0016] H1:5，-AGTCAGCTAGGTTAGATGTCGCTGACTGGGTAGGGCCGACATCTAACCTAG-3，，
[0017] 肥：5, -ATGTCGGCCCTACCCAGTCAGCGACATCTAACCTAGCTGACTGGGTAGGGCGGGTTGGG-3,； [00化](3)UDG的活性檢測；
[0019] 將步驟（1)制備的雙鏈DNA(dsDNA)探針P1-P2及待檢測的UDG加入到反應(yīng)緩沖 液中，得到體系的終體積為50 y L，體系中雙鏈DNA (dsDNA)探針P1-P2的濃度為50-500nM， 優(yōu)選為200nM，體系在37°C下解育30-180min，使堿基移除反應(yīng)發(fā)生，然后將步驟（2)中的發(fā) 夾探針H1、嫁接有G-四聯(lián)體序列的發(fā)夾探針肥加入到解育后的溶液中，得到體系的終體積 為100 y L體系中，發(fā)夾探針化的濃度為100-600nM，發(fā)夾探針肥的濃度為400-900nM，在 37°C下，DNA機(jī)器進(jìn)行20-120min的放大反應(yīng)，再向反應(yīng)體系中加入0. 5-20UL 200 UM的 N-甲基化咐IX(NMM)，并在37°C下解育10-120min，優(yōu)選為30min，得反應(yīng)產(chǎn)物；對反應(yīng)產(chǎn)物 進(jìn)行巧光測定，構(gòu)建巧光強(qiáng)度與UDG濃度之間的線性曲線，對某一樣品，可通過測定樣品的 巧光強(qiáng)度，代入線性曲線，計(jì)算UDG濃度。
[0020] 步驟（3)中，所述反應(yīng)緩沖液的組成為；20mM Tris-肥1，1. OmM邸TA，1. OmM二硫 蘇糖醇值TT)，抑8.0。
[0021] 步驟（3)中，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行巧光測定的方法為：將反應(yīng)產(chǎn)物溶液加入到100 y L 的石英巧光池中，置入巧光分光光度計(jì)中進(jìn)行巧光測定，參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)電壓為700V;激 發(fā)波長為399nm ;發(fā)射波長為618nm ;激發(fā)狹縫寬度為lOnm ;發(fā)射狹縫寬度為lOnm。
[002引本發(fā)明的基于免標(biāo)記無酶DNA機(jī)器的巧光放大策略檢測UDG活性的原理為： [0023] 具體原理如圖1所示，為得到令人滿意的結(jié)果，該里用到的核酸鏈被合理設(shè)計(jì)。其 中，P1是一條抑制鏈。另外，P2是含尿喀晚DNA序列（黑色）與引發(fā)序列（紅色）的嵌合 共輛鏈。該包含尿喀晚堿基和引發(fā)序列的單鏈DM (ssDNA) P2能與抑制鏈PI部分互補(bǔ)進(jìn)而 形成Pl-P2dsDNA探針。Pl-P2dsDNA探針顯示出相對高的解鏈溫度，使該探針成為一種穩(wěn)定 的雜交并封閉引發(fā)序列。根據(jù)引發(fā)序列，本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩個(gè)部分互補(bǔ)的發(fā)夾探針H1和H2用 于構(gòu)建免標(biāo)記無酶的DNA機(jī)器。為避免復(fù)雜的化學(xué)標(biāo)記，G-四聯(lián)體（G4)序列被嫁接在肥 的末端（區(qū)域4和區(qū)域W。當(dāng)H2W發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在時(shí)，區(qū)域4被隱藏在H2的頸部。因此，此 時(shí)G4構(gòu)型不能形成。在UDG作用下，尿喀晚堿基被從P2的脫氧磯酸骨架中移除，產(chǎn)生無堿 基（A巧位點(diǎn)，導(dǎo)致Pl-P2dsDNA探針顯示出較低的解鏈溫度，進(jìn)而導(dǎo)致P2'鏈從Pl-P2dsDNA 探針中釋放出來。釋放的P2'鏈可W引發(fā)DM機(jī)器的信號放大過程。特別地，引發(fā)鏈P2'中 的區(qū)域1被暴露，與發(fā)夾H1中可接近的立足點(diǎn)r雜交，進(jìn)而引發(fā)鏈遷移過程并暴露發(fā)夾H1 的3, 4, 1區(qū)域。生成的完全雜交物H1-P2'打開了 H1并暴露出新的立足點(diǎn)，區(qū)域3,它能與 發(fā)夾肥的3*區(qū)域成核。結(jié)果是，通過鏈遷移，發(fā)夾肥的3, 2, 1，4, 5區(qū)域是完全可及的。因 為H1-肥復(fù)合物比H1-P2'雜交物更穩(wěn)定，所W發(fā)夾肥的可接近區(qū)域3, 2, 1能置換P2'，形 成H1-肥復(fù)合物并釋放出肥的4, 5區(qū)域。肥中釋放的4和5區(qū)域在單價(jià)陽離子存在下能 折疊成G4構(gòu)型。緊接著，釋放的P2'能引發(fā)下一個(gè)反應(yīng)循環(huán)而連續(xù)產(chǎn)生含G4結(jié)構(gòu)的H1-肥 復(fù)合物。最后，對G4結(jié)構(gòu)具有明顯結(jié)構(gòu)選擇性的NMM被加入到反應(yīng)系統(tǒng)中，形成的G4-NMM 復(fù)合物能產(chǎn)生免標(biāo)記的巧光信號。通過該種方式，利用免標(biāo)記無酶DNA機(jī)器的放大過程，釋 放的一條引發(fā)鏈可產(chǎn)生增強(qiáng)的巧光信號用于靈敏檢測UDG活性。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] (1)本發(fā)明的檢測方法設(shè)計(jì)中，用一個(gè)dsDNA探針進(jìn)行UDG的識別并伴隨引發(fā)鏈的 釋放，釋放的引發(fā)鏈可引發(fā)DNA機(jī)器的信號放大。所設(shè)計(jì)的包含尿喀晚堿基和引發(fā)序列的 dsDNA探針具有高的雜交效率，并對引發(fā)序列顯示出的好的抑制效果，導(dǎo)致低的背景信號。
[0026] (2)本發(fā)明采用免標(biāo)記的設(shè)計(jì)不需將巧光團(tuán)和巧滅團(tuán)共價(jià)結(jié)合到DNA上，減小了 標(biāo)記對背景的影響。
[0027] (3)本發(fā)明采用DNA機(jī)器的信號放大能力進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度，本發(fā)明的