專利名稱：含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程細(xì)胞株，具體是一種含有熒光素酶基因LUC的四膜蟲細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，更具體地說是一種含有四膜蟲偏愛密碼子的LUC的四膜蟲細(xì)胞株以及該細(xì)胞株對水體環(huán)境中重金屬污染的監(jiān)測。
背景技術(shù)：
環(huán)境污染問題是目前全球最嚴(yán)重的問題之一，目前在實(shí)際應(yīng)用中最常用的監(jiān)測手段是利用儀器對環(huán)境中重金屬進(jìn)行理化監(jiān)測，但監(jiān)測過程需要明確污染物成分，而且監(jiān)測結(jié)果不能反映一些關(guān)鍵參數(shù)如生物利用度、毒性及遺傳毒性等，使得檢測目標(biāo)局限性和檢測結(jié)果片面性，隨著研究人員對模式生物的深入研究，提出了全細(xì)胞生物傳感器(WCB)的概念，即用整個原核或真核細(xì)胞作為一個報(bào)告體，包括生物受體和生物轉(zhuǎn)換器兩種元件。纖毛類原生動物四膜蟲傳承了細(xì)菌和酵母等生物用于全細(xì)胞生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)外，由于它在營養(yǎng)期沒有細(xì)胞壁，且通過胞吞和吞噬作用可以更敏感的接觸水環(huán)境中的應(yīng)激物，從而可以產(chǎn)生快速應(yīng)答；另外由于與細(xì)菌和酵母等相比在基因水平上，四膜蟲與人類基因的同源性更高，因此可以在環(huán)境毒性試驗(yàn)中作為模式生物替代動物試驗(yàn)。四膜蟲金屬硫蛋白(MTTl)啟動子能夠被多種重金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)，因此能夠作為潛在的環(huán)境污染物應(yīng)答元件。通過基因重組將GFP基因原位取代部分MTTl基因，在生長環(huán)境中含有重金屬等應(yīng)激因素時(shí)，細(xì)胞能夠發(fā)出綠色熒光。但不能夠定量檢測環(huán)境中的污染指數(shù)。通過重組將螢火蟲熒光素酶基因原位取代BTU2基因，在生長環(huán)境中含有重金屬等應(yīng)激因素時(shí)，細(xì)胞能夠定量檢測環(huán)境中的污染指數(shù)，但是由于細(xì)胞內(nèi)的金屬硫蛋白對重金屬的螯合作用，使得工程細(xì)胞的敏感性降低。如何使檢測更快速、更敏感是四膜蟲細(xì)胞株用于環(huán)境中重金屬的生物監(jiān)測所面臨的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過將熒光素酶基因取代MTTl基因，一方面削弱了 MTTl原本的解毒反應(yīng)，使得重組細(xì)胞株更加敏感。另一方面，熒光素酶與底物顯色反應(yīng)可以通過熒光儀定量檢測環(huán)境中的重金屬污染。目前，國內(nèi)外已經(jīng)有將細(xì)菌、酵母以及四膜蟲構(gòu)建的全細(xì)胞生物傳感器用于水環(huán)境生物監(jiān)測中的報(bào)道，但本發(fā)明構(gòu)建的含有突光素酶的四膜蟲細(xì)胞株還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有熒光素酶基因的可誘導(dǎo)表達(dá)的四膜蟲細(xì)胞株；并提供一種構(gòu)建該四膜蟲細(xì)胞株的方法；以及該細(xì)胞株在檢測水體環(huán)境中重金屬污染方面的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種熒光素酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明提供的一種含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株，分類命名嗜熱四膜蟲，拉丁文學(xué)名Tetrahymena thermophila,已于2012年5月17日保藏在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCC No. 6139。
本發(fā)明含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟(I)利用四膜蟲偏愛密碼子表將核苷酸序列為SEQ ID NO : I的螢火蟲熒光素酶基因的N-端和C-端序列優(yōu)化為能在四膜蟲中高效穩(wěn)定表達(dá)的密碼子，并在序列的N-端加上BamH I酶切位點(diǎn)，在C-端加上Asc I酶切位點(diǎn)，合成特異性引物上游 j’-ggatcc agt gaa gac gcc aaa aac ate aag aaa ggc ccc get cct ttctat ccg c_3’ (SEQ ID NO :3)下游5’ -ggcgcgcc tea gac ggc get ctt acc acc ctt ctt ggc ctt gat gaggat-3，(SEQ ID NO :4)經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶基因LUCJf LUC基因連接到過表達(dá)載體PBX中，獲得重組質(zhì)粒pBX-LUC ；(2)將重組質(zhì)粒pBX-LUC純化、濃縮并由Xho I酶切線性化后，應(yīng)用基因槍粒子轟擊法轉(zhuǎn)入饑餓18-24h的對數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲B2086中進(jìn)行基因重組，通過增加巴龍霉素濃度篩選含有螢火蟲熒光素酶基因的重組嗜熱四膜蟲細(xì)胞株；(3)在細(xì)胞株可生長的最大濃度巴龍霉素條件下，吸取單細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，獲得大量細(xì)胞株B2086-LUC，并將其凍存在液氮中。該細(xì)胞株在生長的環(huán)境中存在重金屬污染時(shí)，誘導(dǎo)MTTl基因的啟動子啟動螢火蟲熒光素酶的表達(dá)，熒光素酶能夠和底物反應(yīng)，快速顯色，檢測過程簡單快速。檢測實(shí)驗(yàn)使用不同濃度的重金屬(如Cd2+)誘導(dǎo)饑餓的生長到對數(shù)生長期的四膜蟲3h，計(jì)數(shù)后最終取2*105個細(xì)胞，用于熒光檢測，記錄數(shù)據(jù)，并構(gòu)建劑量構(gòu)效關(guān)系，陽性對照為B2086-LUC在正常條件下的熒光信號，陰性對照為最大誘導(dǎo)濃度誘導(dǎo)B2086后的熒光值，每組三個平行。本發(fā)明所提供的含有螢火蟲熒光素酶基因的基因工程化四膜蟲細(xì)胞株可以用于應(yīng)答環(huán)境中多種對細(xì)胞有毒性的重金素污染，反應(yīng)快速，且檢測易操作，從而可以作為水體環(huán)境中重金屬污染物的一種生物監(jiān)測手段。


圖I重組質(zhì)粒pBX-LUC的鑒定。圖2重組質(zhì)粒pBX-LUC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株的鑒定。圖4 Cd2+誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一Cd2+濃度關(guān)系圖。圖5 Hg2+誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一Hg2+濃度關(guān)系圖。圖6 Cu2+誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一Cu2+濃度關(guān)系圖。圖7 Zn2+誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一Zn2+濃度關(guān)系圖。圖8 Pb2+誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一Pb2+濃度關(guān)系圖。圖9 SDBS誘導(dǎo)LUC表達(dá)后熒光值變化倍數(shù)一SDBS濃度關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I熒光素酶LUC基因的擴(kuò)增和中間質(zhì)粒pBX-LUC的構(gòu)建及鑒定設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法在螢火蟲熒光素酶基因兩端加上BamH I和Asc I酶切位點(diǎn)，并根據(jù)四膜蟲偏愛密碼子表將LUC基因的N-端和C-端序列優(yōu)化為可在四膜蟲中高效表達(dá)的密碼子，回收PCR產(chǎn)物并將其與載體pEASY-Tl按照合適比例混合，25°C連接20min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a大量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒pEASY-Tl-LUC并進(jìn)行酶切鑒定。分別對pEASY-Tl-LUC和中間質(zhì)粒pBX進(jìn)行BamH I酶切和Asc I酶切，酶切產(chǎn)物回收，將酶切后的LUC和載體，按比例混合，用T4連接酶16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，涂含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，純化質(zhì)粒做BamH I和Xho I酶切鑒定(圖1)，Mr為λ-EcoTHIdigest, pBX-LUC酶切后的片段分別為7kb和2. 2kb。實(shí)施例2含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定構(gòu)建好的中間載體用Xho I酶切線性化，并用乙醇純化濃縮后，包裹在金顆粒上，通過基因槍粒子轟擊法轉(zhuǎn)化入饑餓18-24h的四膜蟲B2086中，4h后加入巴龍霉素(終濃度為100ug/ml)和CdCl2 (終濃度為O. 5ug/ml)，分裝到96孔板中，30°C恒溫培養(yǎng)3天后，逐步增加巴龍霉素濃度篩選重組四膜蟲B2086-LUC，其原理為基因重組過程(圖2)，最后將重組四膜蟲B2086-LUC擴(kuò)大培養(yǎng)，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(圖3XM :DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1 :以重組四膜蟲B2086-LUC基因組為模板檢測到LUC基因和MTTI基因的PCR產(chǎn)物，分別1900bp和700bp ；2 :非正確重組四膜蟲基因組為模板只檢測到MTTl基因的PCR產(chǎn)物，700bp ；3 :以WT-B2086基因組為模板檢測到MTTl基因的PCR產(chǎn)物，700bp。實(shí)施例3含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株B2086-LUC的擴(kuò)大培養(yǎng)和保藏在顯微鏡下吸取重組四膜蟲的單細(xì)胞逐步進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得大量的同型重組細(xì)胞株B2086-LUC，并將其凍存在液氮中。實(shí)施例4含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株用于水體污染檢測的實(shí)驗(yàn)(I)培養(yǎng) 50ml/ 瓶(250ml 三角瓶)WT_B2086 和 B2086-LUC 到對數(shù)生長期(2-5 X IO5個/ml);饑餓后立即分裝5ml/管(IOml試管)，加入受測樣品誘導(dǎo)3h ;取樣記數(shù)三次取平均值；根據(jù)記數(shù)值，取2*105個細(xì)胞于滅菌后的EP管中，平行對照3組；離心后，棄盡上清，加入200ul裂解液，重懸混勻(_20°C暫存)；取IOOul樣品于新的EP管中，同時(shí)加入IOOul螢火蟲熒光素酶底物，檢測并記錄熒光值；數(shù)據(jù)分析。(2)饑餓條件為將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到滅菌后的50ml離心管內(nèi)，3500rpm離心5min，輕輕的棄去上清，用50ml PH7. 4的Tris · HCl洗滌沉淀后，離心棄去上清，然后將細(xì)胞重懸于50ml 的 PH7. 4 的 Tris · HCl 中。(3)受試樣品分別為 CdCl2 濃度為0,0. 001,0. 005,0.01,0. 05,0. 1,0. 5μ g/ml ；HgSO4 的濃度為0，0· 0005，O. 001，O. 01，O. 05，O. 1,0. 2 μ g/ml ;CuCl2 濃度為0，0· 25,1,I. 25, 2, 2. 5, 5mg/ml ；ZnSO4 濃度為0,0. 25,1,1. 25, 2, 2. 5, 5mg/ml ；PbCl2 濃度為:0,1,5,10，25，50，75 μ g/ml ；SDBS 的濃度為0，5，10，20，30，40，50 μ g/ml。(4)螢火蟲熒光素酶檢測試劑盒E1500購于Promega公司，檢測熒光的儀器GloMax 20/20Luminometer 購于 Promega 公司。(5)數(shù)據(jù)處理受試樣品三次計(jì)數(shù)取平均值，計(jì)算樣品組與對照組熒光值的倍數(shù)關(guān)系，并繪制熒光值變化倍數(shù)一受試樣品濃度關(guān)系圖(圖4-圖9)。
權(quán)利要求
1.一種熒光素酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
2.一種含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株，其保藏號為=CGMCC No. 6139。
3.如權(quán)利要求2所述的一種含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)利用四膜蟲偏愛密碼子表將核苷酸序列為SEQID NO :I的螢火蟲熒光素酶基因的N-端和C-端序列優(yōu)化為能在四膜蟲中高效穩(wěn)定表達(dá)的密碼子，并在序列的N-端加上BamHI酶切位點(diǎn)，在C-端加上Asc I酶切位點(diǎn)，合成特異性引物上游 f-ggatcc agt gaa gac gcc aaa aac ate aag aaa ggc ccc get cct ttc tatccg c_3’下游5’ -ggcgcgcc tea gac ggc get ctt acc acc ctt ctt ggc ctt gat gag gat_3’ 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得優(yōu)化的螢火蟲熒光素酶基因LUCJf LUC基因連接到過表達(dá)載體pBX中，獲得重組質(zhì)粒pBX-LUC ； (2)將重組質(zhì)粒pBX-LUC純化、濃縮并由XhoI酶切線性化后，應(yīng)用基因槍粒子轟擊法轉(zhuǎn)入饑餓18-24h的對數(shù)生長期的嗜熱四膜蟲B2086中進(jìn)行基因重組，通過增加巴龍霉素濃度篩選含有螢火蟲熒光素酶基因的重組嗜熱四膜蟲細(xì)胞株； (3)在細(xì)胞株可生長的最大濃度巴龍霉素條件下，吸取單細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，獲得大量細(xì)胞株B2086-LUC，并將其凍存在液氮中。
4.如權(quán)利要求2所述的含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株在檢測水體環(huán)境重金屬污染中的應(yīng)用。
全文摘要
含有熒光素酶基因的四膜蟲細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。通過PCR技術(shù)將螢火蟲熒光素酶基因的N-端和C-端序列優(yōu)化為四膜蟲偏愛密碼子，將優(yōu)化后的螢火蟲熒光素酶基因LUC連接到載體pBX中，獲得含有該基因的重組質(zhì)粒pBX-LUC，通過基因槍粒子轟擊法將其轉(zhuǎn)化入嗜熱四膜蟲B2086細(xì)胞內(nèi)，通過細(xì)胞內(nèi)同源重組和巴龍霉素抗性篩選,細(xì)胞中MTT1基因被LUC基因所取代，獲得工程化細(xì)胞株B2086-LUC。工程化細(xì)胞株B2086-LUC在特異的重金屬誘導(dǎo)下表達(dá)熒光素酶，通過加入熒光底物D-Luciferin顯色，檢測放大熒光強(qiáng)度，進(jìn)而通過定量的數(shù)據(jù)來反應(yīng)環(huán)境中重金屬污染物的情況，檢測方法快速、靈敏、易操作。其在水體環(huán)境重金屬污染生物監(jiān)測中有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/53GK102925464SQ20121018577
公開日2013年2月13日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者王偉, 張鵬幸, 許靜, 梁愛華 申請人:山西大學(xué)