專利名稱：由萬能干細(xì)胞所分化的神經(jīng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法及其使用的培養(yǎng)基，特別是指一種由萬能干細(xì)胞所分化的神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法及其所使用的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是指尚未完全分化，而具有自我更新能力，并可分化成兩種以上成熟細(xì)胞的原始細(xì)胞。以分化能力將干細(xì)胞分類，可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、萬能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、多能干細(xì)胞(multipotent stem cell)及雙能細(xì)胞(bipotent stem cell);另依干細(xì)胞來源區(qū)分，則可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stemcell)、成體干細(xì)胞(somatic stem cell)及誘導(dǎo)型萬能干細(xì)胞(induced pluripotentstem cell ；iPSC)0其中，人類胚胎干細(xì)胞屬于萬能干細(xì)胞，來自于未著床前囊胚時(shí)期的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)塊，具有萬能性而可分化為各種成體細(xì)胞；另外，誘導(dǎo)型萬能干細(xì)胞則以強(qiáng)制表達(dá)(enforced expression)操作的方式,將特定基因或蛋白質(zhì)導(dǎo)入已分化的體細(xì)胞,使該體細(xì)胞被重新程式化(reprogrammed)而成為類似胚胎干細(xì)胞。由于干細(xì)胞具有細(xì)胞分裂、再生更新的能力，也可被誘導(dǎo)分化成為特定組織，因此，目前許多研究學(xué)者致力于干細(xì)胞分化的研究，希望干細(xì)胞分化成為特定細(xì)胞或是組織器官后，能夠具有用于人類疾病治療或再生醫(yī)學(xué)等的用途，例如:可將分化培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元用以治療帕金森氏癥、分化后的器官用于器官損傷的病人。尤其是針對(duì)神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)損傷及神經(jīng)退化性疾病、或是相關(guān)藥物篩檢等生物醫(yī)學(xué)研究，更是需要借由經(jīng)干細(xì)胞分化后的神經(jīng)細(xì)胞來進(jìn)行。然而成熟的神經(jīng)細(xì)胞來自于神經(jīng)上皮細(xì)胞，因此，如何獲得大量且高純度的神經(jīng)上皮細(xì)胞就顯得非常重要。許多研究學(xué)者于胚胎干細(xì)胞分化初期利用加入纖維細(xì)胞生長因子-2 (FGF2) (Li, X.J.et al., 2005 ；Timothy et al., 2009 ；Xu et al., 2005 ；Vallier, L.et al.，2005)，以懸浮培養(yǎng)方式進(jìn)行誘導(dǎo)神經(jīng)分化，該種分化方法雖可獲得具有類神經(jīng)管表現(xiàn)的神經(jīng)上皮細(xì)胞，然所需分化時(shí)間約需十四天以上，分化出來的細(xì)胞于貼附過程還夾雜有眾多非神經(jīng)細(xì)胞，需以酵素及人力操作于顯微鏡下將神經(jīng)上皮細(xì)胞挑出，才可獲得高純度的神經(jīng)細(xì)胞。另有學(xué)者于干細(xì)胞分化過程加入兩種smad抑制劑(smad inhibitors)(Elkabetz et al., 2008 ；Lee et al., 2007 ；Chambers et al., 2009),包括 Noggin 和SB431542，用以縮短神經(jīng)分化時(shí)間；也有學(xué)者利用基因操作誘導(dǎo)分化或是利用其他細(xì)胞共同培養(yǎng)誘導(dǎo)分化等(Pankratz et al.，2007 !Chambers et al.，2009),然而上述方法雖可得到神經(jīng)上皮細(xì)胞，但仍無法使大部分的胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞，并且具有生產(chǎn)成本昂貴、利用病毒進(jìn)行基因操作的安全疑慮及與其他細(xì)胞共同培養(yǎng)的不確定因素等缺點(diǎn)。此外，倘若所生產(chǎn)的神經(jīng)上皮細(xì)胞夾雜有其他非神經(jīng)細(xì)胞或未分化細(xì)胞等，可能會(huì)影響后續(xù)神經(jīng)的分化，且此未分化萬能干細(xì)胞移植入動(dòng)物體內(nèi)也可能變成畸胎瘤。因此，有效率分化出高純度并表現(xiàn)大部分神經(jīng)標(biāo)記的神經(jīng)上皮細(xì)胞，未來將有助于成熟神經(jīng)細(xì)胞的分化，而提升臨床運(yùn)用的可靠性及減少使用的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的，在于提供一種將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法。 本發(fā)明的另一目的，在于提供一種神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其含有Wnt信號(hào)激動(dòng)劑(ffnt-signal agonist)、轉(zhuǎn)化生長因子 β 信號(hào)抑制劑(TGF β-signal inhibitor)及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑(FGF-signal agonist)，用以使干細(xì)胞得以分化出高純度的神經(jīng)上皮細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:一種神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，它包含有Wnt信號(hào)激動(dòng)劑(Wnt-signal agonist)、轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑(FGF-signal agonist)。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述fct信號(hào)激動(dòng)劑選自Wntligands和月干醣合成酶激酶_3β抑制劑(glycogen synthase kinase 3 β inhibitor)如藥物Bio(6-bromoindirubin_3’ -oxime)中的一種或多種。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述Wnt信號(hào)激動(dòng)劑為濃度介于0.05 μ M(即 0.05 μ mol/L,下同)至 50 μ M 間的藥物 Bio (6_bromoindirubin_3’ -oxime)。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin 蛋白質(zhì)、noggin 蛋白質(zhì)、dorsomorphin 蛋白質(zhì)、Smadl 抑制劑(Smadl inhibitor)>Activin/Nodal 受體抑制劑藥物如SB431542、及Smad2/3抑制劑(Smad2/3_inhibitor)中的一種或多種。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑為濃度介于I μ M 至 100 μ M 間的藥物 SB431542。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑選自纖維母細(xì)胞生長因子2 (FGF2)、纖維母細(xì)胞生長因子受體的配體(ligand)、活化胞外信號(hào)調(diào)控激酶(extracellular signal-related kinases ;ERK)的促進(jìn)劑、活化 c_jun N 端蛋白質(zhì)激酶(c-jun N-terminal kinase kinase ;JNK)的促進(jìn)劑及活化磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinosital_3kinase ；PI3K)的促進(jìn)劑中的一種或多種。如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑為濃度介于Ing/mL至100ng/mL間的纖維母細(xì)胞生長因子2 (FGF2)。一種如上所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的用途，是將該培養(yǎng)基用于將萬能干細(xì)胞培養(yǎng)分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞。一種將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，它包含有下列步驟:步驟a:將萬能干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成類胚體(embryoid body)；步驟b:將該類胚體培養(yǎng)于第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞；其特征在于:所述第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基選自如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。如上所述的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，優(yōu)選地，所述方法還包含有一步驟C，將所述第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為第二神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使該被培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞。如上所述的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，優(yōu)選地，所述第二神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基至少由神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、N2神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑、非必須胺基酸及肝素所組成。如上所述的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，優(yōu)選地，所述步驟a的萬能干細(xì)胞為人類的胚胎干細(xì)胞株及誘導(dǎo)型萬能干細(xì)胞中的一種或多種。本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，使用添加有fct信號(hào)激動(dòng)劑、轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑的該神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，不僅可縮短萬能干細(xì)胞分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化時(shí)間，還可獲得高純度的神經(jīng)上皮細(xì)胞而可高度表現(xiàn)神經(jīng)標(biāo)記，借此，可將該神經(jīng)上皮細(xì)胞于臨床上進(jìn)一步分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞而應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、篩選神經(jīng)疾病藥物等。


圖1A至C為人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)于無喂養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境下的mTESRl培養(yǎng)基中的生長形態(tài)圖。圖2為分化過程中 加入藥物Bio、藥物SB431542及纖維母細(xì)胞生長因子2的第一
神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3A為以顯微鏡倍率為100倍的顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3B為以顯微鏡倍率為200倍的顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)圖。圖3C為以顯微鏡倍率為400倍的顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)圖。圖4A為將分化后的神經(jīng)上皮細(xì)胞貼附后神經(jīng)管狀細(xì)胞呈現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)圖。圖4B為圖4A培養(yǎng)兩天后細(xì)胞伸展的形態(tài)圖。圖5A_la及圖5A_lb為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體0ct4表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5A_2a及圖5A_2b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Sox2表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5A_3a及圖5A_3b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Nanog表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5A_4a及圖5A_4b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Zo-1表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5A-5為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Nestin表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5B_la及圖5B_lb為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Soxl表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5B_2a及圖5B_2b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Pax6表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5B_3a及圖5B_3b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體Zicl表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5B_4a及圖5B_4b為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體N_cadherin表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖5C-1及圖5C-2為神經(jīng)上皮細(xì)胞以一級(jí)抗體BFl表現(xiàn)的免疫熒光表現(xiàn)圖。圖為神經(jīng)上皮細(xì)胞經(jīng)貼附后以一級(jí)抗體Tujl表現(xiàn)神經(jīng)軸突的免疫熒光表現(xiàn)圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種將萬多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，其是取一萬多能干細(xì)胞而將之聚集成為類胚體，再利用包含有fct信號(hào)激動(dòng)劑、轉(zhuǎn)化生長因子β信號(hào)抑制劑及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，作用于該萬多能干細(xì)胞，使該萬多能干細(xì)胞分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞。借由本發(fā)明所提供的將萬多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法及所使用的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，可使超過90%的未分化萬多能干細(xì)胞于一周內(nèi)成功地分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞，并可高度表達(dá)神經(jīng)標(biāo)記與前腦標(biāo)記分子。關(guān)于本發(fā)明專利申請(qǐng)所使用的名詞，其核心含義如下所述，但其含義的范圍并不為此所限:萬多能干細(xì)胞:包含有哺乳類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞、經(jīng)由基因或蛋白質(zhì)的外來表現(xiàn)而形成的誘導(dǎo)性萬多能干細(xì)胞或是其他具有分化為所有體細(xì)胞特性的萬多能型細(xì)胞。于以下實(shí)施例中所使用的萬多能干細(xì)胞為人類胚胎干細(xì)胞TWl (由李茂盛婦產(chǎn)科診所提供；En-Hui Cheng et al，2008)，如圖1A至C所示，其是由人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)于無喂養(yǎng)細(xì)胞(non-feeder cells)環(huán)境下的mTESRl培養(yǎng)基中的生長形態(tài)圖。神經(jīng)標(biāo)記:如Nestin、Soxl、Pax6、Zic-1和N-cadherin等基因，在神經(jīng)上皮細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)，因此，通過分析該神經(jīng)標(biāo)記即可鑒定萬多能干細(xì)胞是否已經(jīng)分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞。前腦標(biāo)記分子:如腦因子I (brain factor I ;BF1),表達(dá)于神經(jīng)前腦細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，因此，通過分析該前腦標(biāo)記分子是否表達(dá)，用以鑒定萬多能干細(xì)胞是否以分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞。 胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子:如0ct4及nanog等轉(zhuǎn)錄因子，于胚肽干細(xì)胞中大量表達(dá)，因此，借由分析胚胎干細(xì)胞標(biāo)記分子的表達(dá)，可用以鑒定萬多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞的效率。神經(jīng)上皮細(xì)胞:其細(xì)胞呈球型結(jié)構(gòu)，而邊緣逐漸成管狀緊密規(guī)則排列結(jié)構(gòu)，排列如花瓣?duì)?，又稱 neural rossettes。Wnt信號(hào)激動(dòng)劑:可為一種肝醣合成酶激酶-3 β的抑制劑，穩(wěn)定β _連結(jié)蛋白質(zhì)(β-catenin),包括:Wntl、Wnt3a、肝醣合成酶激酶-3 β抑制劑如藥物Bio。其中，下列實(shí)施例中所使用的fct信號(hào)激動(dòng)劑為藥物Bio，其化學(xué)式為C16H10BrN302，結(jié)構(gòu)式為
OC轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑:使胚胎干細(xì)胞減少自我更新的能力，使0ct4表現(xiàn)量降低，包括:骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitor)、chordin蛋白質(zhì)、noggin 蛋白質(zhì)、dorsomorphin 蛋白質(zhì)、Smadl 抑制齊[J(Smadl inhibitor)、Activin/Nodal受體抑制劑藥物如SB431542，或Smad2/3抑制劑(Smad2/3-1nhibitoiO。其中，下列實(shí)施例中所使用的轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑為藥物SB431542，化學(xué)式為:C22-H16-N4_03，結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，它包含有fct信號(hào)激動(dòng)劑、轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述fct信號(hào)激動(dòng)劑選自Wntligands和肝醣合成酶激酶_3 β抑制劑中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求1或2所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述Wnt信號(hào)激動(dòng)劑為濃度介于0.05 μ M至50 μ M間的藥物Bio。
4.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑選自骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)抑制劑、chordin蛋白質(zhì)、noggin蛋白質(zhì)、dorsomorphin蛋白質(zhì)、Smadl抑制劑、Activin/Nodal受體抑制劑藥物及Smad2/3抑制劑中的一種或多種。
5.如權(quán)利要求1或4所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑為濃度介于I μ M至100 μ M間的藥物SB431542。
6.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑選自纖維母細(xì)胞生長因子2、纖維母細(xì)胞生長因子受體的配體、活化胞外信號(hào)調(diào)控激酶的促進(jìn)劑、活化c-jun N端蛋白質(zhì)激酶的促進(jìn)劑及活化磷脂酰肌醇3激酶的促進(jìn)劑中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1或6所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，所述纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑為濃度介于Ing/mL至lOOng/mL間的纖維母細(xì)胞生長因子2。
8.—種如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的用途，其特征在于，其是將該培養(yǎng)基用于將萬能干細(xì)胞培養(yǎng)分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞。
9.一種將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，它包含有下列步驟: 步驟a:將萬能干細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成類胚體； 步驟b:將該類胚體培養(yǎng)于第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分化形成神經(jīng)上皮細(xì)胞； 其特征在于: 所述第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基選自如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
10.如權(quán)利要求9所述的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，其特征在于，所述方法還包含有一步驟C，將所述第一神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為第二神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，使該被培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求9所述的將多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，其特征在于，所述第二神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基至少由神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基、N2神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑、非必須胺基酸及肝素所組成。
12.如權(quán)利要求9、10或11所述的將萬能干細(xì)胞分化成神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化方法，其特征在于，所述步驟a的萬能干細(xì)胞為人類的胚胎干細(xì)胞株及誘導(dǎo)型萬能干細(xì)胞中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，它包含有Wnt信號(hào)激動(dòng)劑(Wnt-signal agonist)、轉(zhuǎn)化因子β信號(hào)抑制劑(TGFβ-signal inhibitor)及纖維母細(xì)胞生長因子信號(hào)激動(dòng)劑(FGF-signal agonist)。使用該神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)萬能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，不僅可縮短萬能干細(xì)胞分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞的分化時(shí)間，還可獲得高純度的神經(jīng)上皮細(xì)胞而可高度表現(xiàn)神經(jīng)標(biāo)記，借此，可將該神經(jīng)上皮細(xì)胞于臨床上進(jìn)一步分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞而應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)、篩選神經(jīng)疾病藥物等。
文檔編號(hào)C12N5/079GK103160466SQ20121018553
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者蘇鴻麟, 陳圣美 申請(qǐng)人:中興大學(xué)