一種β-氨基己糖苷酶A酶活性檢測(cè)方法、底物和試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種β-氨基己糖苷酶A（EC3.2.1.52）酶活力檢測(cè)的方法，同時(shí)本發(fā)明還提供了測(cè)定β-氨基己糖苷酶A酶活性的底物和試劑，上述方法、底物和試劑可用于分析測(cè)定待測(cè)樣本（包括人體體液或組織或細(xì)胞樣本）中的β-氨基己糖苷酶A活力，主要應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域。采用本方法制備的測(cè)定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種β -氨基己糖苷酶A酶活性檢測(cè)方法、底物和試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，同時(shí)又屬于遺傳代謝病的臨床診斷檢測(cè)領(lǐng)域。具體而言本發(fā)明提供了一種測(cè)定氨基己糖苷酶A ( β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的方法，同時(shí)本發(fā)明還提供了一種作為β-氨基己糖苷酶A ( β -HexosaminidaseA, EC 3.2.1.52)的酶活性檢測(cè)的底物，此外本發(fā)明還提供了測(cè)定β-氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活性的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]溶酶體是人體細(xì)胞內(nèi)一種由單位膜包裹的細(xì)胞器，內(nèi)部含有多種酸性水解酶，目前已發(fā)現(xiàn)的有60多種，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂酶、磷酸酶、溶菌酶等酶類。在細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶控制著多種內(nèi)源性和外源性大分子物質(zhì)的消化，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及糖原等，因此，溶酶體又被稱為細(xì)胞內(nèi)的消化器官。人體每天的新陳代謝會(huì)產(chǎn)生許多人體不需要的大分子物質(zhì)，如鞘脂、糖蛋白、粘脂、黏多糖、寡糖、糖原等，這些大分子物質(zhì)需經(jīng)過(guò)溶酶體酶處理后水解成小分子物質(zhì)方能繼續(xù)參與機(jī)體代謝或排出體外。如果溶酶體內(nèi)某種水解酶的活性降低或缺失將會(huì)導(dǎo)致特定的生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積，從而使得溶酶體發(fā)生腫脹，細(xì)胞變得臃腫失常，細(xì)胞功能受到嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致一系列疾病，這類疾病統(tǒng)稱為溶酶體忙積癥(Lysosomal Storage Diseases,簡(jiǎn)稱LSDs)。依忙積的大分子物質(zhì)種類差異將溶酶體貯積癥分成以下幾種主要類型:黏多糖貯積癥、糖原累積病II型、黏脂質(zhì)貯積病、神經(jīng)鞘脂貯積病、糖蛋白貯積癥等。
[0003]據(jù)歐美國(guó)家初步統(tǒng)計(jì)資料表明，溶酶體貯積癥作為一個(gè)整體，在新生兒中患病率可聞達(dá)1/8，000~1/5，OOO0目如在中國(guó)尚未進(jìn)彳丁篩查統(tǒng)計(jì)，但隨著生化檢測(cè)技術(shù)的提聞，國(guó)內(nèi)溶酶體貯積癥的檢出率明顯提高，且呈逐步上升趨勢(shì)。
[0004]Tay-Sachs病是一`種常染色體隱性遺傳性疾病，又稱為B型GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積病，屬于神經(jīng)鞘脂貯積病的一種，是由于己糖胺酶a鏈缺陷、GM2在神經(jīng)元累積所導(dǎo)致，導(dǎo)致GM2神經(jīng)節(jié)苷脂分解代謝異常，而在體內(nèi)(腦、眼、肝、脾和骨髓)中累積，影響細(xì)胞功能。
[0005]根據(jù)起病年齡和臨床表現(xiàn)可分為嬰兒型、晚發(fā)嬰兒型和晚發(fā)(兒童、青春期、成人)型二種。
[0006]本病可見(jiàn)于世界上任何種族，但發(fā)病率不同。西亞和東歐的猶太人發(fā)病率最高，幾乎比其他民族高100倍。國(guó)內(nèi)尚無(wú)Tay-Sachs病的流行病學(xué)資料，但隨著生化檢測(cè)技術(shù)的提高，Tay-Sachs病的檢出率明顯提高。
[0007]Tay-Sachs病確診困難表現(xiàn)在多方面:首先因該病是多系統(tǒng)疾病，涉及遺傳、神經(jīng)、肌肉、血液、骨骼、眼睛等器官或系統(tǒng)，癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，并且與多種常見(jiàn)疾病有相似的臨床表現(xiàn)，因此醫(yī)生很難從癥狀表現(xiàn)上積累診斷經(jīng)驗(yàn)，因此漏診、誤診及延誤診斷的發(fā)生是普遍存在的問(wèn)題。其次醫(yī)院現(xiàn)有的各項(xiàng)常規(guī)檢查等輔助手段均難以達(dá)到確診的目的，如骨髓穿刺、體格檢查、心電圖、腦電圖、B超、CT/核磁、X線、肌肉活檢、血清肌酸磷酸激酶檢查等諸多檢查方法均無(wú)法對(duì)Tay-Sachs病的真正致病因素加以分析，因此不能對(duì)患者疾病作出準(zhǔn)確診斷?；驒z測(cè)困難重重，因單核苷酸序列多態(tài)性的存在，可能某些突變就是正常的，不會(huì)引發(fā)疾病，因此給分析帶來(lái)不確定性；另外由于酶的活性還與其他一些參與酶功能的基因有關(guān)，有很多這類基因目前還未被研究人員發(fā)現(xiàn)，因此基因檢測(cè)同樣不能作為診斷的可靠依據(jù)。
[0008]導(dǎo)致Tay-Sachs病產(chǎn)生的直接因素就是患者體內(nèi)單一 β -氨基己糖苷酶A酶活性降低或完全缺失，而且病情嚴(yán)重程度往往與酶活性殘留的比例密切相關(guān)，因此判斷患者β -氨基己糖苷酶A的活性是否正常，同時(shí)結(jié)合患者的臨床癥狀表現(xiàn)，就可以快速準(zhǔn)確地對(duì)病人的疾病作出診斷。因此β_氨基己糖苷酶A酶活性檢測(cè)作為Tay-Sachs病的診斷依據(jù)具有其他方法不能比擬的優(yōu)勢(shì)，臨床上通過(guò)對(duì)疑似Tay-Sachs病患者進(jìn)行β -氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療，對(duì)Tay-Sachs病預(yù)后，減少疾病給家庭及社會(huì)帶來(lái)的影響及隱患具有重要意義。國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)踐證明檢測(cè)β_氨基己糖苷酶A活性是輔助確診該病的最佳手段。本發(fā)明就是基于這些技術(shù)背景和社會(huì)現(xiàn)實(shí)需求，根據(jù)β_氨基己糖苷酶A的酶催化活性的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成含有熒光基團(tuán)的β_氨基己糖衍生物作為酶催化反應(yīng)的底物，從而可以快速靈敏的測(cè)定待測(cè)樣本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。待測(cè)樣本中的氨基己糖苷酶A可以將含熒光基團(tuán)的β-氨基己糖硫酸鹽水解后釋放出熒光分子和β-氨基己糖硫酸鹽，其水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，這樣就可以計(jì)算待測(cè)樣本中的β_氨基己糖苷酶A酶活力。采用本方法制備的測(cè)定試劑具有方便、快捷和高靈敏度的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種快速、準(zhǔn)確可靠的氨基己糖苷酶A(β -Hexosaminidase A, EC 3.2.1.52)酶活力的熒光檢測(cè)法，同時(shí)本發(fā)明還提供用于熒光法測(cè)定β -氨基己糖苷酶A活性的檢測(cè)試劑，采用該方法和試劑可以在半自動(dòng)或全自動(dòng)的熒光光度計(jì)或酶標(biāo)儀等熒光檢測(cè)設(shè)備上使用，而且檢測(cè)靈敏度高，特異性高，操作簡(jiǎn)便，因而可以得到切實(shí)的推廣使用。
[0010]為解決技術(shù)問(wèn)題 ，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明的β-氨基己糖苷酶A酶活性測(cè)定方法原理如下:
R-β-氨基己糖硫酸鹽+ H2O 3-観己糖苷酶aR-OH + β-氨基己糖硫酸鹽。
[0011]具體為:β -氨基己糖苷酶A在特定條件下能夠水解合成的本身無(wú)熒光的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，釋放游離的熒光分子R-0H，在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下可檢測(cè)到R-OH特異的熒光，由于β -氨基己糖苷酶A水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，因此檢測(cè)在特定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的R-OH熒光值，就可以計(jì)算出β -氨基己糖苷酶A的酶活力。
[0012]β -氨基己糖硫酸鹽(β-Hexosamine sulphate salt)通用的結(jié)構(gòu)式為:
【權(quán)利要求】
1.一種β-氨基己糖苷酶A酶活性測(cè)定方法，其特征在于它的原理如下: R- β -氨基己糖硫酸鹽+ H20g-氨基己糖苷酶A.R-OH + β -氨基己糖硫酸鹽。
2.具體為氨基己糖苷酶A在特定條件下能夠水解合成的本身無(wú)熒光的底物R- β -氨基己糖硫酸鹽，釋放游離的熒光分子R-0H，在特定的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下可檢測(cè)到R-OH特異的熒光，由于β -氨基己糖苷酶A水解底物的速率與釋放熒光分子的熒光強(qiáng)度成正比，因此檢測(cè)在特定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下的R-OH熒光值，就可以計(jì)算出β -氨基己糖苷酶A的酶活力。
3.如權(quán)利要求書I所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特征在于它的通用結(jié)構(gòu)式為:
4.當(dāng)β-氨基己糖苷酶A在特定條件下特異的水解R-β-氨基己糖硫酸鹽時(shí)又可以釋放出游離的具備熒光特征的R-OH分子。
5.如權(quán)利要求書I和2所述的底物R-β -氨基己糖硫酸鹽以及合成該底物的具備熒光特征的R-0H，其特征在于R-OH是在物理和化學(xué)領(lǐng)域普遍被接受的任何具備熒光特征且能與-CHO進(jìn)行反應(yīng)的分子。
6.如權(quán)利要求書1-3所述的底物R-β -氨基己糖硫酸鹽，其特征在于熒光分子R-OH是與β -氨基己糖硫酸鹽上的I位C上的醛基(-CHO)連接而形成R-β -氨基己糖硫酸鹽。
7.如權(quán)利要求書1-4所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特征在于硫酸基團(tuán)是處在β -氨基己糖硫酸鹽的3，4，6位C的任一位點(diǎn)上。
8.如權(quán)利要求書1-5所述的底物R-β-氨基己糖硫酸鹽，其特征在于氨基乙?；鶊F(tuán)是處在β -氨基己糖硫酸鹽的的2位C上形成R- β -氨基己糖硫酸鹽。
9.一種氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于其主要成分包括: 緩沖液20— 1000mmol/L pH 范圍2 — 8.5 穩(wěn)定劑0.01% —10%
如權(quán)利要求書1-6所述的底物(R-β -氨基己糖硫酸鹽)0.01一10mmol/L 根據(jù)權(quán)利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于:由緩沖液、穩(wěn)定劑、R- β -氨基己糖硫酸鹽組成單劑試劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于:由緩沖液、穩(wěn)定劑、R-β -氨基己糖硫酸鹽組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑組成；試劑2，由緩沖液、R- β -氨基己糖硫酸鹽組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于:由緩沖液、穩(wěn)定劑、R-β-氨基己糖硫酸鹽組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑組成；試劑2，由R- β -氨基己糖硫酸鹽組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于:所述的穩(wěn)定劑主要包括被物理和化學(xué)上普遍接受和使用的各種表面活性劑。
13.如權(quán)利要求7-10所述β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)試劑，其特征在于:所述的緩沖液中的緩沖試劑是被物理和化學(xué)上普遍接受的能將體系的PH值緩沖或穩(wěn)定在2—8.5的范圍中的試劑。
14.如權(quán)利要求書1-12所述的β-氨基己糖苷酶A活性檢測(cè)方法或試劑，其特征在于，它可以用于檢測(cè)待測(cè)樣本中的β_氨基己糖苷酶A的酶活力，特別是檢測(cè)人體體液或組織或細(xì)胞樣本中氨基己糖苷酶A的酶活力，應(yīng)用到臨床檢測(cè)或診斷與β-氨基己糖苷酶A的酶活力相關(guān)的疾病。
【文檔編號(hào)】C12Q1/34GK103484526SQ201210195944
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月14日
【發(fā)明者】孫宏博 申請(qǐng)人:北京和信非凡生物技術(shù)有限公司