專利名稱：腈水解酶、編碼腈水解酶的核酸,以及制備和使用它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的來說涉及分子生物學(xué)、生物化學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及具有腈水解酶(nitrilase)活性的酶蛋白(enzymatic proteins)。本發(fā)明也涉及編碼該酶的多核苷酸，涉及這些多核苷酸和酶的用途。
背景技術(shù)：
天然存在的酶在將腈轉(zhuǎn)化為大量有用的產(chǎn)品和中間產(chǎn)物的工業(yè)化學(xué)加工中具有極大應(yīng)用潛力。這樣的酶包括腈水解酶，該酶能將腈直接轉(zhuǎn)化為羧酸。腈水解酶存在于大范圍的嗜溫微生物中，包括如下種類芽孢桿菌(Bacillus)、諾卡氏菌(Norcardia)、Bacteridium、紅球菌屬(Rhodococcus);以及存在于包括如下物種的微生物中芽孢桿菌、Norcardia、Bacteridium、紅球菌屬(Rhodococcus)、微球菌(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、產(chǎn)喊桿菌(Alcaligenes)、不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)、棒狀桿菌(Corynebacterium)、鐮刀菌(Fusarium)和克雷伯氏菌(Klebsiella)。此外，還有存在于細(xì)菌中的嗜熱腈水解酶(thermophilic nitrilases)。從腈到類似酸有兩種主要途徑(I)腈水解酶催化腈直接水解為羧酸，同時(shí)伴隨著釋放氨；或者(2)腈水合酶通過碳氮鍵合體系添加水分子，以產(chǎn)生相應(yīng)的酰胺，然后該酰胺能作為酰胺酶的底物，該酶水解碳-氮鍵以產(chǎn)生羧酸產(chǎn)物，同時(shí)伴隨著釋放氨。因此，腈水解酶提供了產(chǎn)生酸的更直接途徑。腈基團(tuán)在合成途徑的設(shè)計(jì)中有很多優(yōu)點(diǎn)，它通常更容易被引入到分子結(jié)構(gòu)中，而且作為掩蔽酸或酰胺基團(tuán)，能被攜帶通過許多過程。然而，如果腈在合成中的相應(yīng)步驟能被去掉掩蔽，這是反而有用的。氰化物代表具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的C1-合成纖維(氰化物是少數(shù)幾個(gè)在水中穩(wěn)定的負(fù)碳離子之一)，它可以在碳骨架的合成中被使用。然而，由于使用正常化學(xué)合成程序需要苛刻的反應(yīng)條件來進(jìn)行腈的水解，所以如此得到的腈的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化受到了阻礙。使用酶來催化腈的反應(yīng)是很有吸引力的，這是因?yàn)殡嫠饷改芡瓿煞磻?yīng)，與許多傳統(tǒng)化學(xué)方法相比較，該反應(yīng)具有更少的對(duì)環(huán)境有害的試劑和副產(chǎn)物。實(shí)際上，腈的化學(xué)選擇性的生物催化水解代表一個(gè)有價(jià)值的選擇方案，原因在于它可以在室溫(ambienttemperature)和接近生理pH的條件下發(fā)生。藥物設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)中的不對(duì)稱有機(jī)合成的重要意義推動(dòng)了對(duì)新合成方法和手性前體(chiral precursors)的尋找,手性前體可以在具有生物學(xué)重要性的復(fù)雜分子開發(fā)中被使用。手性分子(chiral molecules)的一個(gè)重要種類是a-取代的羧酸，其包括a -氨基酸。這些分子長期以來已經(jīng)被公認(rèn)是多種復(fù)雜的具有生物活性的分子的重要的手性前體，大量研究努力已經(jīng)被投入到對(duì)映體純的a-氨基酸和手性藥物的合成方法的開發(fā)上。對(duì)于制造手性藥物的合成化學(xué)家來說，尤其有用的將是一種在未消毒條件下有用的酶系統(tǒng)，該系統(tǒng)在非生物實(shí)驗(yàn)室里有用，它可以以便于存儲(chǔ)和使 用的形式獲得；該系統(tǒng)具有廣泛的底物特異性，可以在水溶性極差的底物上發(fā)揮作用；該系統(tǒng)具有可預(yù)知的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)；該系統(tǒng)可以提供對(duì)酸或酰胺產(chǎn)物的選擇；并且該系統(tǒng)能夠手性區(qū)分(chiraldifferentiation)。因此,存在對(duì)于有效的、不昂貴的、高產(chǎn)量的合成方法的需求，該方法用于產(chǎn)生對(duì)映異構(gòu)體純的a-取代的羧酸，諸如，例如a-氨基酸和a-羥基酸。此外，通常可以通過利用一種簡便的高通量篩選或選擇方法來幫助發(fā)現(xiàn)或演變進(jìn)行特定轉(zhuǎn)化的酶。盡管在不能得到有效的超高通量(ultra high throughout, UHTP)篩選之時(shí)，可以使用一種替代底物，但直接篩選一種特定地進(jìn)行期望轉(zhuǎn)化的酶還是需要的。設(shè)計(jì)UHTP篩選的前景是顯然的，例如，當(dāng)發(fā)現(xiàn)或演變計(jì)劃的目的在于揭示立體選擇性轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生僅僅一種立體異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體時(shí)。在這種情況下，可以利用的高通量篩選方法是極其缺乏的。盡管最簡單的方法是使用手性液相或氣相分離法來分離兩種正在討論的對(duì)映異構(gòu)體，但該方法通常不能提供所要求的極高通量容量。通過使用質(zhì)譜學(xué)(MS)技術(shù)，極高通量篩選是可能的。然而，當(dāng)以傳統(tǒng)方式應(yīng)用時(shí)，MS不能提供有關(guān)手性或?qū)τ丑w選擇性的信肩、O另一種方法是用一種單一對(duì)映異構(gòu)體化合物化學(xué)方法衍生對(duì)映異構(gòu)混合物，從而產(chǎn)生化合物的非對(duì)映體混合物，該混合物能在非手性固定相上分離的。而且，這是一種很麻煩的方法，不能很好地參與高通量篩選。在整個(gè)申請(qǐng)中，作者參考了各種公開文獻(xiàn)并且注明了日期。此處將這些公開文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整地引入本申請(qǐng)中，以便完整地描述本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的現(xiàn)有技術(shù)的狀況，其中現(xiàn)有技術(shù)至所描述的和所要求的本發(fā)明的日期為止。
發(fā)明概述本發(fā)明關(guān)于一種分離核酸或重組核酸，包括核苷酸，具有一個(gè)與如下序列至少有大約 50% 相同的序列，如下序列為 SEQ ID NO :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，109，111,113,115,117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229,231,233,235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271，273，275,277,279,281,283,285,287,289,291,293,295,297,299,301,303,305,307,309,311,313，315，317，319，321，323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385，或其變體，其中核酸編碼具有腈水解酶活性的多肽。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，核酸包括核苷酸，具有一個(gè)與SEQ ID NO :或其變體具有至少大約50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %,72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %,87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高，或完全同一性(100%相同)的序列。例證性的變體可能包括，例如，SEQ ID NO =195,205,207,209或237的下述變體，在如下位點(diǎn)具有一個(gè)或更多突變位點(diǎn)163-165AAA，AAG，GGT，GGC，GGA，GGG, CAA 或 CAG ;位點(diǎn) 178-180GAA 或 GAG ;位點(diǎn) 331-333TCT，TCC, TCA, TCGjAGT 或 AGC ;位點(diǎn)568-570CAT, CAC, TCT，TCC, TCA,TCG,AGT，AGC,ACT,ACC,ACA,TCA,TAT，TAC,ATG 或 ACG;位點(diǎn) 571-573TTA, TTG，CTT，CTC, CTA, CTG，GTT，GTC, GTA, GTG，ATG，ACT, ACC, ACA, GAT，GAC,GGT, GGC, GGA, GGG, GAA, GAG, TAT, TAC 或 ACG ;位點(diǎn) 595-597GAA，GAG, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA或CTG ;位點(diǎn)646-666TTA，TTG, CTT, CTC, CTA或CTG ;或其任意組合。在本發(fā)明的一個(gè)方面，相比于由SEQ ID NO編碼的多肽，變體編碼具有提高的或者降低的對(duì)映體選擇性的多肽，例如，在 3-輕基戍二?；?3-hydroxyglutarylnitrile, HGN)到(R)_4_ 氰基-3-輕基丁酸酯的轉(zhuǎn)化中。在本發(fā)明的一個(gè)方面，核酸包括核苷酸，具有一個(gè)與SEQ ID NO :或其變體基本上相同的序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離核酸或重組核酸，該核酸包括連續(xù)核苷酸，該核苷酸具有一個(gè)與SEQ ID NO 33具有至少79%同一性的序列，其中所述核酸編碼具有腈水解酶活性的多肽。本發(fā)明提供了所述核酸的片段，其中所述片段編碼具有腈水解酶活性的多肽。本發(fā)明也提供了與所述核酸中任何一個(gè)互補(bǔ)的分離核酸或重組核酸。本發(fā)明也提供了與所述核酸中任何一個(gè)在嚴(yán)格條件下雜交的分離核酸或重組核酸。一方面，嚴(yán)格條件包括至少50%甲酰胺，和大約37°C到大約42°C。本發(fā)明提供了一個(gè)核酸探針，包括從大約15個(gè)核苷酸到大約10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，150，200，250，300，350，400，450，500 個(gè)或更多個(gè)核苷酸，其中至少10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸與如下序列所描述的核酸序列內(nèi)的核酸靶區(qū)域有至少50%互補(bǔ)性SEQ ID NO :1,3,5,7,9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63,65,67,69,71,73,75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263,265,267,269,271,273,275,277,279,281,283,285,287,289,291,293,295,297,299,301,303,305,307,309,311,313,315,317,319,321,323,325,327,329,331,333,335,337,339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385，其變體，或它們的補(bǔ)體。一方面，核酸探針包括連續(xù)核苷酸，這些核苷酸與核酸靶區(qū)域具有至少55%的互補(bǔ)性。一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)核酸探針，其中連續(xù)核苷酸與核酸靶區(qū)域具有至少 50 %, 51 %, 52 % , 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %,60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %,75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高或者 100%互補(bǔ)性。另一方面，核酸主要包括大約20到大約50個(gè)核苷酸。在其它方面，核酸的長度可以是至少大約20,25,30,35,40,45,50,75,100，150 個(gè)核苷酸。本發(fā)明提供了一種核酸載體，該核酸載體能在宿主細(xì)胞中復(fù)制，其中所述載體包括本發(fā)明的核酸。本發(fā)明也提供了包括所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明也提供了一種包括該宿主細(xì)胞的宿主生物體。一方面，該宿主生物體包括革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物。另一方面，革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)或熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。在進(jìn)一步的一方面,革蘭氏陽性細(xì)菌包括戴弗薩鏈霉菌(Streptomyces diversa)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳 球菌(Lactococcus Iactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus cremoris)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)。在進(jìn)一步的一方面,真核生物包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Hansenula plymorpha 或黑曲霉(Aspergillus niger)。本發(fā)明提供了一種分離核酸或重組核酸，該核酸編碼多肽，該多肽包括氨基酸，所述氨基酸具有一個(gè)與如下序列具有至少50%同一性的序列，SEQ ID NO =2,4,6,8,10,12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386或其變體，其中多肽具有腈水解酶活性。一方面，多肽包括與SEQID NO 或其變體具有至少大約 50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %,75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高或 100% 同一性的氨基酸。例證性的變體可以包括，例如，SEQ ID NO :196，206，208，210或238的下述變體，具有一個(gè)或多個(gè)突變?cè)跉埢?5處賴氨酸、甘氨酸或谷氨酰胺；在殘基60處谷氨酸；在殘基111處絲氨酸；在殘基190處絲氨酸、組氨酸、酪氨酸或蘇氨酸；在殘基191處亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、酪氨酸或蘇氨酸；在殘基199處谷氨酸或亮氨酸；在殘基222處亮氨酸；或其任意組合。本發(fā)明也提供了一種分離核酸或重組核酸，該核酸編碼包括至少10個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，所述氨基酸具有一個(gè)與如下序列的一個(gè)氨基酸序列的一部分相同的序列，SEQID NO :2,4,6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252， 254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386 或其變體。 一種分離多肽或重組多肽，該多肽包括氨基酸，所述氨基酸具有一個(gè)序列，該序列至少大約 50%與如下序列相同，SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386 或其變體，其中所述多肽具有腈水解酶活性。在本發(fā)明的一方面，多肽包括氨基酸，所述氨基酸具有一個(gè)序列，該序列至少大約50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%,59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %,74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %,89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99% 或更高或 100% 與 SEQ IDNO :或其變體相同。本發(fā)明提供了一種分離核酸或重組核酸，該核酸包括核苷酸，所述核苷酸具有一個(gè)序列，所述序列以如下的 SEQ ID NO :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85,87,89,91,93,95,97,99,101，103，105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141,143,145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191,193,195，197，199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229,231,233,235,237,239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271，273，275，277，279,281,283,285,287,289,291,293,295,297,299,301,303,305,307,309,311,313,315,317，319，321，323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385 及其變體中的任
何一個(gè)所闡明(下文稱作“A組核酸”)。本發(fā)明也涉及與A組核酸序列中的任意序列具有具體說明的最小百分比的序列同一性的核酸。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離(純化)多肽或重組多肽，該多肽包括氨基酸殘基，該殘基具有一個(gè)如下述序列中的任意一個(gè)序列所示的序列，如下述序列為SEQ IDNO :2,4,6,8,10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254， 256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386或其變體，(下文稱作“B組氨基酸序列”)。本發(fā)明也涉及純化的多肽，該多肽與B組氨基酸序列中的任意一個(gè)序列具有具體說明的最小百分比的序列同一性。本發(fā)明提供了一個(gè)多肽片段，該片段的長度至少是50個(gè)氨基酸，并且其中所述片段具有腈水解酶活性。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種多肽或其片段的肽模擬體(p印tidomimetic)，該肽模擬體具有腈水解酶活性。本發(fā)明提供了一種密碼子最優(yōu)化的多肽或其片段，該片段具有腈水解酶活性，其中密碼子使用被最優(yōu)化，以適合特定生物或細(xì)胞。Narum等人Infect. Immun. 2001年12月，69 (12) :7250-3描述了小鼠系統(tǒng)中的密碼子最優(yōu)化。Outchkourov 等人 Protein Expr. Purif. 2002 年 2 月；24 (I) :18-24 描述了酵母系統(tǒng)中的密碼子最優(yōu)化。Feng等人Biochemistry 2000年12月19,39(50) :15399-409描述T大腸桿菌(E. coli)中的密碼子最優(yōu)化。Humphreys等人Protein Expr. Purif. 2000年
11月，20(2) :252-64描述了密碼子使用如何影響大腸桿菌中的分泌作用。一方面，生物體或細(xì)胞包括革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，革蘭氏陰性細(xì)菌包括大腸桿菌(Escherichia coli)或熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，革蘭氏陽性細(xì)菌包括戴弗薩鏈霉菌(Streptomyces diversa)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus cremoris)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)。在本發(fā)明的進(jìn)一步的一方面，真核生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce pombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、Hansenulaplymorpha 或黑曲霉(Aspergillus niger)。另一方面，本發(fā)明提供了一種純化抗體，該抗體與本發(fā)明的多肽或其具有腈水解酶活性的片段特定地結(jié)合。一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)抗體片段，該抗體片段與具有腈水解酶活性的多肽特定地結(jié)合。本發(fā)明提供了一種酶制劑，該酶制劑包括至少一種本發(fā)明的多肽，其中所述制劑是液體或干燥的。該酶制劑包括緩沖劑、輔因子或第二或額外的蛋白質(zhì)。一方面，該制劑被固定在固體載體上。在本發(fā)明的一方面，該固體載體可以是凝膠、樹脂、聚合物、陶瓷制品、玻璃、微電極及其任意組合。另一方面，該制劑可以被封裝在凝膠或珠子中。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種組合物，該組合物包括至少一種本發(fā)明的核酸，所述核酸包括至少一種本發(fā)明的多肽或其具有腈水解酶的片段，或其肽模擬體，或其任意組合。本發(fā)明提供了一種方法，用于將腈水解為羧酸，包括將該分子在適合腈水解酶活性的條件下與至少一種本發(fā)明的多肽或其具有腈水解酶活性的片段，或其肽模擬體接觸。一方面，所述條件包括含水條件。另一方面，所述條件包括PH為大約8. 0，和/或溫度為大約37°C到大約45 °C。本發(fā)明提供了一種方法,用于水解一個(gè)分子的輕腈部分(cyanohydrin moiety)或氨基腈部分(aminonitrile moiety),所述方法包括在適合腈水解酶活性的條件下將該分子與本發(fā)明的至少一種多肽，或其具有腈水解酶活性的片段，或其肽模擬體接觸。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生手性a-羥基酸分子、手性氨基酸分子、手性^ -羥基酸分子、或手性Y -羥基酸分子，所述方法包括將具有羥腈部分或氨基腈部分的分子與至少一種具有對(duì)映體選擇性的腈水解酶活性的多肽混和，所述多肽具有一個(gè)氨基酸序列，該序列與B組氨基酸序列或其片段具有至少50%的同一性，或其肽模擬體。一方面，手性分子是(R)-對(duì)映異構(gòu)體。另一方面，手性分子是(S)-對(duì)映異構(gòu)體。在本發(fā)明的一方面，特定酶可以對(duì)特定底物具有R-特異性，并且該酶可以對(duì)不同特定底物具有S-特異性。本發(fā)明也提供了一種方法，用于產(chǎn)生組合物或其中間體，該方法包括將該組合物或中間體的前體與本發(fā)明的至少一種多肽，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體混和，其中所述前體包括羥腈部分或氨基腈部分；水解前體中的羥腈部分或氨基腈部分，從而制備其組合物或中間體。一方面，該組合物或中間體包括(S)-2-氨基-4-苯基丁酸。在進(jìn)一步的一方面，其組合物或中間體包括L-氨基酸。在進(jìn)一步的一方面，該組合物包括一種食品添加劑或藥用藥物。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生(R)-乙基-4-氰基-3-羥基丁酸，該方法包括將羥基戊二?；媾c至少一種多肽，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體接觸，選擇性地產(chǎn)生(R)-對(duì)映異構(gòu)體，從而制備(R)-乙基-4-氰基-3-羥基丁酸，所述多肽具有一個(gè)B組氨基酸序列的氨基酸序列。一方面，效率(ee)是至少95%或至少99%。另一方面，羥基戍二酸基臆包括1，3- 二-氰基-2-輕基-丙燒或3-輕基戍二酸基臆。在進(jìn)一步的一方面，多肽具有B組氨基酸序列的任意一個(gè)中的一個(gè)氨基酸序列，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體。本發(fā)明也提供了一種方法，用于產(chǎn)生(S)-乙基-4-氰基-3-羥基丁酸，該方法包括將羥基戊二?；媾c至少一種多肽，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體接觸，選擇性地產(chǎn)生(S)-對(duì)映異構(gòu)體，從而產(chǎn)生(S)-乙基-4-氰基-3-羥基丁酸，所述多肽具有B組氨基酸序列的一個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生(R)-扁桃酸，該方法包括將扁桃腈與至少一種多肽，或其具有適當(dāng)腈水解酶活性的任意片段或肽模擬體混和，所述多肽具有B組氨基酸序列的任意一個(gè)氨基酸序列。一方面，(R)-扁桃酸包括(R)-2-氯扁桃酸。另一方面，(R)-扁桃酸包括在鄰_、間-或?qū)?位的一個(gè)芳香環(huán)取代；(R)-扁桃酸的I-萘基衍生物，(R)-扁桃酸的吡啶基衍生物，或(R)-扁桃酸的噻吩基衍生物，或其任意組合。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生(S)-扁桃酸，該方法包括將扁桃腈與至少一種多肽，或其具有腈水解酶活性的任意片段或肽模擬體混和，所述多肽具有B組序列的氨基酸序列。一方面，(S)-扁桃酸包括(S)-甲基芐基氰化物，扁桃腈包括(S)-甲氧基-芐基氰化物?！ひ环矫妫?S)-扁桃酸包括在鄰_、間-或?qū)?位的芳香環(huán)取代；(S)-扁桃酸的I-萘基衍生物，(S)-扁桃酸的吡啶基衍生物，或(S)-扁桃酸的噻吩基衍生物，或其任意組合。本發(fā)明也提供了一種方法，用于產(chǎn)生(S)-苯基乳酸衍生物或(R)-苯基乳酸衍生物，該方法包括將苯基乳腈與至少一種多肽或其任意活性片段或肽模擬體混和，選擇性地產(chǎn)生(S)-對(duì)映異構(gòu)體或(R)-對(duì)映異構(gòu)體，從而產(chǎn)生(S)-苯基乳酸衍生物或(R)-苯基乳酸衍生物，所述多肽選自B組氨基酸序列。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽或其片段，該方法包括(a)在允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的條件下將編碼多肽的核酸引入宿主細(xì)胞，和(b)回收如此所產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明提供了一種方法，用于產(chǎn)生編碼具有腈水解酶活性的多肽的核酸變體，其中所述變體具有相對(duì)于自然發(fā)生者具有改變了的生物活性，該方法包括(a)通過如下步驟修飾核酸(i)用一個(gè)不同的核苷酸替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中核苷酸包括天然或非天然核苷酸；(ii)缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，(iii)增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，或(iv)其任意組合。一方面，非天然核苷酸包括肌苷。另一方面，該方法進(jìn)一步包括，分析由所修飾的核酸編碼的多肽的腈水解酶活性改變，從而識(shí)別編碼具有改變的腈水解酶活性的多肽的修飾核酸(或者多種核酸)。一方面，步驟(a)的修飾是由如下方法實(shí)現(xiàn)的PCR、易錯(cuò)PCR(error-prone PCR)、改組(shuffling)、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(oligonucleotide-directed mutagenesis)、裝配 PCR(assembly PCR)、有性 PCR 誘變(sexual PCR mutagenesis)、體內(nèi)誘變(in vivo mutagenesis)、盒式誘變(cassette mutagenesis)、遞歸集合誘變(recursive ensemble mutagenesis)、指數(shù)集合誘變(exponential ensemble mutagenesis)、位點(diǎn)特異性誘變(site-specificmutagenesis)、基因重裝配(gene reassembly)、基因位點(diǎn)飽和誘變(gene sitesaturated mutagenesis)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction)、體夕卜誘變(in vitro mutagenesis)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligase chain reaction)、寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)、任何產(chǎn)生DNA的技術(shù)及其任意組合。另一方面,該方法進(jìn)一步包括至少重復(fù)一次修飾步驟(a)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法，用于從兩個(gè)或更多個(gè)核酸產(chǎn)生多核苷酸，該方法包括(a)識(shí)別兩個(gè)或更多個(gè)核酸之間的相同區(qū)域和不同區(qū)域，其中至少一個(gè)核酸包括本發(fā)明的核酸；(b)提供一組寡核苷酸，其與所述兩個(gè)或更多個(gè)核酸中的至少兩個(gè)核酸在序列上相符合；和(C)用聚合酶延伸該寡核苷酸，從而產(chǎn)生多核苷酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于鑒定腈水解酶的篩選分析法，該分析方法包括(a)提供多個(gè)核酸或多肽，包括至少一種本發(fā)明的核酸，或至少一種本發(fā)明的多肽；(b)從上述多個(gè)之中，獲得將要測(cè)試腈水解酶活性的多肽候選者；(C)測(cè)試候選者的腈水解酶活性；和(d)鑒定那些是腈水解酶的多肽候選者。一方面，該方法進(jìn)一步包括在測(cè)試候選者的腈水解酶活性之前，修改至少一種核酸或多肽。另一方面，步驟(C)的測(cè)試進(jìn)一步包括測(cè)試包括在宿主細(xì)胞或宿主生物中的改良表達(dá)。在進(jìn)一步的一方面，步驟(C)的測(cè)試進(jìn)一步包括在pH值為大約3到大約12的范圍內(nèi)測(cè)試腈水解酶活性。在進(jìn)一步的一方面，步驟(c)的測(cè)試進(jìn)一步包括在PH值為大約5到大約10的范圍內(nèi)測(cè)試腈水解酶活性。另一方面，步驟(c)的測(cè)試進(jìn)一步包括在溫度為大約4°C到大約80°C的范圍內(nèi)測(cè)試腈水解酶活性。另一方面，步驟(c)的測(cè)試進(jìn)一步包括在溫度為大約4°C到大約55°C的范圍內(nèi)測(cè)試腈水解酶活性。另一方面，步驟(C)的測(cè)試進(jìn)一步包括測(cè)試腈水解酶活性，這導(dǎo)致產(chǎn)生了對(duì)映體選擇性反應(yīng)產(chǎn)物(enantioseletive reaction product)。另一方面,步驟(C)的測(cè)試進(jìn)一步包括測(cè)試腈水解酶活性，這導(dǎo)致產(chǎn)生了區(qū)域選擇性反應(yīng)產(chǎn)物(regio-selective reaction product)。本發(fā)明提供了在如下的方法中使用本發(fā)明的核酸，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體，該方法是被設(shè)計(jì)用來優(yōu)化基因的某一方面或由該基因編碼的多肽的某一方面。一方面，該方法包括將修飾引入核酸的核苷酸序列。另一方面，修飾是由如下方法引入 的PCR、易錯(cuò)PCR、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、裝配PCR、有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸集合誘變、指數(shù)集合誘變、位點(diǎn)特異性誘變、基因重裝配、基因位點(diǎn)飽和誘變、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、體外誘變、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、寡核苷酸合成、任何其它產(chǎn)生DNA的技術(shù)及其任意組合。在進(jìn)一步的一方面，該方法可以被重復(fù)。本發(fā)明提供了在工業(yè)方法中使用本發(fā)明的多肽，或其具有將水解酶活性的片段或肽模擬體。一方面，該方法用來產(chǎn)生藥物組合物，該方法用來產(chǎn)生化學(xué)制品，該方法用來產(chǎn)生食品添加劑，該方法用來催化廢物的分解，或該方法用來產(chǎn)生藥物中間體。在進(jìn)一步的一方面，該方法包括使用所述多肽來水解羥基戊二?；娴孜?。在進(jìn)一步的一方面，該方法用來產(chǎn)生LIPIT0R 。另一方面，所用的多肽包括一個(gè)多肽，該多肽具有序列SEQ ID NO 44,196，208，210或238或其具有腈水解酶活性的片段的連續(xù)氨基酸。另一方面，該方法用來產(chǎn)生洗滌劑。另一方面，該方法用來產(chǎn)生食物產(chǎn)品。本發(fā)明提供了在制備轉(zhuǎn)基因生物中使用本發(fā)明的核酸，或其編碼具有腈水解酶活性的多肽的片段。本發(fā)明提供了一個(gè)試劑盒，該試劑盒包括(a)本發(fā)明的核酸，或其編碼具有腈水解酶活性的多肽的片段，或(b)本發(fā)明的多肽，或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體，或其組合；盒(C) 一種緩沖劑。本發(fā)明提供了一種方法，用來修飾分子，該方法包括(a)將本發(fā)明的多肽或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體與起始分子混和，以產(chǎn)生一種反應(yīng)混合物；(b)將起始分子與多肽反應(yīng)，以產(chǎn)生修飾的分子。本發(fā)明提供了一種方法，用來鑒定修飾的化合物，該方法包括(a)將本發(fā)明的多肽或其具有腈水解酶活性的片段或肽模擬體與起始化合物混和，以產(chǎn)生一種反應(yīng)混合物，然后產(chǎn)生修飾的起始化合物的文庫；(b)測(cè)試該文庫，以確定該文庫中是否存在表現(xiàn)出期望活性的修飾的起始化合物；(C)鑒定表現(xiàn)出期望活性的修飾化合物。本發(fā)明提供了一種篩選分析法，用來分析對(duì)映體選擇性轉(zhuǎn)化，該方法包括(a)提供具有兩個(gè)前手性或局部對(duì)映部分的分子；(b)標(biāo)記該分子的至少一個(gè)前手性或局部對(duì)映部分；(b)通過選擇性催化劑修飾兩個(gè)部分中的至少一個(gè)；和(C)通過質(zhì)譜分析檢測(cè)結(jié)果。篩選分析法可以被用來確定或監(jiān)控對(duì)映體過量百分比(ee)，或確定非對(duì)映體過量百分比(de)。在該分析方法中有用的一個(gè)例證性標(biāo)記是重同位素或輕(liter)同位素。在該分析方法中有用的選擇性催化劑可以是酶?？梢圆捎脙蓚€(gè)部分予以標(biāo)記來完成篩選分析。篩選分析法可以在兩個(gè)方向進(jìn)行，即 從反應(yīng)物到產(chǎn)物，以及從產(chǎn)物到反應(yīng)物。本發(fā)明提供了一種可機(jī)讀的存儲(chǔ)介質(zhì)，其上已經(jīng)存儲(chǔ)了本發(fā)明的核酸，例如包括至少一個(gè)核苷酸序列的核酸，選自如下序列=SEQ ID NO :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75,77,79,81,83,85,87,89,91,93,95,97,99,101,103,105，107，109，111，113，115，117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181，183，185，187，189，191，193，195，197，199,201,203,205,207,209,211,213,215,217,219,221,223,225,227,229,231，233，235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271,273,275,277,279,281,283,285,287,289,291,293,295,297,299,301,303,305,307,309，311，313，315，317，319，321，323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385及其變體，和/或至少一個(gè)選自如下序列的氨基酸序列，SEQ ID NO =2,4,6,8,10,12,14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198，200，202，204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386 或其變體。本發(fā)明提供了一種計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一個(gè)處理器和一個(gè)數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備，其中數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備上已經(jīng)存儲(chǔ)了本發(fā)明的核酸，例如包括至少一個(gè)核苷酸序列的核酸，選自如下序列SEQ ID NO :1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，35，37，39，41，43，45，47，49，51，53，55，57，59，61，63，65，67，69，71，73，75，77，79，81，83，85，87，89，91，93，95，97，99，101,103,105，107，109，111,113,115,117，119，121，123，125，127，129，131，133，135，137，139，141，143，145，147，149，151，153，155，157，159，161，163，165，167，169，171，173，175，177，179，181,183,185，187，189，191,193,195，197，199,201,203,205,207,209,211，213，215，217，219，221，223，225，227，229，231，233，235，237，239，241，243，245，247，249，251，253，255，257，259，261，263，265，267，269，271，273，275，277，279，281，283，285，287,289,291,293,295,297,299,301,303,305,307,309,311,313,315,317,319,321,323，325，327，329，331，333，335，337，339，341，343，345，347，349，351，353，355，357，359，361，363，365，367，369，371，373，375，377，379，381，383，385，及其變體，和 / 或至少一個(gè)選自如下序列的氨基酸序列，SEQ ID NO :2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，52，54，56，58，60，62，64，66，68，70，72，74，76，78，80，82，84，86,88,90,92,94,96,98,100，102，104，106，108，110，112，114，116，118，120，122，124，126，128，130，132，134，136，138，140，142，144，146，148，150，152，154，156，158，160，162，164，166，168，170，172，174，176，178，180，182，184，186，188，190，192，194，196，198,200,202,204，206，208，210，212，214，216，218，220，222，224，226，228，230，232，234，236，238，240，242，244，246，248，250，252，254，256，258，260，262，264，266，268，270，272，274，276，278，280，282，284，286，288，290，292，294，296，298，300，302，304，306，308，310，312，314，316，318，320，322，324，326，328，330，332，334，336，338，340，342，344，346，348，350，352，354，356，358，360，362，364，366，368，370，372，374，376，378，380，382，384，386 或其變體。一方面，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)一步包括一個(gè)序列比較算法和一個(gè)已經(jīng)存儲(chǔ)了至少一個(gè)參考序列的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)設(shè)備。另一方面，序列比較算法包括識(shí)別多態(tài)性的計(jì)算機(jī)程序。本發(fā)明提供了一種方法，用于識(shí)別序列中的特征，該方法包括(a)將序列輸入到計(jì)算機(jī)中；(b)在計(jì)算機(jī)上運(yùn)行序列特征識(shí)別程序，以便在序列中識(shí)別特征；和(C)識(shí)別序 列中的特征，其中所述序列包括本發(fā)明的核酸，例如包括SEQ ID NO :1-386中至少一個(gè)序列的核酸，它的變體，或其任意組合。本發(fā)明提供了一種測(cè)定方法，用于識(shí)別多肽的功能片段，該方法包括(a)獲得本發(fā)明的至少一個(gè)多肽的片段；(b)將步驟(a)的至少一個(gè)片段與具有一個(gè)羥腈部分或氨基腈部分的底物接觸，條件是適合腈水解酶活性；(C)測(cè)量由步驟(b)中至少一個(gè)片段中的每一個(gè)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的量；和(d)識(shí)別能產(chǎn)生腈水解酶反應(yīng)產(chǎn)物的至少一個(gè)片段；從而識(shí)別多肽的功能片段。一方面，步驟(a)的片段是通過合成片段得到的。另一方面，步驟(a)的片段是通過斷裂多肽獲得的。本發(fā)明提供了一種測(cè)定方法，用于識(shí)別多肽的功能變體，該方法包括(a)獲得本發(fā)明的至少一個(gè)多肽的至少一個(gè)變體；(b)將步驟(a)的至少一個(gè)變體與具有一個(gè)羥腈部分或氨基腈部分的底物接觸，條件是適合腈水解酶活性；(C)測(cè)量步驟(b)的至少一個(gè)變體中的每一個(gè)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的量和(d)識(shí)別能產(chǎn)生腈水解酶反應(yīng)產(chǎn)物的至少一個(gè)變體；從而識(shí)別多肽的功能變體。
附圖簡述圖I顯示了化學(xué)反應(yīng)示意圖，其中立體選擇性腈水解酶水解羥腈或氨基腈，以產(chǎn)生手性a-羥基酸或a-氨基酸。圖2圖解說明了一種基于OPA(鄰苯二醛)的氰化物檢測(cè)分析法，用于鑒定腈水解酶活性的存在。圖3是用于檢測(cè)和量化a -羥基酸的光譜系統(tǒng)的圖例，所述檢測(cè)和量化基于立體選擇性乳酸脫氫酶。圖4是用于檢測(cè)和量化a -氨基酸的光譜系統(tǒng)的圖例，所述檢測(cè)和量化基于立體選擇性氨基酸氧化酶。圖5是一個(gè)流程圖，舉例說明了腈水解酶篩選方法的步驟。圖6A-6E是用于D-苯基甘氨酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征，顯示了空白樣品(圖6A)，酶反應(yīng)樣品(圖6B);在緩沖液中包括細(xì)胞溶解產(chǎn)物的陰性對(duì)照組(圖6C);苯基甘氨酸的手性分析(圖6D);和具有D-對(duì)映異構(gòu)體的腈峰的共洗脫(圖6E)。
圖7A-7E說明了色譜圖，其表征(R)_2_氯扁桃酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合。圖7A顯示了緩沖液中僅有2-氯扁桃腈；圖7B顯示了氯扁桃酸標(biāo)準(zhǔn)。圖7C的色譜圖顯示出現(xiàn)了產(chǎn)物，并且底物峰值表現(xiàn)降低。圖8A-8B舉例說明了(S)-苯基乳酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。圖9A-9B舉例說明了 L_2_甲基苯基甘氨酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。

圖10A-10C舉例說明了 L-叔-亮氨酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。圖11A-11C舉例說明了(S)-2-氨基-6-羥基己酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。圖12A-12D舉例說明了 4_甲基-D-亮氨酸和4_甲基-L-亮氨酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。
圖13A-13B舉例說明了(S)-環(huán)己基扁桃酸的底物和產(chǎn)物結(jié)合的色譜特征。圖14A-14B舉例說明與本發(fā)明的篩選分析法有關(guān)的、用于定量的兩個(gè)例證性標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖15舉例說明了所選擇的化合物，所述化合物可以使用本發(fā)明的酶和/或方法從腈水解酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生。圖16舉例說明了所選擇的化合物，所述化合物可以使用本發(fā)明的酶和/或方法從腈水解酶催化的反應(yīng)產(chǎn)生。圖17舉例說明了本發(fā)明的例證性腈水解酶反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及腈水解酶、編碼腈水解酶的核酸，及其用途。正如此處所用，術(shù)語“腈水解酶”包括具有任意腈水解酶活性的任意多肽，例如，能將腈催化為它們的相應(yīng)羧酸和氨的能力。腈水解酶具有商業(yè)用途，如作為生物催化劑用于對(duì)映體選擇性的芳族和脂族氨基酸或羥基酸的合成。
腈水解酶
f^2 尸 I nitrilase R2R1 盡2
Rs CNr^CN r3^COOH腈水解酶化學(xué)如下所述制備羥基酸的腈水解酶反應(yīng)如下
腈水解酶或
OHD OHOH
\1 _^一^ ^\f or
3CNCOOH 3COOH制備氨基酸的腈水解酶反應(yīng)如下
權(quán)利要求
1.一種分離的、合成的或重組的核酸，其中所述核酸的序列為 (a)SEQ ID NO :209的編碼腈水解酶的核酸序列，并由選自如下所示的至少ー個(gè)核苷酸殘基變化組成(i)位點(diǎn)163-165AAA，AAG, GGT, GGC, GGA 或 GGG ；(ii)位點(diǎn)178-180GAA 或 GAG ；(iii)位點(diǎn)331-333TCT, TCC, TCA, TCG, AGT 或 AGC ；(iv)位點(diǎn)568-570CAT, CAC, TCT，TCC, TCA, TCG, AGT，AGC, ACT, ACC, ACA,或 ACG ；(V)位點(diǎn) 571-573CTT, CTC, CTA, CTG, GTT，GTC, GTA, GTG, ATG, ACT, ACC, ACA,或 ACG ；(vi)位點(diǎn)595-597GAA，GAG, CTT, CTC, CTA 或 CTG ;和 (vii)與殘基變化A190H對(duì)應(yīng)的GCT到CAT； 其中(i)至(vii)任一所述的核酸編碼具有腈水解酶活性的多肽； (b)(a)的核酸序列，其中所述核酸序列編碼(i)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQ ID NO:196，_(ii)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQ ID NO :238 ;或 (c)與(a)或(b)的序列完全互補(bǔ)的核酸。
2.分離的、合成的或重組的核酸，其中所述核酸具有與SEQID NO :209相同的序列。
3.一種分離的、合成的或重組的核酸，其中所述核酸的序列為 (a)編碼包括SEQID NO :210的氨基酸序列的多肽，并由選自如下所示的至少ー個(gè)氨基酸殘基變化組成 (i)在殘基55處，賴氨酸或甘氨酸； (ii)在殘基60處，谷氨酸；在殘基111處，絲氨酸； (iii)在殘基190處，絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸； (iv)在殘基191處，亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸；和 (V)在殘基199處，谷氨酸或亮氨酸； 其中(i)至(V)任一所述的多肽具有腈水解酶活性，或 (b)編碼(i)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQID NO:196，或(ii)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQ ID NO :238 ;或 (c)與(a)或(b)的序列完全互補(bǔ)。
4.一種分離的、合成的或重組的核酸，其中所述核酸的序列編碼SEQ ID N0:210。
5.ー種載體，其包括(a)權(quán)利要求I到4中的任一項(xiàng)所述的核酸；或(b) (a)的載體，其中所述載體是、包括或包含于表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的載體，其中所述表達(dá)載體是病毒顆粒、質(zhì)粒、噬菌粒、粘粒、fosmid、細(xì)菌人工染色體、病毒DNA、假狂犬病、基于Pl的人工染色體、酵母質(zhì)?；蚪湍溉斯と?色體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其中所述病毒顆粒是桿狀病毒、噬菌體、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、SV40的衍生物。
8.—種宿主微生物細(xì)胞，所述宿主微生物細(xì)胞包括(a)權(quán)利要求I到4中的任ー項(xiàng)所述的核酸；或(b) (a)的宿主細(xì)胞，其中微生物細(xì)胞是真菌細(xì)胞、或原核細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主微生物細(xì)胞，其中所述真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主微生物細(xì)胞，其中所述原核細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
11.ー種宿主微生物生物體，其包括權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞。
12.ー種固定的核酸，其中所述核酸是權(quán)利要求I到4中的任一項(xiàng)所述的分離的、合成的或重組的核酸，并且其被固定到固相支持體上。
13.如權(quán)利要求12所述的分離的、合成的或重組的固定的核酸，其中固相支持體選自聚合物、陶瓷制品、微電極以及聚合物、陶瓷制品或微電極的任意組合。
14.如權(quán)利要求13所述的分離的、合成的或重組的固定的核酸，其中所述聚合物選自凝膠、樹脂或玻璃。
15.一種分離的、合成的或重組的多肽，其中所述多肽的序列為 (a)SEQ ID NO :210的氨基酸序列，并由選自如下所示的至少ー個(gè)氨基酸殘基變化組成(i)在殘基55處，賴氨酸或甘氨酸；(ii)在殘基60處，谷氨酸；(iii)在殘基111處，絲氨酸；(iv)在殘基190處，絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；(V)在殘基191處，亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸；(vi)在殘基199處，谷氨酸或亮氨酸；其中所述多肽具有腈水解酶活性；或 (b)(a)的氨基酸序列，其中所述多肽序列包括(i)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQ ID NO:196，_(ii)具有氨基酸殘基變化A190H的氨基酸序列SEQ ID NO :238。
16.—種具有腈水解酶活性的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述多肽的序列為SEQ ID NO :210的氨基酸序列，并由至少ー個(gè)選自如下處的氨基酸殘基變化組成(i)殘基55賴氨酸，(ii)殘基55甘氨酸，(iii)殘基60谷氨酸，(iv)殘基111絲氨酸，(V)殘基190絲氨酸，(vi)殘基190組氨酸，(vii)殘基190蘇氨酸，(viii)殘基191亮氨酸，(ix)殘基191纈氨酸，(x)殘基191甲硫氨酸，(xi)殘基191蘇氨酸，(xii)殘基199谷氨酸，和(xiii)殘基199亮氨酸。
17.一種分離的、合成的或重組的多肽，具有腈水解酶活性，其中所述多肽的序列為在SEQ ID NO :210中所示的序列，并在殘基190位置具有突變，其中丙氨酸被賴氨酸、精氨酸或組氨酸替換。
18.一種分離的、合成的或重組的多肽，具有腈水解酶活性，其中所述多肽的序列為在SEQ ID NO :210中所示的序列，并在殘基190位置具有突變，其中丙氨酸被蘇氨酸、絲氨酸或組氨酸替換。
19.一種分離的、合成的或重組的腈水解酶，所述腈水解酶在SEQ ID NO :210的如下位置具有一個(gè)突變的等價(jià)物在殘基55處，賴氨酸或甘氨酸；在殘基60處，谷氨酸；在殘基111處，絲氨酸；在殘基190處，絲氨酸、組氨酸或蘇氨酸；在殘基191處，亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸或蘇氨酸；在殘基199處，谷氨酸或亮氨酸。
20.權(quán)利要求15至19任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，它們處于肽模擬體的形式， 其中當(dāng)(a)它具有用非天然模擬型替換的鍵、肽骨架或氨基酸成分時(shí)，或(b)它具有取代天然氨基酸的至少ー個(gè)非天然氨基酸時(shí)，所述肽處于肽模擬體的形式，其中所述非天然氨基酸是￠-丙氨酸、L-a-氨基丁酸、L-Y-氨基丁酸、L-a-氨基異丁酸、レe -氨基己酸、7-氨基庚酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N- e -Boc-N- a -CBZ-L-賴氨酸、N- e -Boc-N- a -Fmoc-L-賴氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-正亮氨酸、L-正繳氨酸、N- a -Boc-N- 8 CBZ-L-鳥氨酸、N- 8 -Boc-N- a -CBZ-L-鳥氨酸、Boc-p-硝基-L-苯丙氨酸、Boc-羥基脯氨酸、或Boc-L-硫代脯氨酸。
21.一種分離的、合成的或重組的多肽，其中所述多肽具有與SEQ ID NO :210相同的氨基酸序列。
22.密碼子優(yōu)化的分離的、合成的或重組的核酸，其編碼權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，其中所述多肽具有腈水解酶活性，其中一個(gè)或更多個(gè)密碼子被優(yōu)化，以在特定生物體或細(xì)胞中增加表達(dá)。
23.ー種固定的多肽，其中所述多肽為權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的分離的、合成的或重組的多肽或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，并且其被固定到固相支持體上。
24.如權(quán)利要求23所述的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述固相支持體選自聚合物、陶瓷制品、微電極和、聚合物、陶瓷制品或微電極的任意組合。
25.如權(quán)利要求24所述的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述聚合物選自凝膠、樹脂或玻璃。
26.一種純化的、分離的、合成的或重組的抗體，所述抗體特異性地與權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽結(jié)合。
27.ー種酶制劑，所述制劑包括權(quán)利要求15至20中任一項(xiàng)所述多肽的至少ー種，或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，其中所述制劑是液體或干燥的。
28.ー種固定的酶制劑，其中所述酶制劑為權(quán)利要求27所述的酶制劑，并且其被固定到固相支持體上。
29.一種組合物，包括權(quán)利要求I到4任一項(xiàng)所述核酸的至少ー種，或包括權(quán)利要求15到20任一所述的至少ー種多肽。
30.ー種用于將腈分子水解為羧酸的方法，所述方法包括將該分子與權(quán)利要求15到20任一項(xiàng)所述的至少ー種腈水解酶多肽，或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的腈水解酶在適合腈水解酶活性的條件下接觸。
31.一種用于水解分子的羥腈部分或氨基腈部分的方法，所述方法包括將所述分子與權(quán)利要求15到20任一項(xiàng)所述的至少ー種腈水解酶多肽，或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的腈水解酶在適合腈水解酶活性的條件下接觸。
32.一種用于產(chǎn)生手性a-羥基酸分子或手性氨基酸分子的方法，所述方法是將具有羥腈部分或氨基腈部分的分子與至少ー種多肽混合，所述多肽是對(duì)映選擇性腈水解酶活性并具有下列多肽的氨基酸序列(i)權(quán)利要求15至20任一所述的多肽的氨基酸序列，或(ii)由權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的氨基酸序列。
33.一種用于制備ー種組合物或所述組合物的中間產(chǎn)物的方法，所述方法包括將該組合物或中間產(chǎn)物的前體與權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的至少ー種多肽或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的至少ー種腈水解酶混合，其中所述前體包括羥腈部分或氨基腈部分，以及水解所述前體中的羥腈部分或氨基腈部分，從而制備所述組合物或所述組合物的中間產(chǎn)物。
34.ー種用于制備(R)-こ基4-氰基-3-羥基丁酸的方法，所述方法是將羥基戊ニ?；媾c至少ー種腈水解酶多肽接觸，所述腈水解酶選擇性地產(chǎn)生了(R)-對(duì)映異構(gòu)體，從而制備(R)-こ基4-氰基-3-羥基丁酸，其中所述多肽是權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的腈水解酶或者權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽。
35.ー種用于制備(S)-こ基4-氰基-3-羥基丁酸的方法，所述方法是將羥基戊ニ?；媾c至少ー種具有腈水解酶活性的腈水解酶多肽接觸，所述腈水解酶選擇性地產(chǎn)生了(S)-對(duì)映異構(gòu)體，從而制備(S)-こ基4-氰基-3-羥基丁酸，其中所述多肽是權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的腈水解酶或者權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽。
36.ー種用于制備(R)-扁桃酸的方法，所述方法是將扁桃腈與至少ー種腈水解酶多肽混合，其中所述多肽是權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的腈水解酶或者權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽。
37.ー種用于制備(S)-扁桃酸的方法，所述方法是將扁桃腈與至少ー種腈水解酶多肽混和，其中所述多肽是權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的腈水解酶或者權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽。
38.ー種用于制備(S)-苯基乳酸衍生物或(R)-苯基乳酸衍生物的方法，所述方法是將苯基乳氰腈與至少ー種腈水解酶多肽混和，所述腈水解酶選擇性地產(chǎn)生了(S)-對(duì)映異構(gòu)體或(R)-對(duì)映異構(gòu)體，從而產(chǎn)生(S)-苯基乳酸衍生物或(R)-苯基乳酸衍生物，其中所述多肽是權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的腈水解酶或者權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽。
39.一種用于制備權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的多肽或者權(quán)利要求I至4任ー項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽的方法，所述方法包括 (a)將編碼所述多肽的核酸在允許通過宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽的條件下引入宿主細(xì)胞，和 (b)回收如此所產(chǎn)生的多肽。
40.一種用于從兩個(gè)或多個(gè)核酸產(chǎn)生ー個(gè)多核苷酸的方法,所述方法包括 (a)鑒別兩個(gè)或多個(gè)核酸之間的同一性區(qū)域和多祥性區(qū)域，其中所述核酸中的至少ー個(gè)是權(quán)利要求I到4中任一項(xiàng)所述的ー個(gè)核酸； (b)提供ー組寡核苷酸，所述寡核苷酸在序列上與兩個(gè)或多個(gè)核酸中的至少兩個(gè)相應(yīng)；和 (C)用聚合酶延伸寡核苷酸，從而產(chǎn)生多核苷酸。
41.一種用于鑒別腈水解酶的篩選測(cè)定法，所述測(cè)定法包括 (a)提供多個(gè)多肽，包括權(quán)利要求I到4中任一項(xiàng)所述的核酸編碼的至少ー個(gè)多肽，或權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的多肽的至少ー個(gè)； (b)通過包括將所述多肽與腈水解酶底物混合并確定所述底物是否被由所述多肽催化的反應(yīng)改變這一方法測(cè)試所述多肽的腈水解酶活性；從而鑒別具有腈水解酶活性的多肽。
42.ー個(gè)試劑盒，所述試劑盒包括(i) (a)權(quán)利要求I到4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的核酸，或(b)權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽，或(c)其組合；和(ii)緩沖劑。
43.ー種用于修飾分子的方法，所述方法包括 (i)將權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽，或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，與起始分子混和，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物；和 (ii)將所述起始分子與所述多肽反應(yīng)，以產(chǎn)生修飾的分子。
44.ー種用于鑒別修飾的化合物的方法，所述方法包括 (i)將權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽，或權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽，與起始化合物混和，以產(chǎn)生反應(yīng)混合物，井隨后產(chǎn)生修飾的起始化合物的文庫； (ii)測(cè)試所產(chǎn)生的文庫，以確定文庫中是否存在表現(xiàn)出期望活性的修飾的起始化合物；和 (iii)鑒別表現(xiàn)出期望活性的修飾化合物。
45.一種測(cè)定方法，用于識(shí)別多肽的功能片段，所述測(cè)定方法包括 (a)提供權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)所述的至少ー個(gè)多肽或者由權(quán)利要求I至4任ー項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽； (b)在適合腈水解酶活性反應(yīng)條件下，將步驟(a)的至少ー個(gè)片段與具有羥腈部分或氨基腈部分的底物接觸； (C)測(cè)量從步驟(b)中至少ー個(gè)片段中的每ー個(gè)所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的量；和 (d)識(shí)別能產(chǎn)生腈水解酶反應(yīng)產(chǎn)物的至少ー個(gè)片段；從而識(shí)別多肽的功能片段。
46.一種測(cè)定方法，用于識(shí)別功能性腈水解酶多肽，所述測(cè)定方法包括下列步驟 (a)提供權(quán)利要求15至20任ー項(xiàng)的至少ー個(gè)多肽、或由權(quán)利要求I至4的任一項(xiàng)的核酸編碼的多肽，每ー多肽具有至少ー個(gè)變體氨基酸殘基； (b)在適合腈水解酶活性反應(yīng)條件下，將步驟(a)的至少ー個(gè)多肽與具有羥腈部分或氨基腈部分的底物接觸； (C)測(cè)量通過步驟(b)的每ー個(gè)腈水解酶多肽所產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物的量；和 (d)識(shí)別能產(chǎn)生腈水解酶反應(yīng)產(chǎn)物的腈水解酶多肽；從而識(shí)別功能性腈水解酶多肽。
47.一種測(cè)定方法，用于篩選對(duì)映選擇性轉(zhuǎn)化，所述測(cè)定方法包括 (a)標(biāo)記分子中的兩個(gè)前手性或?qū)τ承圆糠种械末`個(gè)； (b)通過選擇性酶促催化劑反應(yīng)修飾兩個(gè)部分中的至少ー個(gè)，從而產(chǎn)生產(chǎn)物； 其中所述選擇性酶促催化劑包括權(quán)利要求15至20任一項(xiàng)的至少ー個(gè)多肽或由權(quán)利要求I至4的任一項(xiàng)所述的核酸編碼的多肽；和 (c)通過質(zhì)譜分析法測(cè)定所得產(chǎn)物。
48.如權(quán)利要求47所述的測(cè)定方法，其中所述標(biāo)記物是重同位素或輕同位素。
49.如權(quán)利要求47所述的測(cè)定方法，其中所述選擇性酶促催化劑是酶。
50.如權(quán)利要求47所述的測(cè)定方法，其中所述使用質(zhì)譜分析法是通過陽性模式或陰性模式進(jìn)行。
51.如權(quán)利要求47所述的測(cè)定方法，其中所述分析或者是親本質(zhì)譜或者是斷裂質(zhì)譜。
52.如權(quán)利要求47所述的測(cè)定方法，其中所述測(cè)定方法可以被用來監(jiān)控或確定對(duì)映體過量百分比，或非對(duì)映體過量百分比。
全文摘要
本發(fā)明涉及腈水解酶和編碼腈水解酶的核酸。并且，也提供了設(shè)計(jì)新穎腈水解酶的方法和使用它們的方法。腈水解酶在增高的pH和溫度下具有增加的活性和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12P41/00GK102796750SQ20121021739
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者G·德桑蒂斯, J·M·肖特, M·伯克, K·王, R·法韋爾, K·查特曼 申請(qǐng)人:維萊尼姆公司