專利名稱：：體內(nèi)摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及利用正交(orthogonal)tRNA、正交氨酰-tRNA合成酶及正交tRNA/正交氨酰-tRNA合成酶對(duì)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的組合物和方法。本發(fā)明還涉及用這種對(duì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法以及用這種方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
：在歷史上，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究依賴于利用天然氨基酸反應(yīng)活性基團(tuán)的特性和可得到的反應(yīng)化學(xué)物質(zhì)。不幸的是，從細(xì)菌到人類，每種己知生物(的蛋白質(zhì))都是由相同的二十種常見氨基酸編碼的(罕見的例外是硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991),MolecularMicrobiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan等，(2002)，Science296:1459-62)。R-基團(tuán)的這種有限選擇性限制了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究，所述研究經(jīng)天然氨基酸的化學(xué)特性證實(shí)，例如，用天然氨基酸制備高度靶向(某氨基酸)的蛋白質(zhì)修飾而不靶向蛋白質(zhì)中所有其它氨基酸的能力有限。此外，天然氨基酸的功能活性，如突光、金屬螯合、氧化還原電勢(shì)、光囚禁(photocaging)等能力也有限。本領(lǐng)域目前使用的用于選擇性修飾蛋白質(zhì)的修飾反應(yīng)大多數(shù)涉及在親核和親電子反應(yīng)伴侶之間形成靶向蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈中天然發(fā)生的親核殘基的共價(jià)鍵，例如，a-鹵代酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。這些情況下中的選擇性由蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)目和可達(dá)性決定。不幸的是，天然發(fā)生的蛋白質(zhì)通常含有弱定位的(例如，不可接觸的)反應(yīng)位點(diǎn)或多個(gè)反應(yīng)靶點(diǎn)(例如，賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基)，這導(dǎo)致修飾反應(yīng)的選擇性弱、難以通過親核/親電子試劑制造高度尋靶的蛋白質(zhì)修飾。此外，修飾位點(diǎn)通常限于賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸天然發(fā)生的親核側(cè)鏈。其它位點(diǎn)的修飾是困難的或不可能的。本領(lǐng)域需要的是將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)以便修飾和研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的新的策略，其中所述非天然氨基酸具有未在天然發(fā)生的氨基酸中發(fā)現(xiàn)的新的特性，例如，生物特性。這的確是本領(lǐng)域的需要，以便產(chǎn)生以高度選擇性方式修飾蛋白質(zhì)以及在生理?xiàng)l件下修飾蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)的新的策略。本領(lǐng)域需要的是產(chǎn)生蛋白質(zhì)修飾的新方法，其中所述修飾是高度特異的，例如，不便天然發(fā)生的氨基酸發(fā)生交叉反應(yīng)或副反應(yīng)的修飾。高度特異的蛋白質(zhì)修飾策略的新化學(xué)可廣泛用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能?？朔@些限制的ー個(gè)策略是擴(kuò)展遺傳密碼并加入相比生物所有組成成分(repertoire)具有不同物理、化學(xué)或生物特性的氨基酸。這種方法已被證實(shí)是可行的，可利用宿主細(xì)胞如真細(xì)菌大腸埃希氏菌(大腸桿菌)、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成機(jī)制通過正交tRNA和相應(yīng)的新正交氨酰-tRNA合成酶將非天然氨基酸加入蛋白質(zhì)。這種方法描述于各種資料，例如，Wang等，(2001),Science292=498-500；Chin等，(2002)JournaloftheAmericanChemicalSociety124:9026-9027;Chin和Schultz,(2002),ChemBioChem11:1135-1137;Chin等，(2002),PNASUnitedStatesofAmerica99:11020-11024;和Wang和Schultz，(2002),Chem.Comm.,l~10o也可參見題為“產(chǎn)生正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)的方法和組合物(METHODSANDCOMPOSITIONSFORTHEPRODUCTIONOFORTHOGONALTRNA-AMINOACYLTRNASYNTHETASEPARIS)”的國(guó)際公開WO2002/086075;題為“非天然氨基酸的體內(nèi)摻入(INVIVOINCORPORATIONOFUNNATURALAMINOACIDS)”的WO2002/085923;題為“真核遺傳密碼的擴(kuò)展(EXPANDINGTHEEUKARYOTICGENETICCODE)”的WO2004/094593;2004年7月7日提交的TO2005/019415；2004年7月7日提交的WO2005/007870;和2004年7月7日提交的WO2005/007624。本領(lǐng)域的確需要開發(fā)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的正交翻譯組分，其中所述非天然氨基酸能被摻入規(guī)定位置，且其中所述非天然氨基酸賦予摻入它們的蛋白質(zhì)新的生物特性。還需要開發(fā)摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分，所述非天然氨基酸具有能使該氨基酸成為特定修飾的靶以排除與蛋白質(zhì)中其它位點(diǎn)的交叉反應(yīng)或副反應(yīng)的新化學(xué)特性。還特別需要能夠產(chǎn)生含有顯著量非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，所述含量能使該蛋白質(zhì)用于治療用途和生物醫(yī)學(xué)研究。這里描述的本發(fā)明滿足了這些需要以及其它需要，通過以下描述這是顯而易見的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))響應(yīng)選擇者密碼子(selectorcodon)如琥珀密碼子將非天然氨基酸摻入產(chǎn)生的多肽鏈的組合物和方法。這些組合物包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA(0-tRNA)和正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)對(duì)。這就是說，宿主細(xì)胞內(nèi)源性氨酰-tRNA合成酶不會(huì)將任何氨基酸(天然或非天然)加入到0-tRNA中。類似地，本發(fā)明提供的O-RS不以顯著水平或者某些情況下是可檢測(cè)水平用氨基酸(天然或非天然)加載任何內(nèi)源性tRNA。這些新的組合物能夠產(chǎn)生大量含有翻譯摻入的非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。根據(jù)所摻入非天然氨基酸的化學(xué)特性，這些蛋白質(zhì)具有廣泛用途，包括例如用于治療或生物醫(yī)學(xué)研究。ー些方面，本發(fā)明提供了一種翻譯系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(0-tRNA)和非天然氨基酸，其中所述第一O-RS用第一非天然氨基酸優(yōu)先氨?；谝?-tRNA。第一非天然氨基酸可選自P-こ基硫代羰基-L-苯丙氨酸、P-(3-氧代丁?；?-L-苯丙氨酸、1，5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羥基-香豆素-丙氨酸、O-硝基芐基-絲氨酸、0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸、P-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、P-氰基-L-苯丙氨酸、聯(lián)苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、聯(lián)批唳基丙氨酸、P-(2-氨基-I-輕こ基)-L-苯丙氨酸或p-異丙基硫代擬基-L-苯丙氨酸。該翻譯系統(tǒng)可采用衍生自各種來源的組分。一實(shí)施方案中，第一O-RS衍生自詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii)氨酰-tRNA合成酶,例如,野生型詹氏甲燒球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它實(shí)施方案中，O-RS衍生自大腸桿菌氨酰-tRNA合成酶，例如，野生型大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶。用于該系統(tǒng)的O-RS包含選自以下的氨基酸序列SEQIDN0:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57、59-63以及那些序列的保守變體。一些實(shí)施方案中，0-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些實(shí)施方案中，0-tRNA包含SEQIDNO:I或2或由其編碼。ー些方面，翻譯系統(tǒng)還包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸包含至少ー種被所述0-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。ー些方面，翻譯系統(tǒng)包含利用第二非天然氨基酸的第二正交對(duì)(即第二O-RS和第ニ0-tRNA)，從而該系統(tǒng)現(xiàn)在能夠在多肽的不同選定位置摻入至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統(tǒng)中，第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化第二0-tRNA，且第二0-tRNA識(shí)別不同于被第一0-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。一些實(shí)施方案中，翻譯系統(tǒng)位于宿主細(xì)胞中(并包括宿主細(xì)胞)。對(duì)所用宿主細(xì)胞沒有特別限制，只要O-RS和0-tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，或酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述宿主細(xì)胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或0-tRNA在內(nèi)的該翻譯系統(tǒng)組分的多核苷酸。一些實(shí)施方案中，編碼O-RS的多核苷酸包含SEQIDN0:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生在所選位置上含有ー個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。通常，這些方法開始于提供翻譯系統(tǒng)的步驟，所述翻譯系統(tǒng)包含(i)選自以下的第一非天然氨基酸P-こ基硫代羰基-L-苯丙氨酸、P-(3-氧代丁?；?-L-苯丙氨酸、I,5-丹酰-丙氨酸、7-氨基-香豆素-丙氨酸、7-羥基-香豆素-丙氨酸、O-硝基芐基-絲氨酸、0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸、P-羧甲基-L-苯丙氨酸、m-氰基-L-苯丙氨酸、p-氰基-L-苯丙氨酸、聯(lián)苯基丙氨酸、3-氨基-L-酪氨酸、聯(lián)批唳基丙氨酸、p-(2-氨基-I-輕こ基)-L-苯丙氨酸和p-異丙基硫代擬基-L-苯丙氨酸；(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)第一正交tRNA(0-tRNA)，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?-tRNA;和(iv)編碼所述蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸包含至少ー種被所述第一0-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。該方法然后在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中響應(yīng)所述選擇者密碼子將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質(zhì)的所述所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白質(zhì)。該方法可用各種試劑和步驟廣泛采用。一些實(shí)施方案中，提供了編碼O-RS的多核苷酸。一些實(shí)施方案中，提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。在其它實(shí)施方案中，提供了衍生自大腸桿菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供衍生自野生型大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶的0-RS。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供含有以下氨基酸序列的O-RS:SEQIDN0:12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63所示氨基酸序列及其保守變體。在這些方法的一些實(shí)施方案中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘變突變野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合口袋，并選擇用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA的所得0-RS。所述選擇步驟包括在定點(diǎn)誘變之后從含有許多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中對(duì)所述O-RS進(jìn)行陽性選擇和陰性選擇。一些實(shí)施方案中，提供步驟提供編碼Ο-tRNA的多核苷酸，例如，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQIDNO:I或2所示多核苷酸序列或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有被翻譯系統(tǒng)利用的琥珀選擇者密碼子的核酸。還可修飾這些方法以在蛋白質(zhì)中摻入一個(gè)以上非天然氨基酸。在那些方法中，與第一翻譯系統(tǒng)結(jié)合使用第二正交翻譯系統(tǒng)，其中的第二系統(tǒng)具有不同的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二O-RS和第二Ο-tRNA，其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；诙?tRNA，且其中的第二0-tRNA識(shí)別核酸中不同于被第一Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。產(chǎn)生具有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法還可在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。此時(shí)需提供宿主細(xì)胞，其中的宿主細(xì)胞含有非天然氨基酸、0-RS、Ο-tRNA和核酸，且其中所述培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞導(dǎo)致非天然氨基酸的摻入。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細(xì)胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQIDN0:13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示的核苷酸序列。一些實(shí)施方案中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟通過提供細(xì)胞提取物完成。一些方面，本發(fā)明提供了翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于摻入3-硝基-L-酪氨酸或P-硝基-L-苯丙氨酸。這些系統(tǒng)包含第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA(Ο-tRNA)和非天然氨基酸,其中的第一O-RS用第一非天然氨基酸優(yōu)先氨?；谝沪?tRNA,其效率至少為含有所述第一非天然氨基酸、所述第一Ο-tRNA和含有選自SEQIDNO7-10的氨基酸序列的O-RS的翻譯系統(tǒng)效率的50%。該翻譯系統(tǒng)可使用衍生自各種來源的組分。一些實(shí)施方案中，第一O-RS衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶，例如，野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。用于該系統(tǒng)的O-RS可包含選自SEQIDN0:7-10所示氨基酸序列及其保守變體的氨基酸序列。一些實(shí)施方案中，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA。一些實(shí)施方案中，Ο-tRNA包含SEQIDNO:I所示多核苷酸序列或由其編碼。一些方面，翻譯系統(tǒng)還包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸具有至少一個(gè)被Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。一些方面，翻譯系統(tǒng)包含利用第二非天然氨基酸的第二正交對(duì)(即第二O-RS和第二Ο-tRNA)，從而該系統(tǒng)現(xiàn)在能夠在多肽的不同選定位置摻入至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統(tǒng)中，第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；诙?tRNA，且第二Ο-tRNA識(shí)別不同于被第一Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。一些實(shí)施方案中，翻譯系統(tǒng)位于宿主細(xì)胞中(并包括宿主細(xì)胞)。對(duì)所用宿主細(xì)胞沒有特別限制，只要O-RS和Ο-tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌。所述宿主細(xì)胞可含有一種或多種編碼包括O-RS或Ο-tRNA在內(nèi)的該翻譯系統(tǒng)組分的多核苷酸。一些實(shí)施方案中，編碼O-RS的多核苷酸包含SEQIDNO:11的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生在所選位置上含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。通常，這些方法開始于提供含有翻譯系統(tǒng)的宿主細(xì)胞的步驟，所述翻譯系統(tǒng)包含(i)第一非天然氨基酸，其為3-硝基-L-酪氨酸或P-硝基-L-苯丙氨酸；(ii)第一正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)；(iii)第一正交tRNA(Ο-tRNA)，其中的O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?tRNA，其效率至少為含有所述非天然氨基酸、Ο-tRNA和含有選自SEQIDNO7-10的氨基酸序列的O-RS的宿主細(xì)胞效率的50%;和(iv)編碼蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有至少一種被Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。然后使宿主細(xì)胞生長(zhǎng)，并在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中響應(yīng)選擇者密碼子將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質(zhì)的所選位置，其中，所述蛋白質(zhì)中的所選位置對(duì)應(yīng)于所述核酸中所述選擇者密碼子的位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有所述非天然氨基酸的所述蛋白質(zhì)。這些方法可用各種試劑和步驟廣泛采用。一些實(shí)施方案中，提供了編碼O-RS的多核苷酸。一些實(shí)施方案中，提供了衍生自詹氏甲烷球菌氨酰-tRNA合成酶的0-RS，例如可提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供含有選自SEQIDNO:7-10及其保守變體的氨基酸序列的0-RS。在這些方法的一些實(shí)施方案中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘變突變野生型氨酰-tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合口袋，并選擇用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA的所得0-RS。所述選擇步驟包括在定點(diǎn)誘變之后從含有許多所得氨酰-tRNA合成酶分子的集合中對(duì)所述O-RS進(jìn)行陽性選擇和陰性選擇。一些實(shí)施方案中，提供步驟提供編碼Ο-tRNA的多核苷酸，例如，Ο-tRNA是琥珀抑制基因tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQIDNO:I所示多核苷酸序列或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有被翻譯系統(tǒng)利用的琥珀選擇者密碼子的核酸。還可修飾這些方法以在蛋白質(zhì)中摻入一個(gè)以上非天然氨基酸。在那些方法中，與第一翻譯系統(tǒng)結(jié)合使用第二正交翻譯系統(tǒng)，其中的第二系統(tǒng)具有不同的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二O-RS和第二Ο-tRNA，其中的第二O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；诙?tRNA，且其中的第二0-tRNA識(shí)別核酸中不同于被第一Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。產(chǎn)生具有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法還可在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。在這些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞含有非天然氨基酸、0-RS、Ο-tRNA和核酸，且其中所述培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞導(dǎo)致非天然氨基酸的摻入。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細(xì)胞。一些實(shí)施方案中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細(xì)胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQIDNO:11所示的核苷酸序列。一些實(shí)施方案中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟通過提供細(xì)胞提取物完成。本發(fā)明還提供了各種包含核酸和蛋白質(zhì)的組合物。對(duì)該組合物的性質(zhì)沒有特別限制，只要該組合物含有規(guī)定的核酸或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的組合物可含有任何數(shù)量任何性質(zhì)的額外組分。例如，本發(fā)明提供了含有O-RS多肽的組合物，其中所述多肽含有SEQIDNO:7-10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-55、57、59-63或其保守變體，其中的保守變體多肽用非天然氨基酸氨酰化同源正交tRNA(Ο-tRNA)，其效率至少為含有Ο-tRNA、非天然氨基酸和含有選自SEQIDNO:7_10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、50、52-54、57或59-63的氨基酸序列的氨酰-tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng)效率的50%。本發(fā)明還提供了編碼上述任何多肽的多核苷酸。一些實(shí)施方案中，這些多核苷酸可含有SEQIDN0:ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56和58。一些實(shí)施方案中，多肽在細(xì)胞中。本發(fā)明還提供了含有SEQIDNO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、56或58所示核苷酸序列的多核苷酸組合物。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有所述多核苷酸的載體，如表達(dá)載體。一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有上述載體的細(xì)胞。圖I提供了各種非天然氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖2提供了在存在(泳道2)或不存在(泳道3)P-硝基-L-苯丙氨酸時(shí)累積的Z-結(jié)構(gòu)域蛋白的染色SDS-PAGE分析照片。泳道I含有分子量標(biāo)記。圖3提供摻入P-硝基-L-苯丙氨酸的Z-結(jié)構(gòu)域蛋白的MALDI-T0F分析。預(yù)計(jì)質(zhì)量7958，7826(第一個(gè)甲硫氨酸除外);觀察值:7958,7828。圖4A提供了22TrpGCMpl突變體(實(shí)線)以及22Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCMpl突變體混合物(虛線)的熒光光譜。圖4B提供了55TrpGCMpl突變體(實(shí)線)以及55Trp和22p-硝基-L-苯丙氨酸GCMpl突變體混合物(虛線)的熒光光譜。圖5A提供了1，5-丹酰丙氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖5B提供了結(jié)合有1，5_丹酰丙氨酸-AMP-酰胺的嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶(LRS)活性位點(diǎn)的模型。作為隨機(jī)化區(qū)域一部分的突變體LRS克隆B8的活性位點(diǎn)殘基用條狀物表示。編號(hào)與大腸桿菌LRS相對(duì)應(yīng)。圖6A和6B描述了突變體B8亮氨酰-tRNA合成酶編輯位點(diǎn)的再設(shè)計(jì)策略。圖6A提供了與模擬荷電tRNA3’-末端的2’-(L-正纈氨酰)_氨基_2’-脫氧腺苷復(fù)合的嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶編輯位點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)。T252和V340用條狀物表示。圖6B提供了Ni-NTA純化的hSOD的SDS-PAGE分析，它具有用亮氨酰-tRNA合成酶克隆B8在33位引入的丹酰丙氨酸和兩個(gè)突變體V338A和T252A。上面的凝膠是考馬斯染色的照片。下面的凝膠是在302nm激發(fā)、在520nm發(fā)射的突光圖象。L=分子量梯；UAA=非天然氨基酸。圖7A和7B描述了通過易錯(cuò)PCR和選擇產(chǎn)生的大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6的增強(qiáng)的琥珀抑制效率。圖7A提供了嗜熱棲熱菌亮氨酰-tRNA合成酶的晶體結(jié)構(gòu)(Cusack等，EMBOj.,19(10):2351-2361[2000])。標(biāo)出了G2-6克隆中存在的合成結(jié)構(gòu)域、編輯結(jié)構(gòu)域、同源大腸桿菌合成酶中隨機(jī)化的氨基酸以及通過易錯(cuò)PCR改變的氨基酸。圖7B提供了所表達(dá)的在33位含有ο-硝基芐基絲氨酸的hSOD的考馬斯染色SDS-PAGE分析，采用設(shè)計(jì)的可摻入ο-硝基芐基半胱氨酸的大腸桿菌亮氨酰-tRNA突變體合成酶克隆3H11和用ο-硝基芐基絲氨酸有效抑制所涉及的突變體大腸桿菌亮氨酰-tRNA合成酶克隆G2-6。L=分子量梯；UAA=非天然氨基酸(oNBS)。圖8提供了通過365nm照射將囚禁的酪氨酸分子0_(2_硝基芐基)_L_酪氨酸光致脫囚禁(photodecaging)(光活化)的示意圖，導(dǎo)致切斷芐基化CO-鍵和迅速形成脫囚禁的(decaged)氨基酸。圖9提供了濃度曲線試驗(yàn)，說明了觀察到的囚禁中的(caged)酪氨酸分子O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸的光致脫囚禁(光活化)。O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸的光致脫囚禁可用手提UV燈(365nm，距離IOmm)照射O.2mM氨基酸水溶液證實(shí)。在特定時(shí)間點(diǎn)取出等份溶液用LC/MS分析。顯示了O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸(正方形)和相應(yīng)的脫囚禁酪氨酸(圓形)的濃度。圖10提供了在存在或不存在O-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸時(shí)用三種不同突變體合成酶表達(dá)的肌球蛋白74TAG的Gelcode藍(lán)染色的SDS-PAGE。圖IIA和IIB提供了74TAG突變體肌球蛋白的LC-MS/MS分析，顯示了74位的酪氨酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGYILK;SEQIDN0:64)。圖12A和12B提供了與圖IlA和IlB類似的LC-MS/MS分析，但分析使用氚化的0-(2-硝基芐基)-L-酪氨酸，其中的J表示氚化的氨基酸(胰蛋白酶(水解)肽HGVTVLTALGJILK；SEQIDN0:65)。圖13提供了在THF和水中獲得的對(duì)-氰基苯丙氨酸IR譜的疊加圖。圖14A提供了與高斯曲線(虛線)擬合的對(duì)-氰基苯丙氨酸(實(shí)線)的本底減除譜。圖14B提供了與高斯曲線(虛線)擬合的間-氰基苯丙氨酸(實(shí)線)的本底減除譜。圖15提供了P-乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸的合成過程。圖16提供了在第七個(gè)位置上含非天然氨基酸的突變體Z結(jié)構(gòu)域蛋白的MALDI-T0F質(zhì)譜分析結(jié)果。所有通過試驗(yàn)獲得的質(zhì)量數(shù)據(jù)與含有硫酯或羧酸基團(tuán)的完整蛋白質(zhì)的計(jì)算質(zhì)量極好吻合。圖17提供了通過化學(xué)結(jié)合標(biāo)記的蛋白質(zhì)的原理圖。圖18A-18D提供了在340nm測(cè)得的LC/MS洗脫曲線(第一峰3;第二峰2)。圖18A顯示了使用3和2的1:1甲醇混合物得到的曲線。圖18B顯示了使用3的PBS溶液得到的曲線(pH=7.4，反應(yīng)時(shí)間1周)。圖18C顯示了用3的PBS溶液得到的曲線(pH=3.9，反應(yīng)時(shí)間4天)。圖18D顯示了用稀硫酸溶液稀釋的3得到的曲線(pH=1.9,反應(yīng)時(shí)間12小時(shí))。所有反應(yīng)都在室溫下勻速攪拌進(jìn)行。圖19提供了含有二酮基非天然氨基酸P-(3-氧代丁?；?-L-苯丙氨酸的合成過程。圖20提供了在存在或不存在P-(3-氧代丁?；?-L-苯丙氨酸時(shí)表達(dá)的Z結(jié)構(gòu)域蛋白的Gelcode藍(lán)染色的SDS-PAGE分析。分析顯示了用熒光素酰肼體外標(biāo)記含有p_(3_氧代丁?；?-L-苯丙氨酸的突變體Z結(jié)構(gòu)域蛋白。Wt=野生型。圖21提供了含有二酮基部分的各種加合物的合成過程。具體實(shí)施例方式定義在詳細(xì)描述本發(fā)明前，需要說明本發(fā)明并不局限于某些特定的生物系統(tǒng)，本發(fā)明可以有各種變化。還應(yīng)當(dāng)說明本文所用的術(shù)語是為了描述特定的實(shí)施方案，并不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。如本發(fā)明的說明書和附屬權(quán)利要求中使用，除非特別指明，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“這種”也包括復(fù)數(shù)。因此，例如，“一個(gè)細(xì)胞”包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞；“一種多核苷酸”作為一種特定物質(zhì)包括該多核苷酸的多個(gè)拷貝。除了在此處和說明書的其余部分所定義的，本文所用的所有科技術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員共同理解的意義相同。正交本文所用的術(shù)語“正交”指一種分子(如正交tRNA(Ο-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))具有某細(xì)胞內(nèi)源性組分的功能，但與該細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)內(nèi)的相應(yīng)內(nèi)源性分子相比其效力低，或者不具有該細(xì)胞內(nèi)源性組分的功能。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言，正交是指正交的tRNA或正交的氨酰tRNA合成酶具有內(nèi)源性tRNA或內(nèi)源性tRNA合成酶的功能，但與內(nèi)源性tRNA或內(nèi)源性tRNA合成酶相比無能或效力低，如低于20%、10%、5%或1%。該正交分子缺乏細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性互補(bǔ)分子的正常功能。例如，與內(nèi)源性tRNA被內(nèi)源性RS氨?；啾龋?xì)胞內(nèi)的正交tRNA被細(xì)胞的內(nèi)源性RS氨?；瘯r(shí)其效率降低，甚至為零。在另外一個(gè)實(shí)施例中，與內(nèi)源性的RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA相比，正交的RS在感興趣細(xì)胞內(nèi)氨?；魏蝺?nèi)源性tRNA時(shí)其效率降低，或者甚至為零。第二正交分子可以被引入到細(xì)胞內(nèi)和第一正交分子一起發(fā)揮功能。例如，正交tRNA/RS對(duì)包括引入的互補(bǔ)組分，在細(xì)胞內(nèi)一起行使功能時(shí)其效率與對(duì)照，如相應(yīng)的內(nèi)源性tRNA/RS對(duì)或活性正交對(duì)(如酪氨酰正交tRNA/RS對(duì))相比可以達(dá)到45%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或更高。ιΗ交酪氨釀-tRNA:本文所用的術(shù)語正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-0_tRNA)是與感興趣翻譯系統(tǒng)正交的tRNA，該tRNA:(I)與天然產(chǎn)生的酪氨酰tRNA相同或基本類似，(2)衍生自天然酪氨酰tRNA的天然突變或人工誘變，(3)由考慮到(I)或(2)的野生型或突變型酪氨酰tRNA序列的方法所產(chǎn)生，(4)與野生型或突變型亮氨?；蚶野滨RNA同源，(5)與表5中所列稱為亮氨?；蚶野滨RNA合成酶底物的典型tRNA同源，或(6)是表5中稱為亮氨?；蚶野滨RNA合成酶底物的典型tRNA的保守變體。亮氨酰或酪氨酰tRNA可以負(fù)載一個(gè)氨基酸，或非負(fù)載狀態(tài)。還需要說明“酪氨酰-Ο-tRNA”或“亮氨酰-Ο-tRNA”可任選經(jīng)相關(guān)合成酶加載(氨酰化)除賴氨酸或亮氨酸以外的氨基酸，如非天然氨基酸。應(yīng)理解本發(fā)明的亮氨酰或酪氨酰-Ο-tRNA確實(shí)可優(yōu)選用于在翻譯時(shí)響應(yīng)選擇者密碼子將任何必需的氨基酸，無論是天然的或是人工合成的，插入到正在延伸的多肽內(nèi)。IH交酪氨酰氨基酸合成酶本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨酰-0-RS)是一種可以在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)用氨基酸優(yōu)先氨?；野滨?Ο-tRNA的合成酶。被酪氨酰-O-RS加載到酪氨酰-Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工合成的，不限于本文所述的。該合成酶還任選可以與天然的酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與表5中稱為酪氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如,酪氨酰-O-RS可以是表5所列的酪氨酰-O-RS的保守變體，和/或與表5所列的酪氨酰-O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。類似地，正交亮氨酰氨基酸合成酶(亮氨酰-0-RS)是一種在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)能用氨基酸優(yōu)先氨?；涟滨?Ο-tRNA的酶。被亮氨酰-O-RS加載到亮氨酰-Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工合成的，不限于本文所述的。該合成酶還任選可以與天然的亮氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與表5中稱為亮氨酰-O-RS的合成酶相同或同源。例如，該O-RS可以是表5所列的亮氨酰-O-RS的保守變體，和/或與表5所列的O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或更高的相同性。M^(cognate):術(shù)語“同源”指能一起發(fā)揮功能的組分，如正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶。此種組分也稱為互補(bǔ)組分。優(yōu)先氨釀化在這里渉及ιΗ交翻譯系統(tǒng),當(dāng)O-RS用氨基酸加載Ο-tRNA的效率比其加載表達(dá)系統(tǒng)中其它任何內(nèi)源性tRNA的效率都高時(shí)O-RS“優(yōu)先氨酰化”同源Ο-tRNA。也就是說，當(dāng)Ο-tRNA和其它任何給定的內(nèi)源性tRNA以大致相同摩爾比例同時(shí)存在于翻譯系統(tǒng)內(nèi)時(shí)，O-RS加載Ο-tRNA的頻率要高于其加載內(nèi)源性tRNA的頻率。優(yōu)選的是當(dāng)Ο-tRNA和內(nèi)源性tRNA以相同摩爾濃度存在于翻譯系統(tǒng)內(nèi)時(shí)，被O-RS所加載的Ο-tRNA與O-RS所加載的內(nèi)源性tRNA的相對(duì)比例較高，其結(jié)果導(dǎo)致O-RS只加載、或者幾乎只加載Ο-tRNA。當(dāng)Ο-tRNA和O-RS以相同摩爾濃度存在時(shí)，被O-RS加載的Ο-tRNA和內(nèi)源性tRNA之間的相對(duì)比例大于1:1，優(yōu)選至少約為2:1，更優(yōu)選的是5:1，甚至10:1、20:1、50:1、75:1、95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1，000:1、5，000:1或更高。下述情況下所述O-RS“用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?-tRNA”(a)與內(nèi)源性tRNA相比，O-RS更容易氨?；?tRNA，以及(b)與O-RS用任何天然氨基酸氨?；?tRNA相比，其中的氨?；欠翘烊话被崽禺愋缘?。也就是說，當(dāng)非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩爾的量存在于含O-RS和Ο-tRNA的翻譯系統(tǒng)中時(shí)，O-RS用非天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率要高于用天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率。優(yōu)選的是非天然氨基酸加載的Ο-tRNA與天然氨基酸加載的Ο-tRNA之間的相對(duì)比例較高。更優(yōu)選的是O-RS只用或者幾乎只用非天然氨基酸加載Ο-tRNA。當(dāng)非天然氨基酸和天然氨基酸以等摩爾的濃度存在于翻譯系統(tǒng)中時(shí)，非天然氨基酸加載的Ο-tRNA與天然氨基酸加載的Ο-tRNA之間的相對(duì)比例高于1:1，優(yōu)選至少約為2:1，更優(yōu)選的是5:1，甚至10:1、20:1、50:1、75:1、95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1,000:1,5,000:1或更高。詵擇者密碼子:術(shù)語“選擇者密碼子”指在翻譯過程中能被Ο-tRNA識(shí)別但通常不被內(nèi)源性tRNA識(shí)別的密碼子。Ο-tRNA反密碼子環(huán)能識(shí)別mRNA上的選擇者密碼子并能在多肽的該位點(diǎn)摻入此氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇者密碼子包括無義密碼子，如終止密碼子，例如琥珀密碼子、赭石密碼子和乳白密碼子；四堿基或多堿基密碼子；稀有密碼子’天然或非天然堿基對(duì)產(chǎn)生的密碼子等。抑制基因tRNA:抑制基因tRNA是一種可在給定的翻譯系統(tǒng)內(nèi)改變信使RNA(mRNA)的閱讀的tRNA，例如通過將氨基酸摻入到多肽鏈內(nèi)以響應(yīng)選擇者密碼子的機(jī)制。例如，抑制基因tRNA可通讀終止密碼子(例如，琥珀、赭石或乳白密碼子)、四堿基密碼子、稀有密碼子坐寸ο抑制活件:如本文采用的，術(shù)語“抑制活性”通常指tRNA(如抑制基因tRNA)翻譯閱讀通過某密碼子(如為琥珀密碼子或四堿基或多堿基密碼子的選擇者密碼子)的能力，否則導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)譯(如移碼)。抑制基因tRNA的抑制活性可以表示為與第二抑制基因tRNA或與對(duì)照系統(tǒng)如缺乏O-RS的對(duì)照系統(tǒng)相比所觀察到的翻譯讀通活性的百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明提供了定量測(cè)定抑制活性的各種方法。特定Ο-tRNA和ORS對(duì)感興趣的選擇者密碼子(如琥珀密碼子)的抑制百分率指，與陽性對(duì)照構(gòu)建物相比，位于編碼某表達(dá)檢測(cè)標(biāo)記的核酸中的該給定表達(dá)檢測(cè)標(biāo)記(如LacZ)，包括選擇者密碼子，在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)的活性百分?jǐn)?shù)，其中的感興趣的翻譯系統(tǒng)含有O-RS和Ο-tRNA，而陽性對(duì)照不含0-tRNA、O-RS和選擇者密碼子。因此，如果某缺乏選擇者密碼子的活性陽性對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建物在一個(gè)給定翻譯系統(tǒng)內(nèi)的活性是X，那么含有選擇者密碼子的被檢測(cè)構(gòu)建物的抑制百分率為被檢測(cè)構(gòu)建物在與陽性對(duì)照標(biāo)記基本相同的表達(dá)環(huán)境條件下所顯示的X的百分比，其中該被檢測(cè)標(biāo)記構(gòu)建物所表達(dá)的翻譯系統(tǒng)也含有ο-tRNA和ο-RS。一般來說，表達(dá)被檢測(cè)標(biāo)記的翻譯系統(tǒng)還包含能被O-RS和Ο-tRNA識(shí)別的氨基酸。任選地，抑制百分率的測(cè)定可以通過將該被檢測(cè)標(biāo)記與“背景”或“陰性”對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建物比較而精細(xì)確定，后者含有與被檢測(cè)標(biāo)記相同的選擇者密碼子，但是該系統(tǒng)中不包含0-tRNA、O-RS和/或能被Ο-tRNA和/或O-RS識(shí)別的相關(guān)氨基酸。這種陰性對(duì)照可用于對(duì)該標(biāo)記在感興趣翻譯系統(tǒng)中所產(chǎn)生的背景信號(hào)進(jìn)行處理使抑制百分率測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化。抑制效率可通過本領(lǐng)域熟知的多種方法測(cè)定。例如，可利用β半乳糖苷酶報(bào)告分子試驗(yàn)，如將衍生的IacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物在IacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)和含有本發(fā)明的Ο-tRNA的質(zhì)粒一起導(dǎo)入到合適生物(如可利用此正交組分的生物)的細(xì)胞內(nèi)。也可導(dǎo)入相關(guān)合成酶(或者以多肽或編碼相關(guān)合成酶的多核苷酸形式)。將這些細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)到所需的密度，如0D_達(dá)到約O.5時(shí)，采用BetaFluorβ-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒(Novagen)進(jìn)行β半乳糖苷酶試驗(yàn)。抑制百分率可以計(jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照，如衍生的IacZ構(gòu)建物所顯示的活性的百分比，其中所述構(gòu)建物在所需位置上含有相應(yīng)的有義密碼子而不是選擇者密碼子。翻譯系統(tǒng):術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”指可以將氨基酸摻入到正在延伸的多肽鏈(蛋白)中的各組分。翻譯系統(tǒng)的各組分包括核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的Ο-tRNA和/或O-RS也可以加入到體外或體內(nèi)的翻譯系統(tǒng)中，或者作為翻譯系統(tǒng)的一部分，如非真核細(xì)胞如細(xì)菌(如大腸桿菌)或真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等的翻譯系統(tǒng)。非天然氨基酸:本文所用術(shù)語“非天然氨基酸”指20個(gè)常見天然氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸之外的任何氨基酸、修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物，如圖I提供的17種非天然氨基酸。衍生自本文所用術(shù)語“衍生自”指從特定分子或生物、或者根據(jù)該特定分子或生物的信息分離的組分，或者利用該特定分子或生物的信息制備的組分。例如，衍生自第二多肽的多肽可包含與第二多肽的氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。對(duì)多肽而言，可通過例如天然發(fā)生的誘變、人工定點(diǎn)誘變或人工隨機(jī)誘變獲得衍生的種類。用來衍生多肽的誘變可以是故意定點(diǎn)的或是故意隨機(jī)的，或是這兩者的混合。誘變多肽以形成衍生自第一多肽的不同多肽可以是隨機(jī)事件(例如，由聚合酶失真(infidelity)造成)，而衍生的多肽的鑒定可通過例如這里所述的合適的篩選方法完成。多肽的誘變通常需要操作編碼多肽的多核苷酸。陽件詵擇或篩詵標(biāo)記:本文所用的術(shù)語“陽性選擇或篩選標(biāo)記”指可通過其存在(例如表達(dá)、活化等)來鑒定含有該性狀的細(xì)胞的標(biāo)記，例如具有該陽性選擇標(biāo)記的細(xì)胞與不具有此性狀的細(xì)胞相比較。陰性選擇或篩選標(biāo)記:本文所用的術(shù)語“陰性選擇或篩選標(biāo)記”指可通過其存在(如表達(dá)、活化等)來鑒定不含有所選特性或性狀的細(xì)胞(如，與具有該特性或性狀的細(xì)胞相比較)。報(bào)告分子:本文所用的術(shù)語“報(bào)告分子”是指可用于鑒定和/或篩選感興趣系統(tǒng)內(nèi)靶組分的組分。例如，報(bào)告分子可以包括蛋白質(zhì)，如能賦予抗生素抗性或敏感性的酶(如β-內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光選擇標(biāo)記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、YFP、EGFP,RFP等)、發(fā)光標(biāo)記(如螢火蟲熒光素酶蛋白)、親和力篩選標(biāo)記，或者陽性或陰性選擇標(biāo)記基因如lacZ、β-gal/lacZ(β-半乳糖苷酶)、Adh(乙醇脫氫酶)、his3、ura3、leu2、lys2等。真核生物本文所用的術(shù)語“真核生物”指屬于真核生物界的生物。真核生物與原核生物的區(qū)別總體上在于它們通常是多細(xì)胞生物(但不排除單細(xì)胞生物，如酵母)，存在膜包裹的核及其它膜包裹的細(xì)胞器，線形遺傳物質(zhì)(即線形染色體)，無操縱子，存在內(nèi)含子、加帽信使(messagecapping)和poly_AmRNA,以及其它生化特征,如可鑒別的核糖體結(jié)構(gòu)。真核生物包括，例如，動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥類等)、纖毛蟲、植物(如單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母、鞭毛蟲、微孢子蟲、原生生物等。原核生物本文所用的術(shù)語“原核生物”指屬于單蟲無核原生動(dòng)物(也稱為Procarya)界的生物。原核生物與真核生物的區(qū)別通常在于，它們是單細(xì)胞生物，通過出芽或分裂進(jìn)行無性生殖，缺乏膜包裹的核或其它膜包裹的細(xì)胞器，環(huán)形染色體，存在操縱子，無內(nèi)含子、加帽信使和PoIy_AmRNA,以及其它生化特征,如可鑒別的核糖體結(jié)構(gòu)。Prokarya包括真細(xì)菌和古菌(有時(shí)也稱為“古細(xì)菌”)亞界。藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)綠藻)和支原體有時(shí)是單蟲無核原生動(dòng)物界下的單獨(dú)類型。迦童:本文所用的術(shù)語“細(xì)菌”和“真細(xì)菌”指不同于古直的原核生物。類似地，古菌指不同于真細(xì)菌的原核生物?？赏ㄟ^許多形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和生化標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分真細(xì)菌和古菌。例如，以下差異可用來將生物歸為真細(xì)菌或古菌核糖體RNA序列、RNA聚合酶結(jié)構(gòu)、存在或不存在內(nèi)含子、抗生素敏感性、存在或不存在細(xì)胞壁肽聚糖和其它細(xì)胞壁組分、膜脂為分支或不分支的結(jié)構(gòu)、以及存在/不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白質(zhì)真細(xì)菌的例子包括大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)和嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)。古菌的例子包括詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii)(Mj)、馬氏微球菌(Methanosarcinamazei)(Mm)、熱自養(yǎng)甲燒球菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)(Mt)、海沼甲燒球菌(Methanococcusmaripaludis)、坎氏甲燒嗜熱菌(Methanopyruskandleri)、鹽桿菌屬如沃氏鹽桿菌(Haloferaxvolcanii)和嗜鹽菌NRC-1(HalobacteriumspeciesNRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)(Af)、激烈火球菌(Pyrococcusfurious)(Pf)、超嗜熱古菌(Ph)、超耐高溫?zé)岚艟?Pyrobaculumaerophilum)、火球菌(Pyrococcusabyssi)、硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)(Ss)、硫化葉菌(Sulfolobustokodaii)、Aeuropyrumpernix(Ap)、卩遼酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)和火山熱原體(Thermoplasmavolcanium)。保守變體:本文所用術(shù)語“保守變體”就翻譯組分而言指一種翻譯組分，如保守變體Ο-tRNA或保守變體0-RS，其功能與基礎(chǔ)組分Ο-tRNA或O-RS相似，但在序列上與參照Ο-tRNA或O-RS相比有所不同。例如，O-RS或保守變體O-RS可用非天然氨基酸如含有N-乙酰半乳糖胺部分的氨基酸氨酰化同源Ο-tRNA。在該例子中，所述O-RS及保守變體O-RS不具有相同的氨基酸序列。所述保守變體可具有，例如，一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多變異，只要保守變體與相應(yīng)的Ο-tRNA或O-RS互補(bǔ)。一些實(shí)施方案中，保守變體O-RS相比衍生出它的O-RS含有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代。一些實(shí)施方案中，保守變體O-RS相比衍生出它的O-RS含有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代，此外還保留了O-RS的生物學(xué)活性；例如，保守變體O-RS保留了衍生出它的親本O-RS分子至少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40%的生物學(xué)活性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述保守變體O-RS保留了衍生出它的親本O-RS分子至少50%的生物學(xué)活性。保守變體O-RS的保守性氨基酸取代可出現(xiàn)在該O-RS的任何結(jié)構(gòu)域內(nèi)，包括氨基酸結(jié)合口袋。選擇或篩選試劑:本文所用的術(shù)語“選擇或篩選試劑”指可利用其存在從一群組分中選擇或篩選某些特定組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可包括但不限于營(yíng)養(yǎng)素、抗生素、光的波長(zhǎng)、抗體、表達(dá)的多核苷酸等。選擇試劑可以使用不同的濃度、強(qiáng)度等。跑應(yīng):本文所用的術(shù)語“響應(yīng)”指本發(fā)明的tRNA識(shí)別選擇者密碼子并介導(dǎo)將結(jié)合于tRNA的非天然氨基酸摻入正在生長(zhǎng)的多肽鏈的過程。本文所用的術(shù)語“編碼”指利用多聚大分子或序列符號(hào)串上的信息指導(dǎo)產(chǎn)生第二分子或序列符號(hào)串的過程，所述第二分子或序列符號(hào)串與第一分子或序列符號(hào)串不同。如本文所述，該術(shù)語的使用范圍很寬，可用于許多方面。一方面，術(shù)語“編碼”描述DNA的半保守性復(fù)制過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈作為DNA依賴的DNA聚合酶的模板編碼出新合成的一條互補(bǔ)姊妹鏈。另一方面，術(shù)語“編碼”指利用一個(gè)分子中的信息指導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)與第一分子不同的第二分子的過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(如通過DNA依賴的RNA聚合酶參與的轉(zhuǎn)錄過程)。另外，RNA分子也可以編碼多肽，例如在翻譯過程中。當(dāng)該術(shù)語用于描述翻譯過程時(shí)，該術(shù)語也可以擴(kuò)展到編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在某些方面，RNA分子也可編碼DNA分子，例如通過RNA依賴的DNA聚合酶參與的反轉(zhuǎn)錄過程。在另一個(gè)方面，DNA分子可編碼多肽，應(yīng)當(dāng)理解的是，在這種情況下，術(shù)語“編碼”是指轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)過程。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了受20種天然氨基酸限制的翻譯系統(tǒng)固有局限性的解決方案。所述解決方案包括利用正交翻譯系統(tǒng)將具有新型特性的非天然氨基酸程序性定點(diǎn)生物合成摻入到蛋白質(zhì)中。我們?cè)诒疚闹忻枋隽诵碌慕M合物(例如新的氨酰-tRNA合成酶)和新的方法，以便響應(yīng)選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子、TAG)將各種非天然氨基酸高效率特異性地通過基因摻入到蛋白質(zhì)中。一些情況下，非天然氨基酸側(cè)鏈可被特異性地并區(qū)域選擇性地修飾。由于這些非天然氨基酸取代基的獨(dú)特反應(yīng)化學(xué)，可高度選擇性地修飾要摻入它們的蛋白質(zhì)。一些情況下，非天然氨基酸反應(yīng)基的優(yōu)點(diǎn)在于，它們對(duì)于體內(nèi)系統(tǒng)是完全外來的，從而提高了反應(yīng)選擇性。一些方面，可用允許進(jìn)行體外和體內(nèi)蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)并保留蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的相對(duì)溫和的反應(yīng)條件進(jìn)行修飾反應(yīng)。對(duì)與蛋白質(zhì)中非天然氨基酸偶聯(lián)的物質(zhì)的特性沒有特別限制，且可以是任何所需實(shí)體(entity)，例如，染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖類衍生物、聚合物(例如，聚乙二醇衍生物)、光交聯(lián)劑(photocrosslinker)、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素衍生物、樹脂、珠、第二蛋白或多肽(或其它)、多核苷酸(例如，DNA、RNA等)、金屬螯合齊U、輔因子、脂肪酸、碳水化合物等。其它方面，摻入的非天然氨基酸賦予摻入了它們的蛋白質(zhì)新的生物特性。例如，非天然氨基酸可以是熒光氨基酸、光囚禁的(photocaged)或光可活化的(photoactivatable)氨基酸、可作為供體或受體參與FRET對(duì)的氨基酸、氧化還原活性氨基酸、金屬螯合氨基酸等。一些方面，為證明(而非限制)本發(fā)明，這里公開的內(nèi)容證實(shí)，非天然氨基酸部分可被摻入模型蛋白質(zhì)。這并不是說所述非天然氨基酸只能被摻入這種模型蛋白質(zhì)。從這里的公開內(nèi)容顯見，非天然氨基酸可摻入任何感興趣的給定蛋白質(zhì)，這對(duì)于用于治療和研究目的的蛋白質(zhì)而言是有利的。我們開發(fā)了可在真細(xì)菌和酵母中發(fā)揮作用的新的正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶對(duì)，它們可響應(yīng)選擇者密碼子位點(diǎn)特異性摻入非天然氨基酸(例如，圖I提供的非天然氨基酸)。簡(jiǎn)言之，我們已經(jīng)鑒定了分別在大腸桿菌宿主細(xì)胞或酵母宿主細(xì)胞中用非天然氨基酸選擇性加載抑制基因tRNA的詹氏甲燒球菌(Methanococcusjanaschii)酪氨酰-tRNA合成酶和大腸埃希氏菌亮氨酰-tRNA合成酶的新的突變體。所涉及的這些tRNA-合成酶對(duì)可用來在蛋白質(zhì)中位點(diǎn)特異性摻入各種非天然氨基酸。在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸可以是程序性地，以便通過工程構(gòu)造編碼感興趣蛋白質(zhì)的多核苷酸而在任何所述位置進(jìn)行摻入，所述多核苷酸含有作為摻入非天然氨基酸信號(hào)的選擇者密碼子。ιΗ交tRNA/氨釀-tRNA合成酶技術(shù)理解與正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶對(duì)有關(guān)的活性有助于理解本發(fā)明的新的組合物和方法。有關(guān)正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶技術(shù)的討論可見，例如，國(guó)際公開WO2002/085923、TO2002/086075,WO204/09459、TO2005/019415、TO2005/007870和WO2005/007624。也可參見Wang和Schultz的“遺傳密碼的擴(kuò)展”(ExpandingtheGeneticCode),AngewandteChemieInt.Ed.,44(I):34-66(2005),其內(nèi)容通過引用全文納入本文。為在遺傳密碼中加入額外的反應(yīng)性非天然氨基酸，需要含有氨酰-tRNA合成酶和適當(dāng)tRNA的新的正交對(duì)，它們可在宿主翻譯機(jī)制中有效發(fā)揮作用，但是否與翻譯系統(tǒng)“正交”仍在討論中，這意味著它可不依賴于翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性合成酶和tRNA發(fā)揮作用。正交對(duì)的所需特性包括，僅編碼或識(shí)別特定密碼子如選擇者密碼子的tRNA不由任何內(nèi)源性tRNA編碼，且氨酰-tRNA合成酶僅用一種特定的非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?或“加載”)其同源tRNA。所述0-tRNA通常也不被內(nèi)源性合成酶氨酰化。例如，在大腸桿菌中，正交對(duì)將包括不與任何內(nèi)源性tRNA(例如，大腸桿菌中有40種)交叉反應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶和不被任何內(nèi)源性合成酶(例如，大腸桿菌中有21種)氨酰化的正交tRNA。這里描述的本發(fā)明提供了在真細(xì)菌如大腸桿菌或者酵母中進(jìn)行遺傳編碼并將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的正交對(duì)，其中所述正交組分不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制的內(nèi)源性大腸桿菌或酵母組分交叉反應(yīng)，但識(shí)別所需非天然氨基酸并響應(yīng)選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子、TAG)將其插入蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的正交組分包括衍生自詹氏甲烷球菌酪氨酰tRNA-合成酶的正交氨酰-tRNA合成酶和突變體酪氨酰tRNAeuA琥珀抑制基因，它們?cè)谡婕?xì)菌宿主細(xì)胞中作為正交對(duì)。本發(fā)明還提供了衍生自大腸桿菌亮氨酰-tRNA-合成酶的正交組分和突變體大腸桿菌亮氨酰tRNAeuA琥珀抑制基因，它們?cè)诮湍杆拗骷?xì)胞中作為正交對(duì)。在這些系統(tǒng)中，所述突變體氨酰-tRNA合成酶用其各自的非天然氨基酸而不用常見的20種氨基酸中的任何一種氨?；鲆种苹騮RNA。本發(fā)明提供了鑒定和產(chǎn)生其它正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶對(duì)，例如可用來將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的0-tRNA/0-RS對(duì)的組合物和方法。本發(fā)明的0-tRNA/0-RS對(duì)能夠介導(dǎo)將非天然氨基酸如圖I所示的非天然氨基酸摻入由多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其中所述多核苷酸含有例如在體外被Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。所述Ο-tRNA的反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇者密碼子并將其氨基酸(如圖I所示的非天然氨基酸)摻入多肽的該位點(diǎn)上。通常，本發(fā)明的正交氨酰-tRNA合成酶僅用一種特定的非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?或加載)其0-tRNA。將非天然氨基酸(例如，圖I中提供的非天然氨基酸)位點(diǎn)特異性摻入蛋白質(zhì)的能力有利于蛋白質(zhì)的研究以及能夠工程構(gòu)建具有新特性的蛋白質(zhì)。例如，含有一種或多種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的表達(dá)有助于通過特定的標(biāo)記研究蛋白質(zhì)，改變酶的催化功能，改變生物學(xué)活性或降低與基底的交叉反應(yīng)性，將一種蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)、小分子或生物分子交聯(lián)，降低或消除蛋白質(zhì)降解，提高蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期(例如，將引入的反應(yīng)位點(diǎn)PEG化或進(jìn)行其它修飾)等。IH交tRNA/ιΗ交氨酰-tRNA合成酶及它們組成的對(duì)適合產(chǎn)生含有一種或多種非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的翻譯系統(tǒng)通常描述于以下國(guó)際發(fā)明者P·舒爾茨,L·阿方達(dá),J·R·齊圖魯如,A·戴特斯,D·格羅夫,D·薩默爾,曹蘿麟,王江云,武寧,謝建明,曾華強(qiáng)申請(qǐng)人:斯克利普斯研究院