專利名稱：一種用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測變形球囊霉的引物對。
背景技術：
變形球囊霉(Glomusversiforme)是一種叢枝菌根(arbuscular mycohizal,AM)真菌，為寡營養(yǎng)活體微生物，能夠侵染部分陸生植物根系形成菌根。變形球囊霉能夠促進植物對各種營養(yǎng)元素的吸收，提高植物抗病抗旱能力等，而且在維持植物的多樣性和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性等方面起著極其重要的作用。目前，可以利用濕篩傾祈-蔗糖離心法從植物根際土壤中獲得AM真菌的單個孢 子，然后提取其DNA，再使用真核生物通用引物對LR1/NDL22將其擴增出來，通過測序知道其準確的基因序列。然而，從具有多種AM真菌的土壤樣品中，尚無法用現有的引物對從混合DNA樣品中直接擴增出具有變形球囊霉(Glomus versiforme)遺傳特性的25S rDNADl/D2可變區(qū)域的部分序列，給AM真菌侵染根系的檢測研究帶來了困難，并且以往的研究中所設計的引物對LR1/G. ver也不能特異性地從混合樣品中擴增出相應的特異性DNA片段。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決現有的引物對無法準確地從含有多種AM真菌的樣品中直接檢測出具有變形球囊霉(Glomus versiforme)遺傳特性的25S rDNA D1/D2可變區(qū)域部分序列，且現有引物對LR1/G. ver也不能特異性地從混合樣品中擴增出相應的特異性DNA片段的問題，而提供一種用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對。用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對命名為G. ver F/G. ver R，由正向引物G. ver F和反向引物G. verR組成，正向引物G. verF的堿基序列為5 ' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3 '，反向引物G. ver R的堿基序列為5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3,。本發(fā)明用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對是根據變形球囊霉25S rDNA中D2區(qū)特異性序列而設計。本發(fā)明用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對作為PCR擴增的引物，可從含有多種AM真菌的土壤樣品和菌根中快速準確地檢測其中是否含有變形球囊霉(Glomusversiforme)，含有變形球囊霉的能擴增出長度為537bp的變形球囊霉特異性目的片段。本發(fā)明引物為快速準確檢測土壤樣品中的變形球囊霉奠定了基礎。


圖I是具體實施方式
一中利用引物對G. ver F/G. ver R對變形球囊霉進行PCR擴增檢測的檢測結果圖，圖I中“ M”泳道標樣為Marker，“l(fā)”泳道標樣為引物對G.ver F/G. ver R的PCR擴增產物。圖2是具體實施方式
ニ中利用引物對LR1/G. ver對變形球囊霉進行PCR擴增檢測的檢測結果圖，圖2中“M”泳道標樣為Marker，“I”泳道標樣為引物對LR1/G. ver的PCR擴增產物。圖3是具體實施方式
三中分別利用引物對LR1/G. ver和引物對G.ver F/G. ver R對人為添加變形球囊霉的含有多種AM真菌的土壤樣品進行PCR擴增檢測的檢測結果圖，圖3中“M”泳道標樣為Marker，“I”泳道標樣為引物對LR1/G. ver的PCR擴增產物，“2”泳道標樣為弓I物對G. ver F/G. verR的PCR擴增產物。圖4中“M”泳道標樣為Marker，“I”泳道標樣為引物對G. ver F/G. ver R的PCR擴增產物，“2”泳道標樣為引物對LR1/G. ver的PCR擴增產物。
具體實施方式
本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對命名為G. ver F/G. verR,由正向引物G. ver F和反向引物G. ver R組成，正向引物G. ver F的堿基序列為5 ' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3 '，反向引物G. verR的堿基序列為5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3'。本實施方式用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對的PCR擴增體系為50μ L，由LOyL 模板 DNA, 4. OyL 濃度為 2. 5mmol/L 的 dNTP、5. O μ LlOX 緩沖液(含 Mg2+)、5· O μ L濃度為10pmol/L的引物(G. ver F和G. ver R的終濃度)、O. 2 μ L濃度為5U/μ L的Taq DNA
聚合酶和余量無菌雙蒸水組成。本實施方式用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對的PCR擴增反應條件預變性95°C、3min，變性 93°C、50s，退火 56°C、50s，延伸 72°C、50s，共 30 個循環(huán)，延伸 72°C、5min。利用本實施方式引物對G. ver F/G. ver R對變形球囊霉進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖I所示，從檢測結果中能夠清楚的看到擴增出一條為537bp的明顯特異性條帶。
具體實施方式
ニ 本實施方式采用現有引物對LR1/G. ver對變形球囊霉進行PCR擴增。引物對LR1/G. ver的正向引物LRl的堿基序列為5' -GCATATCAATAAGCGGAGGA-3'，引物對LR1/G. ver的反向引物G. ver的堿基序列為5' -GTCTATAACACTCTCCCGAAG-3'。本實施方式用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對的PCR擴增體系為50μ L，由LOyL 模板 DNA, 4. OyL 濃度為 2. 5mmol/L 的 dNTP、5. O μ LlOX 緩沖液(含 Mg2+)、5· O μ L濃度為10pmol/L的引物(LRl和G. ver的終濃度)、0· 2 μ L濃度為5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和余量無菌雙蒸水組成。PCR擴增反應條件預變性95 V、3min,變性93 V、Imin,退火58 °C、lmin,延伸72°C、lmin，共 30 個循環(huán)，延伸 72°C、5min。利用本實施方式引物對LR1/G. ver對變形球囊霉進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示。用引物對LR1/G. ver對單獨的變形球囊霉進行PCR擴增，同樣可以得到一條明顯的條帶(約579bp)。
具體實施方式
三本實施方式向含有多種AM真菌的土壤樣品中人為添加變形球囊霉，然后分別采用引物對LR1/G. ver和引物對G. ver F/G. ver R對其進行PCR擴增。引物對G. ver F/G. ver R的PCR擴增采用具體實施方式
一的方法，引物對LRl/G. ver的PCR擴增采用具體實施方式
ニ的方法。
本實施方式中含有多種AM真菌的土壤樣品于2011年9月取自東北林業(yè)大學林場。經檢測土壤樣品中本身至少含有3種AM真菌，為根內球囊霉(Glomusintraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和美 _ 盾抱囊霉(Scutellosporacalosporaノ。PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3所示。圖3中引物對LRl/G. ver擴增出了兩個條帶；而引物對G. ver F/G. ver R僅擴增出了一條目的條帶。說明引物對G. ver F/G. ver R的特異性優(yōu)于引物對LR1/G. ver，適用于快速準確地檢測變形球囊霉的存在。圖3中可以看出本實施方式用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對G. ver F/ G. ver R能夠準確擴增出變形球囊霉(Glomus versiforme)的25S rDNADl/D2可變區(qū)域部分序列片段。將圖3中2號泳道對應的序列片段與PGM-T載體連接后轉化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞并測序，測序結果為序列長度為537bp，并且經Blast分析，為變形球囊霉(Glomus versiforme)特異性序列。
具體實施方式
四本實施方式將3種AM真菌混合，其中包括根內球囊霉(Glomusintraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和美 _ 盾抱囊霉(Scutellosporacalospora),而不包括變形球囊霉(Glomus versiforme)。然后，分別采用引物對LR1/G. ver和引物對G. ver F/G. ver R對其進行PCR擴增。引物對G. ver F/G. ver R的PCR擴增采用具體實施方式
一的方法，引物對LRl/G. ver的PCR擴增采用具體實施方式
ニ的方法。PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖4所示。圖4中引物對LRl/G. ver擴增出了非特異性條帶；而引物對G. ver F/G. ver R沒有擴增出任何條帶。說明引物對G. verF/G. ver R的特異性明顯優(yōu)于引物對LR1/G. ver,適用于快速準確地檢測變形球
囊霉的存在。圖4的結果也驗證了用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對是根據變形球囊霉25SrDNA中D2區(qū)特異性序列而設計的這一點。從圖4的檢測結果看出用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對G.ver F/G. ver R的電泳結果清晰，沒有條帶，肯定了檢測樣品中不包含變形球囊霉。而引物對LR1/G. ver的特異性差，出現了非特異性條帶，無法判斷樣品中是否包含變形球囊霉，不能用于檢測含有多種AM真菌的樣品中是否有變形球囊霉(Glomusversiforme)的存在。
權利要求
1. 一種用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對，其特征在于用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對命名為G. ver F/G. ver R,由正向引物G. ver F和反向引物G. ver R組成,正向引物G. verF的堿基序列為5' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3'，反向引物G. verR的堿基序列為 5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3,。
全文摘要
一種用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對，它涉及一種用于檢測變形球囊霉的引物對。它解決了現有的引物對無法準確地從含有多種AM真菌的樣品中直接檢測出具有變形球囊霉(Glomus versiforme)遺傳特性的25S rDNA D1/D2可變區(qū)域部分序列，且現有引物對LR1/G.ver也不能特異性地從混合樣品中擴增出相應的特異性DNA片段的問題。用于檢測變形球囊霉的種特異性引物對命名為G.ver F/G.ver R，由正向引物G.ver F和反向引物G.ver R組成。本發(fā)明適用于變形球囊霉的檢測。
文檔編號C12R1/645GK102758013SQ201210227829
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權日2012年7月3日
發(fā)明者于春光, 接偉光, 楊明月, 白莉, 蔡柏巖 申請人:黑龍江東方學院