專利名稱：酰胺酶基因cmeH及其編碼蛋白質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用環(huán)境微生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，涉及酰胺酶基因cmeH及其編碼蛋白質(zhì)及其應(yīng)用，具體涉及降解氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草劑敵稗的酰胺酶基因cmeH及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
除草劑的使用在減輕農(nóng)業(yè)勞動(dòng)強(qiáng)度、保證農(nóng)業(yè)正常生產(chǎn)的同時(shí)，其殘留也帶來了嚴(yán)重的作物藥害問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國毎年農(nóng)田受除草劑藥害面積達(dá)到3000萬畝，其中嚴(yán)重藥害面積達(dá)到500萬畝，毎年造成幾十億元的損失，而抗除草劑轉(zhuǎn)基因是解決除草劑藥害的最佳途徑。氯代こ酰胺類除草劑是ー類高效、高選擇性的觸殺性除草剤，對(duì)禾本科雜草具有 非常顯著的殺除效果，其主要代表品種こ草胺和丁草胺是我國使用最多的三種除草劑中的兩種，年使用量分別超過5千噸和I萬噸。氯代こ酰胺類除草劑對(duì)魚類有較強(qiáng)的毒性，こ草胺和丁草胺被美國環(huán)保局定為B-2類致癌物，它們還有不易揮發(fā)、不易光解、土壌殘留期長(zhǎng)的特點(diǎn)氯代こ酰胺類除草劑對(duì)作物存在隱性藥害，對(duì)農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的損失。2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)こ酰胺是微生物降解氯代こ酰胺類除草劑的ー個(gè)重要中間代謝產(chǎn)物，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺含有苯環(huán)，對(duì)生物特別是哺乳動(dòng)物具有很強(qiáng)的毒性，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康有著巨大威脅。另外，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺對(duì)主要農(nóng)作物具有較強(qiáng)的毒害，對(duì)農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重的損失。獲得氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的降解菌株和降解基因在治理除草劑殘留，消除其藥害技術(shù)研發(fā)中具有以下作用和功能，(一)通過現(xiàn)代生物技術(shù)將降解基因?qū)胱魑飿?gòu)建相應(yīng)的能完全降解氯代こ酰胺類除草劑抗性轉(zhuǎn)基因作物，(ニ)用于土壤、水體中除草劑氯代こ酰胺類除草劑殘留中間產(chǎn)物的消除，(三)用于有用化工產(chǎn)品及藥物合成的生物轉(zhuǎn)化。因此降解基因在消除該類除草劑藥害及生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種酰胺酶基因cmeH。本發(fā)明的另一目的是提供該基因編碼蛋白質(zhì)。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應(yīng)用本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)ー個(gè)酰胺酶基因cmeH，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I?？寺≡摶虿扇〉牟呗詾轼B槍法(見圖I)。首先提取菌株DC-2 (CCTCC NO M2012190)的總DNA，總DNA采用Sau3AI部分酶切后和用BamHI酶切的質(zhì)粒pUC118酶連，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建菌株DC-2的總DNA文庫，將所有克隆子編號(hào)，挑每個(gè)單菌落一部分至96孔板靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入作用底物2-氯-N-(2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。培養(yǎng)后加入緩沖液和顯色劑(0. IM氨基比林30 u 1，0. IM鐵氰化鉀40U 1)，若生成2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的下游產(chǎn)物2，6-ニこ基苯胺，則溶液會(huì)顯深紅色，反之為黃緑色。得知陽性克隆子編號(hào)后可得到原始平板上的陽性克隆子。利用這種克隆方法可以對(duì)文庫進(jìn)行高通量的篩選。用上面的策略篩選鳥槍法構(gòu)建的基因文庫獲得一個(gè)能在加入200ppm2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(葡萄糖為碳源)上加入顯色劑后顯深紅色的陽性克隆子，進(jìn)ー步的降解實(shí)驗(yàn)表明該陽性克隆子能降解2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗。結(jié)果表明該陽性克隆子含有4262個(gè)堿基對(duì)，其中包含有23個(gè)潛在的ORF(大于150bp)，對(duì)這些潛在的ORF分別進(jìn)行亞克隆和序列比對(duì)分析，最后確定編碼目標(biāo)酰胺酶基因的大小為903bp，命名為cmeH，序列為SEQ ID NO. I。這是首次克隆到能降解氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的酰胺酶基因。所述的酰胺酶基因cmeH編碼的酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2。含有所述的酰胺酶基因cmeH的重組表達(dá)載體。所述的重組表達(dá)載體優(yōu)選將所述的酰胺酶基因cmeH插入pET_29a(+)的NdeI和EcoRI位點(diǎn)之間所得。含有所述的酰胺酶基因cmeH的基因工程菌，所述的基因工程菌優(yōu)選以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株。所述酰胺酶基因cmeH在降解和轉(zhuǎn)化氯代こ酰胺類除草劑中間體2_氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草劑敵稗中的應(yīng)用。所述的含有酰胺酶基因cmeH的重組表達(dá)載體在降解和轉(zhuǎn)化氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草劑敵稗中的應(yīng)用。所述酰胺酶基因cmeH在構(gòu)建降解氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草劑敵稗的轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。所述酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH在降解氯代こ酰胺類除草劑中間體2_氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗中的應(yīng)用。所述酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH在去除土壌、水體中氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果如下I.本發(fā)明篩選獲得一株鞘酯菌DC-2 (CCTCC NO M 2012190)，質(zhì)譜分析結(jié)果表明菌株DC-2可以把酰胺鍵斷裂而降解氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明用鳥槍法成功的從菌株DC-2 (CCTCC NO M 2012190)中克隆出酰胺酶基因cmeH。在GenBank比對(duì)結(jié)果表明該基因?yàn)椹`個(gè)新的基因，全長(zhǎng)(從起始密碼子到終止密碼子)為903bp，編碼300個(gè)氨基酸。2.本發(fā)明提供的酰胺酶CmeH能在Ihr內(nèi)完全降解100mg/L的氯代こ酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺，此外CmeH還能在3hr內(nèi)完全降解 100mg/L的除草劑敵稗。CmeH可用于構(gòu)建抗2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、敵稗的轉(zhuǎn)基因作物，也可用于土壤、水體中2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、敵稗殘留的去除及藥物合成的生物轉(zhuǎn)化，具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。


圖I酰胺酶基因cmeH克隆的策略圖。圖2酰胺酶基因cmeH在BL21 (pET_29a(+))中表達(dá)策略圖。圖3酰胺酶CmeH蛋白電泳圖譜；其中泳道I為蛋白質(zhì)marker,泳道2為純化的酰胺酶CmeH蛋白。圖4酰胺酶CmeH催化的降解2_氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺GC/MS圖譜；A :2_氯-N-(2-こ基_6_甲基苯基)こ酰胺的酶降解反應(yīng)液ニ氯甲烷提取物的GC
圖譜:保留時(shí)間為5. 53min的物質(zhì)ー級(jí)質(zhì)譜圖；C :保留時(shí)間為3. 73min的物質(zhì)ー級(jí)質(zhì)譜圖。圖5酰胺酶CmeH降解2_氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺的途徑。圖6CmeH催化的敵稗降解產(chǎn)物GC/MS圖譜；A :敵稗的酶降解反應(yīng)液ニ氯甲烷提取物的GC圖譜；B :保留時(shí)間為4. 38min的物質(zhì)ー級(jí)質(zhì)譜圖；圖7酰胺酶CmeH降解敵稗的途徑。生物材料保藏信息鞘酯菌DC-2 (Sphingobium quisquiliarum DC-2)，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012190，保藏日期為2012年5月30日。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II. I氯代こ酰胺類除草劑降解菌DC-2 (CCTCC NO M 2012190)的分離用來富集氯代こ酰胺類除草劑降解菌株的富集基質(zhì)取自江蘇昆山市綠利來農(nóng)藥廠農(nóng)藥廢水生化處理池的活性污泥，取活性污泥5. Og加入IOOml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，加入50mg じ1的丁草胺，30°C，180r .mirT1培養(yǎng)7d天，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到相同的培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，梯度稀釋富集液，取10_4 10_7稀釋度的富集液各0. ImL涂布于加有IOOmg じ1丁草胺的固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)4d后，挑取長(zhǎng)出的單菌落接種于含IOOmg じ1各種氯代こ酰胺類除草劑(丁草胺、こ草胺、甲草胺和異丙甲草胺)的培養(yǎng)基中，30°C，180r .min-1搖床培養(yǎng)5d,驗(yàn)證其降解效果。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基配方為5. Og葡萄糖，I. Og NH4NO3, I. OgNaCl, I. 5g K2HPO4, 0. 5g KH2PO4, 0. 2g MgSO4 *7H20，加水至 lL，pH 7. 0.固體培養(yǎng)基加 15. Og瓊脂。降解效果的驗(yàn)證方法在培養(yǎng)液中加入等體積的ニ氯甲烷進(jìn)行全量提取，劇烈振蕩后靜置分層，然后取Iml下層ニ氯甲烷揮發(fā)完全后，加入ImL甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0.22 pm)過濾。采用高效液相色譜測(cè)定提取液中丁氯代こ酰胺類除草剤、中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗的含量，液相色譜條件流動(dòng)相為甲醇水(80 :20, V/V), Zorbax C218 ODS Spherex 反相柱(5 u m, 4. 6mmX 250mm, Agilent,USA)，柱溫為室溫，紫外檢測(cè)器，測(cè)定波長(zhǎng)230nm，進(jìn)樣量20 iiL，流速為OJmL^mirT1。外標(biāo)法按峰面積定量。另外還可采用氣相色譜檢測(cè)提取液中氯代こ酰胺類除草剤、中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗的含量，檢測(cè)方法柱型BD-5MS石英毛細(xì)管柱(15mX0. 25mmX0. 25 u m);樣品進(jìn)樣量2y L ;分流比30 ;載氣氦氣；載氣流速lml/min ;進(jìn)樣ロ溫度為230°C，柱溫為200°C。一級(jí)質(zhì)譜條件離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子檢測(cè)；離子極性為負(fù)離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細(xì)管電壓為4000伏；干燥氣溫度330°C;干燥氣流速10. OL/min，霧化氣壓カ35psi，碰撞電壓135伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z) :300-500。ニ級(jí)子離子質(zhì)譜條件碰撞電壓90伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 30-4000從富集液中，分離到I株氯代こ酰胺類除草劑降解菌，命名為DC-2，該菌在3d內(nèi)對(duì)200mg じ1的丁草胺、こ草胺、甲草胺、敵稗和2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的降解率均達(dá)到90%以上。I. 2氯代こ酰胺類除草劑降解菌DC-2的鑒定和生物學(xué)特性菌株形態(tài)及生理生化特性測(cè)定參照文獻(xiàn)常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)(東秀珠主編，北京，科學(xué)出版社，2001)進(jìn)行。 菌株DC-2屬革蘭氏陰性菌，菌落黃色，邊緣整齊，菌落圓形并突起，濕潤(rùn)光滑，不透明，易挑??；菌體桿狀，沒有觀察到鞭毛。能利用甘露醇、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、D-核糖、N-こ酰葡萄糖胺。16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析菌株總DNA的提取采用高鹽法，并以總DNA作為模板，進(jìn)行16S rRNA基因序列的擴(kuò)增。用于擴(kuò)增反應(yīng)的引物為ー對(duì)通用引物，上游引物5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ ID No. 5)，下游引物5' -TACCTTGTTACGACTT-3，(SEQID No. 6) o 25 u L PCR 反應(yīng)體系為模板 I ii L，dNTP (25mmol/L) 2 y L，引物(lmmol/L)各I u L, IOXTaq 緩沖液 2. 5 U L, Mg2+(25mmol/L) I. 5u L, Taq 酶(5U/U L) 0. 3 U L,超純水15. 7 iiし聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件95°C預(yù)變性5min ;94°C變性0. 5min，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)30次；72°C延伸lOmin。采用PCR回收試劑盒(AXYGEN公司)回收16S rDNA的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小(I. 5kb左右)，TA克隆后進(jìn)行測(cè)序(由BI0AISA公司完成)。測(cè)序結(jié)果通過在線分析，與RDP數(shù)據(jù)庫(https ://rdp. cme. msu. edu/)中的模式菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比較。結(jié)果顯示菌株DC-2與鞘酯菌屬同源性最高，與Sphingobium quisqui liarum P25 (T)的同源性達(dá)到100%,結(jié)合生理生化特征將該菌鑒定為鞘酯菌屬，將該菌株送交位于中國武漢，武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC NO M 2012190，保藏日期為2012年5月30日。實(shí)施例2菌株DC-2的培養(yǎng)方法I)將DC-2 (CCTCC NO M 2012190)試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10% (v/v,以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接種入裝液量為70%的500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；3)將種子液按10% (v/v,以培養(yǎng)基體積為基準(zhǔn))的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1.0，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時(shí)間為50小吋，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。以上所用的發(fā)酵培養(yǎng)基、種子罐培養(yǎng)基及生產(chǎn)罐培養(yǎng)基相同，配方為葡萄糖0. lwt%，蛋白胨 0. 5wt%，酵母膏 0. 25wt%, pH7. 2-7. 5。實(shí)施例3酰胺酶基因cmeH的克隆(策略圖見圖I)3. I細(xì)菌基因組總DNA的提取菌株DC-2 (CCTCC NO M 2012190)在LB培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)后，采用CTAB法提取高純度、大片段的DC-2的基因組總DNA，溶于TE緩沖液(pH8. 0)中，置于_20°C保藏，具體方法參考F 奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。3. 2pUCl 18 (BamHI)購買于寶生物工程(大連)有限公司。3. 3 總 DNA 的酶切 Sphingobium quisqui liarum DC-2 總 DNA 米用 Sau3AI 部分酶切。 3.4DNA 的回收酶切后的總DNA通過電泳(TAE緩沖液)進(jìn)行純化，采用axygenbiosciences (China)回收試劑盒進(jìn)行回收，回收的 DNA 溶于 10mmol /I,的 Tris *HC1 (pH8. 0)中，置于-20°C保藏。3. 5 酶連建立如下反應(yīng)體系
|)l；('Ii SitaIID0.1 pg
總DNA片段0.1 pg
IOx連接酶緩沖液I pl
T4 DNA連接_0.5加雙蒸水個(gè)IOpi16°C溫育 12 小時(shí)。3. 6轉(zhuǎn)化及篩選取10 ill酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200 ill大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa，Code:D9057)，具體方法參照F.奧斯伯等編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》P23。涂布含有100mg/kg氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)24小吋。將所有克隆子編號(hào)，挑每個(gè)單菌落一部分至96孔板靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入作用底物2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。培養(yǎng)后加入緩沖液和顯色劑(0. IM氨基比林30 u 1，0. IM鐵氰化鉀40 u I )，若生成2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的下游產(chǎn)物2，6- ニこ基苯胺，則溶液會(huì)顯深紅色，反之為黃緑色。得知陽性克隆子編號(hào)后可得到原始平板上的陽性克隆子。利用這種克隆方法可以對(duì)文庫進(jìn)行高通量的篩選。進(jìn)ー步驗(yàn)證克隆子能否降解2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗?？寺∽訉?duì)2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗的降解試驗(yàn)方法降解效果的驗(yàn)證方法在培養(yǎng)液中加入等體積的ニ氯甲烷進(jìn)行全量提取，劇烈振蕩后靜置分層，然后取Iml下層ニ氯甲烷揮發(fā)完全后，加入ImL甲醇溶解(色譜純)，用濾膜(孔徑0. 22 pm)過濾。采用高效液相色譜測(cè)定提取液中丁氯代こ酰胺類除草剤、中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗的含量，液相色譜條件流動(dòng)相為甲醇水(80 20,V/V), Zorbax C218 ODS Spherex 反相柱(5 u m, 4. 6mm X 250mm, Agilent, USA),柱溫為室溫，紫外檢測(cè)器，測(cè)定波長(zhǎng)230nm，進(jìn)樣量20y L，流速為0. SmL min'外標(biāo)法按峰面積定量。另外還可采用氣相色譜檢測(cè)提取液中氯代こ酰胺類除草剤、中間體2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草劑敵稗的含量，檢測(cè)方法柱型BD-5MS石英毛細(xì)管柱(15mX0. 25mmX0. 25 u m);樣品進(jìn)樣量2 u L ;分流比30 ;載氣:氦氣;載氣流速lml/min ；進(jìn)樣ロ溫度為230°C，柱溫為200°C。一級(jí)質(zhì)譜條件離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子檢測(cè)；離子極性為負(fù)離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細(xì)管電壓為4000伏；干燥氣溫度330°C;干燥氣流速10. OL/min,霧化氣壓カ35psi，碰撞電壓135伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z)300-500。ニ級(jí)子離子質(zhì)譜條件碰撞電壓90伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 30-40003. 7基因核苷酸序列測(cè)定將3. 6中獲得的能降解2-氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺和敵稗的陽性克隆子委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，酰胺酶基因cmeH的核苷酸序列為 SEQ ID NO. 1，全長(zhǎng)為903bp。根據(jù)酰胺酶基因cmeH核苷酸序列所推斷的300個(gè)氨基酸序列為SEQ ID NO. 2，理論大小為31. 6kda。實(shí)施例4酰胺酶基因cmeH在BL21(pET_29a(+))中的高效表達(dá)(策略圖見圖2)4. I酰胺酶基因的PCR擴(kuò)增以if 向引物5’ -GGAATTCCATATGGGTACTTCACCCCAG-3’ (SEQ ID NO. 3)和反向引物5 ^ CCGGAATTCGGCGCCCTTGAACCAC-3，(SEQ ID NO. 4)為引物，用 PCR 從 SphingobiumDC-2(CCTCC NO M 2012190)基因組DNA中擴(kuò)增出酰胺酶基因片段。擴(kuò)增體系
Primer ftorfll (5U/|J)0,5 pi
> X PCR Buffer 11 (Mg:_+Plus)10 |d
dNTP Mixture(各2.5mM)5 nl
校板 DN A10 Hg
(20pM)_
反向引物(20pM)I |il
滅菌蒸 水1150_PCR擴(kuò)增程序a. 95°C 變性 3min ；b. 95°C變性 I. 5min，53°C退火 0. 5min，72°C延伸 I. 5min，進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；c. 72°C延伸lOmin，冷卻到室溫。4. 2PCR 產(chǎn)物用 NdeI 和 EcoRI 雙酶切。酶切體系Nde II U IEcoRII U IDNA^lug
滅菌的蒸餾水加至20 U I在37°C水浴中，反應(yīng)3h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳切膠回收。4. 3pET-29a(+)用 NdeI 和 EcoRI 雙酶切(參考 2. 2)。4. 4 轉(zhuǎn)化4. 2中的回收片段和4. 3中酶切好的pET_29a(+)進(jìn)行酶連(參考3. 5)。酶連好的含酰胺酶基因cmeH的pET-29a(+)重組質(zhì)粒pET_29a (+)-cmeH的pET_29a(+)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21 (DE3)獲得重組微生物BL21 (CmeH)。4. 5CmeH的表達(dá)、純化和功能驗(yàn)證BL21 (CmeH)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600nm為0. 6到0. 8之間，加IPTG至濃度 lmM，30°C培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)。IOOml菌液離心，用IOml (50mM，pH 7. 0) PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎(Auto Science, UH-650B ultrasonic processor, 30%intensity) 5 分鐘，離心，收集上清，用鎳離子親和層析柱對(duì)CmeH進(jìn)行了純化，得酰胺酶CmeH，CmeH電泳圖譜見圖3，其條帶大小和理論預(yù)測(cè)的大小(31. 6kda)相一致。4. 6CmeH 活力測(cè)定酶活反應(yīng)體系50mM磷酸緩沖液(pH 7. 0)，0. 2mM靶標(biāo)底物(2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敵稗)、反應(yīng)酶量(4. 5中純化所得)50iil，30°C反應(yīng)20min。每個(gè)反應(yīng)以加入酶開始計(jì)時(shí)，用3ml ニ氯甲烷終止反應(yīng)，分層后有機(jī)相經(jīng)無水硫酸鈉脫水，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗含量用反向HPLC測(cè)定(具體方法見3. 6)。ー個(gè)酶活力単位(U)定義為在pH 7.0，溫度30 °C條件下，每分鐘催化減少lymol2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敵稗所需的酶量。降解試驗(yàn)表明純化后的CmeH能在3hr內(nèi)降解100mg/kg的2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敵稗，酶學(xué)試驗(yàn)表明CmeH對(duì)2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗的比酶活分別為67和55U/mg protein。4. 7代謝產(chǎn)物的確定4. 6中的2-氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺和敵稗的酶反應(yīng)液的ニ氯甲烷提取物經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笕苡贗OOyL甲醇，利用GC/MS測(cè)定反應(yīng)液中的代謝產(chǎn)物。檢測(cè)方法柱型BD-5MS石英毛細(xì)管柱(15mX0. 25mmX0. 25iim);升溫條件柱子初始溫度50°C，維持lmin，以10°C /min升溫至210°C，再保持2min，再以20°C min-1升溫至240°C，再維持IOmin ;樣品進(jìn)樣量2ii L ;分流比30 ;載氣氦氣；載氣流速lml/min ;進(jìn)樣ロ溫度為250°C。質(zhì)譜操作條件離子源為EI源；離子源溫度250°C ;—級(jí)質(zhì)譜條件離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子檢測(cè)；離子極性為負(fù)離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細(xì)管電壓為4000伏；干燥氣溫度330°C ;干燥氣流速10. 0L/min，霧化氣壓カ35psi，碰撞電壓135伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z) :300-500。ニ級(jí)子離子質(zhì)譜條件碰撞電壓90伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z):30-400。一級(jí)質(zhì)譜條件 離子檢測(cè)方式為多反應(yīng)離子檢測(cè)；離子極性為負(fù)離子；離子化方式為電噴霧離子化；毛細(xì)管電壓為4000伏；干燥氣溫度330°C;干燥氣流速10. 0L/min，霧化氣壓カ35psi，碰撞電壓135伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z):300-500。ニ級(jí)子離子質(zhì)譜條件碰撞電壓90伏；質(zhì)量掃描范圍(m/z) :30-400o2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敵稗的酶降解反應(yīng)液的ニ氯甲烷提取物的GC/MS圖譜見圖4A、圖6A，由圖譜數(shù)據(jù)分析得出2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)乙酰胺、敵稗分別經(jīng)CmeH水解斷裂酰胺鍵后生成2-こ基-6-甲基苯胺(圖4C)、3，4- ニ氯苯胺(圖6B)，生化反應(yīng)途徑見圖5、圖7。以上實(shí)施例中使用的微生物來源如下pUCl 18 (BamHI)購自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌DHDH5 a購 自寶生物工程(大連)有限公司，大腸桿菌高表達(dá)載體pET_29a(+)購自Novegen公司，表達(dá)宿主菌大腸桿菌BL21(DE3) 購自上海英駿生物技術(shù)有限公司。
權(quán)利要求
1.一個(gè)酰胺酶基因cmeH，其特征在于核苷酸序列為SEQ ID NO. I。
2.權(quán)利要求I所述的酰胺酶基因cmeH編碼的酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH，其特征在于氨基酸序列為 SEQ ID NO. 2。
3.含有權(quán)利要求I所述的酰胺酶基因cmeH的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于將權(quán)利要求I所述的酰胺酶基因cmeH插入pET_29a(+)的NdeI和EcoRI位點(diǎn)之間所得。
5.含有權(quán)利要求I所述的酰胺酶基因cmeH的基因工程菌，所述的基因工程菌優(yōu)選以大腸桿菌BL21(DE3)為出發(fā)菌株。
6.權(quán)利要求I所述酰胺酶基因cmeH在降解和轉(zhuǎn)化氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草劑敵稗中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求I所述酰胺酶基因cmeH在構(gòu)建降解氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草劑敵稗的轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2所述酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH在降解氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草劑敵稗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2所述的酰胺酶蛋白質(zhì)CmeH在去除土壤、水體中氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草劑敵稗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了酰胺酶基因cmeH及其編碼的蛋白質(zhì)及其應(yīng)用。本發(fā)明酰胺酶基因cmeH全長(zhǎng)為903bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼產(chǎn)物酰胺酶CmeH含300個(gè)氨基酸，序列為SEQ ID NO.2。CmeH能降解氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草劑敵稗。酰胺酶基因CmeH可用于構(gòu)建可降解氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草劑敵稗的轉(zhuǎn)基因作物，也可用于土壤、水體中氯代乙酰胺類除草劑中間體2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草劑敵稗的殘留的去除及新型藥物合成的生物轉(zhuǎn)化，具有非常重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102757972SQ201210227768
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者何健, 李怡, 李順鵬, 陳青 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)