專利名稱：表達(dá)多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物表達(dá)載體，尤其涉及一種表達(dá)多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及該植物表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物的培育和篩選中的應(yīng)用，屬于植物表達(dá)載體的構(gòu)建及應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前植物轉(zhuǎn)基因研究主要是轉(zhuǎn)化單個(gè)基因，功能單一，作用有限。多基因共同轉(zhuǎn)化已成解決此問題的一條途徑。構(gòu)建多基因植物轉(zhuǎn)化載體是實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)轉(zhuǎn)化植物的基礎(chǔ)與重要步驟，幾乎所有的植物轉(zhuǎn)基因研究都是從構(gòu)建載體開始。以往多基因表達(dá)載體的構(gòu)建受限制性酶切位點(diǎn)限制，載體攜帶基因數(shù)量少，有些構(gòu)建過程轉(zhuǎn)化還需要去磷酸化、磷酸化、粘性末端補(bǔ)平等操作，步驟繁瑣，難度較高。而有些載體引入了“gateway技術(shù)”或采用“歸位內(nèi)切酶結(jié)合Cre重組技術(shù)”，雖然部分解決上述問題，但也存在成本較高、需要特殊的中間載體、特殊菌株等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種表達(dá)單個(gè)或多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體；本發(fā)明目的之二是提供一種構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的方法；本發(fā)明目的之三是將所述的植物表達(dá)載體應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育或篩選。
本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的表達(dá)單個(gè)或多個(gè)外源基因的植物表達(dá)載體，包括植物轉(zhuǎn)化載體P1354、克隆載體P1964A以及待轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)目的基因；其中，pl354為Ti質(zhì)粒，源自載體pCAMBIA1301，在原有pCAMBIA1301載體的BamHI與EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間引入一個(gè)帶有Bspl20 I酶切位點(diǎn)的片段；pl354載體上有Bspl20 I與Xba I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；pl354帶有植物篩選基因hptll。所述克隆載體pl964A起源于克隆載體pUCm-T ;該載體帶有CaMV35S啟動(dòng)子及NOS終止序列，在35S啟動(dòng)子及NOS終止序列之間有2個(gè)Xcm I酶切位點(diǎn)，經(jīng)單酶切形成T載體與目的基因PCR產(chǎn)物相連，構(gòu)成完整的目的基因開放閱讀框(0RF)，分別在開放閱讀框的兩側(cè)依次攜帶有酶切位點(diǎn)Not I與Bsp120 I、Spe I及Nhe I酶切位點(diǎn)。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建所述表達(dá)單個(gè)或多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體的方法，包括以下步驟(I)分別構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體pl354或克隆載體pl964A ；(2)用內(nèi)切酶Xcm I酶切克隆載體pl964A產(chǎn)生2個(gè)含T的3’突出端，形成T載體，與帶有含A的3’突出端的第I個(gè)目的基因PCR產(chǎn)物相連，將第I個(gè)目的基因擴(kuò)增片段完整并正向連入克隆載體中，構(gòu)建成包括CaMV35S啟動(dòng)子+第I個(gè)目的基因+NOS終止序列的開放閱讀框；利用Not I與Nhe I雙切攜帶第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框(ORF)的克隆載體，回收第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框(ORF)片段，備用；(3)利用Bspl20 I與Xba I雙切pl354，回收pl354酶切片段；將pl354酶切片段與步驟(2)回收的第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框(ORF)片段連接，pl354上原有的Bspl20I與Xba I位點(diǎn)及目的基因表達(dá)開放閱讀框兩端的Not I與Nhe I位點(diǎn)消失，而新構(gòu)建成的植物表達(dá)載體上帶有的Bspl20 I與Spe I位點(diǎn)，經(jīng)過酶切又可以與第2個(gè)帶有Not I與Nhe I位點(diǎn)的第2個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框(ORF)片段相連，如此不斷重復(fù)，構(gòu)建出攜帶多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體。其中，所述的植物轉(zhuǎn)化載體pl354的構(gòu)建方法包括在pCAMBIA1301載體的BamHI與EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間引入一個(gè)帶有Bspl20 I酶切位點(diǎn)的片段，即得。pl354為Ti質(zhì)粒，源自載體pCAMBIA1301。自身帶有植物篩選基因hptll，用于植物轉(zhuǎn)化。在原有PCAMBIA1301載體的BamH I與EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間引入一個(gè)帶有Bspl20 I酶切位點(diǎn)的片段。pl354載體上有Bspl20 I與Xba I兩個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)內(nèi)切酶Bspl20 I與Xba I雙酶切后，會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)不同的粘性末端，與克隆載體上相應(yīng)同尾酶末端片段連接后，位點(diǎn)會(huì)消失。所述克隆載體pl964A的構(gòu)建方法包括先從載體pCAMBIA1302上克隆了帶有CaMV35S啟動(dòng)子、GFP綠色熒光蛋白基因及NOS終止序列并引入了新酶切位點(diǎn)的片段；用一個(gè)兩端都帶有Xcm I位點(diǎn)的片段取代GFP綠色熒光蛋白基因，形成一個(gè)新片段，再通過酶切、連接把新片段連到PUCm-T上得到克隆載體pl964A。可以采用諸如熱激法等方式把本發(fā)明所構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化植物，經(jīng)過潮霉素(Hyg)抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明植物表達(dá)載體利用同尾酶之間酶切后有相同的粘性末端，彼此連接后，原有酶切位點(diǎn)消失的特點(diǎn)構(gòu)建攜帶多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體，發(fā)明植物表達(dá)載體可攜帶長達(dá)30kb的外源片段，對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明將目的基因PCR片段經(jīng)過A-T克隆，直接連入克隆載體，完成目的基因的開放閱讀框(ORF)的構(gòu)建，經(jīng)簡單的PCR鑒定，即可用于進(jìn)一步的植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建。本發(fā)明多基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建過程中，采用Not I/Bspl20 I與Spe I/Xba I/Nhe I兩個(gè)不同的同尾酶系統(tǒng)同時(shí)應(yīng)用，利用同尾酶連接后原有酶切位點(diǎn)消失的特性，使酶切后的載體或片段的兩端始終是不同的粘段，解決了以往載體內(nèi)切酶位點(diǎn)有限的問題，同時(shí)也避免了載體連接過程中的自連，無需再進(jìn)行粘性末端的磷酸化處理，也無需中間載體及特殊的工程菌株，回避了大多數(shù)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，只需進(jìn)行酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)步驟。簡化了操作步驟與降低實(shí)驗(yàn)難度，技術(shù)成熟可靠。成本低廉，在普通的實(shí)驗(yàn)條件下即可完成，便于推廣，具有較大的科研與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。雖然在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指包含本發(fā)明多核苷酸的細(xì)胞，而不管使用何種方法進(jìn)行插入以產(chǎn)生重組宿主細(xì)胞，例如直接攝取、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f配對或所屬領(lǐng)域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持為例如質(zhì)粒的非整合載體或者可整合入宿主基因組中。、
術(shù)語“多核苷酸”意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似于參考核酸的結(jié)合特性并以類似于天然產(chǎn)生的核苷酸的方式進(jìn)行代謝。除非另外特定限制，否則所述術(shù)語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術(shù)中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限于)簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產(chǎn)生其中一個(gè)或一個(gè)以上所選(或所有)密碼子的第3位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實(shí)現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8:91-98(1994))。術(shù)語“外源DNA”指該DNA序列對該特定的宿主細(xì)胞而言屬于外來的來源，或若來自相同的原始來源但對該原始序列進(jìn)行了修飾或改造。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”:將異源性DNA序列引入到宿主細(xì)胞或有機(jī)體的方法。 術(shù)語“表達(dá)”內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。術(shù)語“編碼序列”:轉(zhuǎn)錄成RNA的核酸序列。術(shù)語“植物表達(dá)載體”一種或多種用于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化的DNA載體；本領(lǐng)域中這些載體常被稱為二元載體。二元載體連同具有輔助質(zhì)粒的載體是大多常用于土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的。二元載體通常包括=T-DNA轉(zhuǎn)移所需要的順式作用序列、經(jīng)工程化處理以便能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記物，待轉(zhuǎn)錄的異源性DNA序列等。


圖I克隆載體pl964A圖譜。圖2植物轉(zhuǎn)化載體P1354圖譜。圖3本發(fā)明表達(dá)多各目的基因的植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建過程的示意圖。圖4載體pl3546871的PCR鑒定；M maker ；A :基因BtCryIIIA的特異擴(kuò)增片段；B :基因BtCryIA的特異擴(kuò)增片段。圖5轉(zhuǎn)化植株(1-5)經(jīng)PCR檢測；出現(xiàn)與陽性對照(CK+)相同大小的片段，而非轉(zhuǎn)基因植株(CK-)無此片段；初步證明為轉(zhuǎn)基因植株。也證明了本發(fā)明植物表達(dá)載體可以用于植物轉(zhuǎn)化。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)材料I.質(zhì)粒pUC18(購自大連TaKaRa公司)、pBR322(購自大連TaKaRa公司)、pUCm_T(購自上海生工)、pET28a (購自 Novagen 公司)、ρΒΙ121 (購自 Invitrogen 公司)、pCAMBIAl301和 pCAMBIA1302(購自 CambiaLabs)2.菌株大腸桿菌JM109菌株(購自大連TaKaRa公司)、DHlOB菌株(購自上海生工)3.各種試劑及內(nèi)切酶購自大連TaKaRa公司、new England biolabs (NEB)、上海生工。實(shí)施例I克隆載體pl964A的構(gòu)建
I.載體pl302a的合成用41# 引物F AGATCTCGACTTTAAGTCTGTCATGCCATCCGTA (SEQ ID No. I)R GGTGACCGACTTTAAGTCTTTGCCTTCCTGTTTT (SEQ ID No. 2)以pUC18為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)300bp左右的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體p41 ;用BglII與BstEII分別對p41與pCAMBIA1302進(jìn)行雙酶切?；厥誔41的小片段以及pCAMBIA1302的大片段，將二者連接。合成載體pl302a。2.載體 pl302a30 的合成用30# 引物F AAGCTTAGATCTCTTGGATCAGATTGTCGT(SEQ ID No. 3)R GGATCCAGAGTCCCCCGTGTTCT(SEQ ID No. 4)以pCAMBIA1302為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)597bp的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體p30。用HindIII與BamHI分別對p30與pl302a進(jìn)行雙酶切?；厥誴30的小片段以及Pl302a的大片段，將二者連接，合成載體pl302a30。3.載體p35a的合成用4#引物F CTTGGATCAGATTGTCGT(SEQ ID No. 5)R TCCCGATCTAGTAACATA(SEQ ID No. 6)以pCAMBIA1302為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)1622bp的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體p4。用HindIII與BstEII分別對p4與pl302a30進(jìn)行雙酶切?；厥誔l302x30的小片段以及p4的大片段，將二者連接，合成載體p35a。4.載體p2858的合成用58# 引物F GGATCCTACGGCTACACTAGAAGG(SEQ ID No. 7)R GGTCACCGAAACGCTGGTGAAAGT(SEQ ID No. 8)以pBR322為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)1122bp的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體P58。用BamHI與BstEII分別對p58與pET28a進(jìn)行雙酶切?；厥誴58的小片段以及pET28a的大片段，將二者連接，合成載體P2858。5.載體p285859的合成用59# 引物F GATATCGGGCCCAGATCTCTTCGGTTTCCGTGTT(SEQ ID No. 9)R CTGCAGTGATGCCTCCGTGTAA(SEQ ID No. 10)以pET28a為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)300bp左右的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體p59。用BglII與EcoRV分別對p59與p2858進(jìn)行雙酶切?；厥誴59的小片段以及P2858的大片段，將二者連接，合成載體P285859。6.載體p35A的合成用BglII與PstI分別對p285859與p35a進(jìn)行雙酶切。回收p35a的小片段以及P285859的大片段，將二者連接，合成載體p35A。7.克隆載體P6435A的合成用64# 引物F GGTCACCGGGCCCTTCGGTTTCCGTGTT(SEQ ID No. 11)R GATATCGCTAGCACTAGTGATGCCTCCGTGTAA(SEQ ID No. 12)
以pET28a為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一個(gè)300bp左右的片段，將此片段連入pUCm-T中合成載體p64。用BstEII與EcoRV分別對p64與p35A進(jìn)行雙酶切?；厥誴64的小片段以及P35A的大片段，將二者連接，合成克隆載體P6435A。8.克隆載體P1964A的合成用XhoI與HpaI雙切p6435A,回收小片段。用XhoI與EcoRV雙切pUCm-T,回收大片段。二者相連合成P1964A。實(shí)施例2植物轉(zhuǎn)化載體P1354的構(gòu)建I.載體p51的合成用51# 引物F GAATTCGGGCCCTCAGTTCGGTGTAGGTC(SEQ ID No. 13)R GGATCCATAGACTGGATGGAGGC(SEQ ID No. 14)以pUC18為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條長800bp左右的片段。將此片段連入pUCm-T中合成載體p51。2.植物轉(zhuǎn)化載體pl354的合成用BamHI與EcoRI分別對p51與pCAMBIA1301進(jìn)行雙酶切。回收p51的小片段及PCAMBIA1301的大片段，將二者連接，合成植物轉(zhuǎn)化載體pl354。實(shí)施例3攜帶BtCryIA與BtCryIIIA兩個(gè)殺蟲毒蛋白基因的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建I.植物轉(zhuǎn)化載體P13546871的構(gòu)建采用一般PCR反應(yīng)體系，分別以殺蟲毒蛋白基因BtCryIA基因與BtCryIIIA基因?yàn)槟０澹鱌CR ；PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性10min，94°C變性30s，48-60。。退火40s，72°C延伸I. 5min,20個(gè)循環(huán)；72°C延伸20min。反應(yīng)結(jié)束，通過1% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片段有無及長度，切膠并利用凝膠回收試劑盒回收片段，引物見表I。表I部分引物
片段長度
編號(hào)引物名稱__Tm値(flC )(bp)
35# 35Send FATTTCATTTGGAGAGAACACGG58.6—
68# btl FATGGATAACAATCCGAACATCA57.67mi
bt I RCTACTCGAGTGTTGCAGTAACTGG58.8
權(quán)利要求
1.表達(dá)單個(gè)或多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體，其特征在于，包括植物轉(zhuǎn)化載體P1354、克隆載體pl964A和待轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)目的基因。
2.按照權(quán)利要求I所述的植物表達(dá)載體，其特征在于所述植物轉(zhuǎn)化載體P1354源自載體PCAMBIA1301，通過在pCAMBIA1301載體的BamH I與EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間引入一個(gè)帶有Bspl20 I酶切位點(diǎn)的片段構(gòu)建得到； 所述克隆載體P1964A起源于克隆載體pUCm-T ；pl964A載體帶有CaMV 35S啟動(dòng)子及NOS終止序列，在CaMV 35S啟動(dòng)子和NOS終止序列之間有2個(gè)XcmI酶切位點(diǎn)；pl964A載體攜帶有Not I與Bspl20 I、Spe I及Nhe I酶切位點(diǎn)。
3.按照權(quán)利要求I或2所述的植物表達(dá)載體，其特征在于所述的目的基因是殺蟲毒蛋白基因BtCryIA或/和殺蟲毒蛋白基因BtCrylllA。
4.一種構(gòu)建權(quán)利要求I或2所述的植物表達(dá)載體的方法，包括以下步驟 (O分別構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體P1354和克隆載體pl964A ； (2)用內(nèi)切酶XcmI酶切克隆載體P1964A產(chǎn)生2個(gè)含T的3’突出端，形成T載體，與帶有含A的3’突出端的第I個(gè)目的基因PCR產(chǎn)物相連，將第I個(gè)目的基因擴(kuò)增片段完整并正向連入克隆載體中，構(gòu)建成包括CaMV35S啟動(dòng)子+第I個(gè)目的基因+NOS終止序列的開放閱讀框；利用Not I與Nhe I雙切攜帶第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框的克隆載體，回收第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框片段，備用； (3)利用Bspl20I與Xba I雙切植物轉(zhuǎn)化載體pl354，回收pl354的酶切片段；將pl354的酶切片段與步驟(2)回收的第I個(gè)目的基因表達(dá)開放閱讀框片段連接；新合成的植物表達(dá)載體上帶有的Bspl20I與SpeI位點(diǎn)經(jīng)過酶切又與第2個(gè)帶有Not I與Nhe I位點(diǎn)的目的基因表達(dá)開放閱讀框片段相連，如此不斷重復(fù)，構(gòu)建出攜帶多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的植物轉(zhuǎn)化載體P1354的構(gòu)建方法包括在PCAMBIA1301載體的BamH I與EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間引入一個(gè)帶有Bspl20 I酶切位點(diǎn)的片段，即得。
6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述克隆載體P1964A的構(gòu)建方法包括從載體pCAMBIA1302上克隆帶有CaMV 35S啟動(dòng)子、GFP綠色熒光蛋白基因及NOS終止序列并引入了新酶切位點(diǎn)的片段；用一個(gè)兩端都帶有Xcm I位點(diǎn)的片段取代GFP綠色熒光蛋白基因，形成一個(gè)新片段，把新片段連到PUCm-T上得到克隆載體P1964A。
7.含有權(quán)利要求I或2所述的植物表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
9.權(quán)利要求I或2所述的植物表達(dá)載體將目的基因轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中的應(yīng)用。
10.按照權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的目的基因包括殺蟲毒蛋白基因BtCryIA或/和殺蟲毒蛋白基因BtCrylllA。
全文摘要
本發(fā)明公開了表達(dá)多個(gè)目的基因的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。所述植物表達(dá)載體包括植物轉(zhuǎn)化載體p1354、克隆載體p1964A以及待轉(zhuǎn)化的一個(gè)或多個(gè)目的基因。本發(fā)明利用同尾酶連接后原有酶切位點(diǎn)消失的特性，使酶切后的載體或片段的兩端始終是不同的粘段，解決了現(xiàn)有的載體內(nèi)切酶位點(diǎn)有限的問題，同時(shí)也避免了載體連接過程中的自連，無需再進(jìn)行粘性末端的磷酸化處理，也無需中間載體及特殊的工程菌株，回避了大多數(shù)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，簡化了操作步驟并降低了實(shí)驗(yàn)難度。本發(fā)明植物表達(dá)載體可攜帶長達(dá)30kb的目的基因?qū)χ参镞M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，技術(shù)成熟可靠，成本低廉，在普通的實(shí)驗(yàn)條件下即可完成，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/66GK102757978SQ201210241109
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者楊敏生, 董研 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)