專利名稱：一種檢測mgmt活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其檢測方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase,MGMT)是ー種高效的DNA修復(fù)酶，能夠修復(fù)化療中烷化劑藥物對腫瘤細(xì)胞DNA所造成的損傷，如果腫瘤細(xì)胞中的MGMT活性達(dá)到一定水平則可能會導(dǎo)致耐藥性，因此，MGMT活性的高低為耐藥與否提供直接信息，MGMT活性檢測對評估化療效果以及減少藥物毒副作用有著重要的意義。不幸的是，目前還沒有ー種簡易可靠、可應(yīng)用于常規(guī)臨床檢驗(yàn)的方法來測定具有重要腫瘤學(xué)價值的MGMT活性。已有大量文獻(xiàn)描述MGMT基因啟動子甲基化以及MGMT蛋白表達(dá)的免疫測定并試圖建立這些分子生物學(xué)和血清學(xué)指標(biāo)與腫瘤耐藥性、生存率以及個體化治療方案的相關(guān)性，但這些煩瑣而且不穩(wěn)定的檢測方法不適合在臨床上常規(guī)使用，也因?yàn)?它們不直接測定MGMT的酶學(xué)活性而可能引入各種與腫瘤耐藥機(jī)制無關(guān)的干擾因素。基于同位素標(biāo)記底物的MGMT活性測定法只適用于實(shí)驗(yàn)室研究而難以被用于常規(guī)臨床檢驗(yàn)中；此外，這種方法所用的蛋白沉淀步驟容易引入諸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特異結(jié)合，引起假陽性。雖然有人用非同位素標(biāo)記的底物和酶聯(lián)免疫分析方法來測定MGMT活性，但這個方法需要多步而費(fèi)時的固相分離和反應(yīng)。從臨床應(yīng)用和檢測效率(靈敏度)的角度來看，這是個明顯的缺點(diǎn)。很明顯，無論在腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究中還是在腫瘤治療的臨床實(shí)踐中，都急需發(fā)展ー種簡單可靠的方法來特異、靈敏地測定各種腫瘤組織和細(xì)胞中的MGMT活性。

發(fā)明內(nèi)容
本目的是提供ー種簡便、特異、靈敏的MGMT活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，主要包括試劑I :鏈霉親和素磁珠濃度為r5mg/mL的分散液，溶劑為含有O. 5% (w/w)牛血清白蛋白、1% (w/w)酪蛋白的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述鏈霉親和素磁珠為表面修飾鏈霉親和素的磁性微球，粒徑為Γ3μπι，內(nèi)核為四氧化三鐵(Fe304)、表面帶有鏈霉親和素生物分子，可通過戊ニ醛兩步法在表面帶有羧基或氨基等活性基團(tuán)的磁性微球以化學(xué)共價結(jié)合方式引入鏈霉親和素，并以含有O. 5%牛血清白蛋白(bovine serumalbumin, BSA)、1%酪蛋白的pH為7. 2,0. 02mol/L的磷酸緩沖液進(jìn)行封閉完成試劑2 :生物素標(biāo)記的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物，即生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤溶液，使用時以含有疊氮鈉O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5 μ g/mL ；試劑3 :辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人MGMT特異性單克隆抗體，使用時以含有O. 05% (w/w)甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐劑溶液稀釋至濃度為2 μ g/mL ;酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液，當(dāng)標(biāo)記酶為過氧辣根化物酶，標(biāo)記方法優(yōu)選為過氧碘酸鈉法；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性磷酸酶，標(biāo)記方法優(yōu)選為戊ニ醛法；試劑4 06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；使用時配制為6個梯度濃度，分別為 600、150、50、25、10、0fmol/mL ；試劑5 :發(fā)光底物液，為過氧化氫-魯米諾發(fā)光液或者AMPH)溶液；所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為過氧辣根化物酶時，發(fā)光底物液由A液和B液構(gòu)成，發(fā)光底物液A液為過氧化氫溶液，發(fā)光底物液B液為魯米諾溶液，使用時等體積混合；所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為堿性磷酸酶時，發(fā)光底物液為3- (2’-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3’ -羥基)苯-1，2-ニ氧雜環(huán)丁燒憐酸鈉(4_methoxy-4-(3-phosphatephenyl )-spiro-( I, 2-dioxetane_3，2，_admantane)，AMPPD)溶液，溶劑為0. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液。試劑6 :濃縮洗滌液，為含有O. 19Γ0. 5% (w/w)吐溫_20、0. 1% (w/w)疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，pH 7. 4。本發(fā)明提出了使用鏈親和素(Streptavidin, SA)修飾磁性微球捕獲MGMT,結(jié)合酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來檢測MGMT的活性的方法。檢測原理圖如圖I所示(a)待測的MGMT與Biotin標(biāo)記MGMT底物生物素化O6-芐基鳥嘌呤(Biotin-BG)反應(yīng)，在芐基轉(zhuǎn)移到酶蛋白后形成生物素標(biāo)記的MGMT即Biotin-MGMT ； (b)加入過量鏈霉親和素修飾的磁性微球P (St-GMA-SA) /Fe3O4俘獲Biotin-MGMT，并在外加磁場作用下進(jìn)行分離；(c)最后加入O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抗體的酶標(biāo)記物(ALP-anti-MGMT或HRP-anti-MGMT)；(d)使用酶促化學(xué)發(fā)光底物來檢測MGMT的活性相關(guān)指標(biāo)。由于MGMT能催化Biotin-BG上的苯甲基轉(zhuǎn)移到自身的巰基上，使MGMT標(biāo)記上了 Biotin，從而形成Biotin-MGMT，可被帶有SA配基的P(St-GMA-SA)/Fe3O4捕獲。MGMT的活性越高，催化能力就越強(qiáng)，被Biotin標(biāo)記的量就越高，從而被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕獲的量就越多，因此MGMT的活性與被P (St-GMA-SA) /Fe3O4捕獲數(shù)量直接相關(guān)，通過酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)即可獲得MGMT的活性信息，最終被檢測樣品的發(fā)光強(qiáng)度度值越高，即被捕獲的MGMT數(shù)量越多，MGMT的活性就越高。即本發(fā)明采用高特異性的anti-MGMT和Biotin-BG兩種探針，與MGMT形成免疫夾心復(fù)合物，結(jié)合磁性微球固相分離和酶促化學(xué)發(fā)光檢測技木，從而達(dá)到快速、靈敏檢測MGMT活性的目的。本發(fā)明還涉及ー種利用所述的試劑盒對O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括(I)按本領(lǐng)域常規(guī)方法提取待測樣品的總蛋白質(zhì)；(2)向試管中加入25 μ L上述處理后的樣品蛋白質(zhì)，再加入50 μ L試劑2 (稀釋后的)，37°C恒溫振蕩反應(yīng)30min，加入50 μ L試劑1，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置 于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；往試管中加入500 μ L試劑6 (稀釋后的)，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清液，再加入50 μ L試劑3(稀釋后的)，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入500 μ L試劑6 (稀釋后的)，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入300 μ L試劑5,充分混勻后,暗處放置2min后置于磁分離器,待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學(xué)發(fā)光儀測定，獲得其發(fā)光值；(3)取梯度濃度的試劑4，按照步驟(2)的方法分別測定其發(fā)光值，以所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均值(RLU)減去濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光值(RLUtl),再取對數(shù)值作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的自然対數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)根據(jù)樣品溶液的發(fā)光值，按照步驟(3)計(jì)算方法取對數(shù)值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即獲得樣品中的MGMT含量。所述待測樣品可為臨床組織樣品或臨床細(xì)胞株樣品。待測樣品為腫瘤細(xì)胞株樣品時，總蛋白提取步驟如下I.裂解液制備每500uL冷的緩沖溶液(20mM DTT, 2mM EDTA, 20% (v/v)丙三醇，溶劑為IOOmM Tris-HCl, pH 7. 6，)A中加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/mL抑肽酶， 10 μ M抑氨肽酶素b, 10 μ M亮抑酶肽，I μ M胰肽素,O. ImM苯甲基磺酰氟),混勻后置冰上備用；2.取5 10 X IO6個細(xì)胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5 10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，
盡可能吸干，收集細(xì)胞；3.用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，毎次洗滌后盡可能吸干上清；4.每5X IO6個細(xì)胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘；5.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘；6.快速將上清吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。待測樣品為臨床組織樣品吋，總蛋白提取步驟如下I.裂解液制備姆500uL冷的緩沖溶液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用；2.取IOOmg組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體；3.將組織勻漿吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘；4.將上清吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)本發(fā)明使用磁性微球代替一般的孔板作為ELISA的固相反應(yīng)載體，由于其高的比表面積和低的傳質(zhì)阻力，親和反應(yīng)可迅速發(fā)生，并且在外加磁場的作用下，可以快速、高效地捕獲MGMT，達(dá)到快速檢測的目的；(2)本發(fā)明與常規(guī)只是用抗體一種結(jié)合探針的ELISA檢驗(yàn)不同是的是，使用Biotin-BG和anti-MGMT兩種特異探針，通過酶學(xué)催化和抗原-抗體雙重特異反應(yīng)來保證最終檢測信號的高特異性。(3)本發(fā)明試劑盒成分簡單，攜帯方便，檢測步驟與常規(guī)的ELISA類似，適用于大批量樣品的定量和定性分析檢測。

圖I為本發(fā)明原理圖；圖2為本發(fā)明制備獲得的鏈霉親和素磁珠的透射電鏡照片。圖3為本發(fā)明實(shí)施例I獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于
此 實(shí)施例I :人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR-I樣品中MGMT活性檢測檢測人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR-I樣品中MGMT活性的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒包括(I)鏈霉親和素磁珠粒徑為f 3 μ m、使用濃度為10mg/mL，IOmL/瓶，I瓶；(2)生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋1000倍后使用，稀釋液為含有1%BSA和O. 2g/L的疊氮鈉防腐劑溶液。(3)O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抗體的酶標(biāo)記物標(biāo)記酶為堿性磷酸酶，濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋2000倍后使用，稀釋液為含有O. 05%甘油和O. 2g/L的硫柳汞防腐劑溶液。(4) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為600、150、50、25、10、0fmol/mL,0. 5mL/瓶，6瓶，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；(5)發(fā)光底物液AMPH)溶液，溶劑為O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7.2、O. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，AMPPD濃度O. 5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；(6)濃縮洗滌液pH 7. 4，含有O. 2%吐溫-20，O. 1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖溶液。25mL/瓶，I瓶。使用時用蒸餾水稀釋20倍；其中鏈霉親和素磁珠、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性單克隆抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備方法如下I、鏈霉親和素磁珠的制備a)表面含有氨基基團(tuán)的磁性微球的制備在50mL Fe3O4磁流體中加入90mL無水こ醇，O. 4g聚こ烯吡咯烷酮，超聲IOmin混合均勻后轉(zhuǎn)移到250mL三頸瓶中，依次加入4mL苯こ烯、ImL甲基丙烯酸縮水甘油酷、O. 09g偶氮ニ異丁腈,機(jī)械攪拌,通入氮?dú)?5min后升溫到75°C，反應(yīng)24h。將反應(yīng)后的混合液進(jìn)行磁分離，分別用こ醇和二次水各洗滌三次，真空干燥，得到棕色的粉末。將上述5g粉末中加入50mL水和50mL己ニ胺，超聲IOmin混合均勻后轉(zhuǎn)移到250mL三頸瓶中，機(jī)械攪拌，在80°C時反應(yīng)12h。將反應(yīng)后的混合液進(jìn)行磁分離后，用純水洗滌多次除去多余己ニ胺，得到表面含有氨基基團(tuán)的磁性微球。b)將50mg表面含有氨基基團(tuán)的磁性微球放入滅菌水中浸泡，用磷酸鹽緩沖液(pH
7.4)清洗3次后，再加入2. 5mL磷酸鹽緩沖液，超聲分散IOmin后待用；取上述2. 5mL磁性微球分散液，加入2mL的戊ニ醛室溫震蕩反應(yīng)6h，進(jìn)行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊ニ醛后，將磁性微球重新懸浮在2. 5mL磷酸鹽緩沖液中，然后再加入到裝有200μ L的濃度I. Omg/mL的鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養(yǎng)6h ;用磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)多次清洗所得磁性微球，最后將其分散在含有O. 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、1%酪蛋白的pH為7. 2,0. 02mol/L的磷酸緩沖液中(濃度為10mg/mL)，4°C保存待用。制得的鏈霉親和素磁珠的透射電鏡照片見圖2。2、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物的制備將O6-芐基鳥嘌呤用O. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. O)或O. 5mol/L硼酸緩沖液(pH 8. 6)稀釋到Img/mL，用ImL DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB) Img ;向ImL O6-芐基鳥嘌呤溶液加入120 μ L NHSB溶液(即含NHSB 120 μ g);在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2 4小吋；加入9. 6 μ Llmol/L NH4Cl (每 25 μ g NHSB 加 I μ L)和 200 μ L 濃度為 lmg/mL EDC (I-(3- ニ 甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亞胺鹽酸鹽)溶液，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透祈，以除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質(zhì)在I 3mL之間洗下；最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度0. 2g/L)及I. 0g/L BSA，濃度為5μ g/mL。將結(jié)合產(chǎn)物置4°C，避光保存。
3、O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性單克隆抗體的堿性磷酸酶標(biāo)記物的制備將堿性磷酸酶20mg溶于I. 5% (v/v)的戊ニ醛溶液中，室溫靜置過夜，將上述酶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫,流速控制I. 2mL/min,并收集棕色流出物；取O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性單克隆抗體anti-MGMT 2. 5mg,以0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入酶溶液中；然后加入0. 2mol/L賴氨酸0. 2mL，混勻，置室溫2 3h ;反應(yīng)液裝入透析袋，以0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析24h后，以含有0.05%甘油、0. 2g/L的硫柳汞防腐溶液I : 2000稀釋，分裝，4°C保存待用。利用該試劑盒檢測人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞MGR-I樣品中MGMT活性的方法如下(I)樣品前處理a.裂解液制備每 500uL 冷的緩沖溶液 A 中(IOOmM Tris-HCl, ρΗ7· 6，20mM DTT,2mM EDTA, 20%丙三醇)加入2ul蛋白酶抑制劑混合物(10 μ g/mL抑肽酶，10 μ M抑氨肽酶素比1(^1亮抑酶肽，1レ11胰肽素，0. ImM苯甲基磺酰氟)，混勻后置冰上備用；b.取5 10X IO6個MGR-I細(xì)胞，在4°C，IOOOrpm條件下離心5_10分鐘，小心吸取
培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞；c.用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，毎次洗滌后盡可能吸干上清；d.每5X IO6個細(xì)胞中加入500uL冷的裂解液，混勻后，在4°C條件下振蕩15 20分鐘；e.在4°C, 14000rpm條件下離心15分鐘；f.快速將上清吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。(2)檢測方法向試管中加入25 μ L上述處理后的MGR-I樣品或同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物50μ L，37°C恒溫振蕩反應(yīng)30min。加入50 μ L鏈霉親和素修飾的磁性微球，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；加入洗滌液500 μ L，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min,除去上清,再加入50 μ L堿性磷酸酶標(biāo)記的an_MGMT, 37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入洗滌液500yL，充分洗滌2^3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入AMPTO發(fā)光底物液300 μ L，充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器，待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學(xué)發(fā)光儀測定。(3)結(jié)果分析發(fā)光計(jì)數(shù)-劑量反應(yīng)曲線以雙對數(shù)曲線表示，即所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本發(fā)光值的平均值(RLU)減去第一個零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的發(fā)光值(RLUtl),再取對數(shù)，即縱軸(Y軸)=Iog (RLU-RLU0) =IogARLU以MGMT濃度的自然對數(shù)值為橫軸(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示。相應(yīng)每個樣品中MGMT濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，計(jì)算出樣品溶液中MGMT的濃度。按照上述方法采 用本發(fā)明試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測，其濃度檢測線性范圍可達(dá)到(TlOOOfmol/mg蛋白質(zhì)之間，可以避免高M(jìn)GMT濃度樣品的稀釋，使用本試劑盒的整個檢測過程約f I. 5h，最低檢測限為2. Ofmol/mg蛋白質(zhì)。實(shí)施例2 人乳腺癌組織樣品中MGMT活性檢測檢測人乳腺癌組織樣品中MGMT活性的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒包括(I)鏈霉親和素磁珠粒徑為f 3 μ m、使用濃度為10mg/mL，IOmL/瓶，I瓶；(2)生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物濃度為5 μ g/mL，5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋1000倍后使用，稀釋液為含有1%BSA和0. 2g/L的疊氮鈉防腐劑溶液。(3) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抗體的酶標(biāo)記物標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，濃度為5 μ g/mL, 5mL/瓶，I瓶；使用時用稀釋液稀釋2000倍后使用，稀釋液為含有
0.05%甘油和0. 2g/L的硫柳汞防腐劑溶液。(4) O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為600、150、50、25、10、0fmol/mL,0. 5mL/瓶，6瓶；溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2,0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液；(5)發(fā)光底物液A液，過氧化氫溶液(20. O μ mol/mL), 5mL/瓶，I瓶；B液魯米諾溶液(1.(^11101/111し)，511117瓶，1瓶；使用時體積比為1 I混合。(6)濃縮洗滌液pH 7. 4，含有0. 3%吐溫-20，0. 1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖溶液。25mL/瓶，I瓶。使用時用蒸餾水稀釋20倍；其中鏈霉親和素磁珠、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物以及O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性單克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備方法如下I、鏈霉親和素磁珠的制備將50mg表面含有氨基基團(tuán)的磁性微球放入滅菌水中浸泡，用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，再加入2. 5mL磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)，超聲分散IOmin后待用；取上述2. 5mL磁性微球分散液，加入2mL的戍ニ醒室溫震蕩反應(yīng)6h,進(jìn)行磁分離，多次用大量純水清洗多余的戊ニ醛后，將磁性微球重新懸浮在2. 5mL磷酸鹽緩沖液(pH7. 4)中，然后再加入到裝有200 μ L的濃度I. 0mg/mL的鏈霉親和素溶液的EP管中，室溫震蕩培養(yǎng)6h ;用磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)多次清洗所得磁性微球，最后將其分散在含有0. 5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、1%酪蛋白的pH為7· 2,0. 02mol/L的憐酸緩沖液中(濃度為10mg/mL)，4°C保存待用。2、生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物的制備將O6-芐基鳥嘌呤用O. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8. O)或O. 5mol/L硼酸緩沖液(pH 8. 6)稀釋到Img/mL，用ImL DMSO溶解N-羥基琥珀酰亞胺生物素(NHSB) Img ;向ImL O6-芐基鳥嘌呤溶液加入120 μ L NHSB溶液(即含NHSB 120 μ g);在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2 4小吋；加入
9.6 μ Llmol/L NH4Cl (每25 μ g NHSB加I μ L)，在室溫下攪拌10分鐘；在4°C，對PBS充分透析，以除去游離的生物素；將樣品上ImL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集ImL/管，蛋白質(zhì)在I 3mL之間洗下；最后,樣品加入疊氮鈉(終濃度O. 2g/L)及I. Og/L BSA,濃度為5 μ g/mL。將結(jié)合產(chǎn)物置4°C，避光保存。3、06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性單克隆抗體的辣根過氧化物酶標(biāo)記物的制備將辣根過氧化物酶IOmg溶于ImL純水中，在攪拌條件下逐滴加入O. 2mL NaIO4溶液
O.2mL，室溫?cái)嚢?0min后，用pH 4. 4的濃度為lmmol/L醋酸鈉緩沖溶液在4°C下透析過夜后，用0. 2mol/L的Na2CO3緩沖溶液將pH值調(diào)整至9. (TlO. O ;將Img的anti-MGMT溶于4mL濃度為0. 2mol/L的Na2CO3緩沖溶液中并迅速加入上述酶液，攪拌反應(yīng)3飛小時，再加入新配置的NaBH4溶液100yL，4°C下反應(yīng)2小時；將上述反應(yīng)液裝入透析袋中，在0. lmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中透析24h后，以含有0. 05%甘油、0. 2g/L的硫柳汞防腐溶液I 2000稀釋，分裝，4°C保存待用。利用該試劑盒檢測人乳腺癌組織樣品中MGMT活性的方法如下(4)樣品前處理a.裂解液制備 每500uL冷的緩沖溶液A中加入2uL蛋白酶抑制劑混合物，混勻
后置冰上備用。b.取IOOmg組織樣本剪碎，加入上述裂解液中，并用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。c.將組織勻漿吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管中，在4°C，IOOOOrpm條件下離心5分鐘。d.將上清吸入另ー預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。(5)檢測方法向試管中加入25 μ L上述處理后的人乳腺癌組織樣品總蛋白或同體積的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入生物素化的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的底物50 μ L，37°C恒溫振蕩反應(yīng)30min。加入50 μ L鏈霉親和素磁珠，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜；加入洗滌液500 μ L，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，再加入50 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的anti-MGMT，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后,將試管架置于磁分離器上分離5min,然后倒出上層清夜,加入洗漆液500 μ L,充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min，除去上清，加入發(fā)光底物液A液和B液各150 μ L,充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器,待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學(xué)發(fā)光儀測定。(6)結(jié)果分析發(fā)光計(jì)數(shù)-劑量反應(yīng)曲線以雙對數(shù)曲線表示，即所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本發(fā)光值的平均值(RLU)減去第一個零標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的發(fā)光值(RLUtl),再取對數(shù)，即
縱軸(Y軸)=Iog (RLU-RLU0) =IogARLU以MGMT濃度的自然對數(shù)值為橫軸(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。相應(yīng)每個樣品中MGMT濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出，計(jì)算出樣品溶液中MGMT的濃度。按照上述方法采 用本發(fā)明試劑盒對待測樣品進(jìn)行檢測，其濃度檢測線性范圍可達(dá)到(TlOOOfmol/mg蛋白質(zhì)之間，可以避免高M(jìn)GMT濃度樣品的稀釋，使用本試劑盒的整個檢測過程約fl.5h，最低檢測限為4. 5fmol/mg蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種檢測ο6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，主要包括 試劑I :鏈霉親和素磁珠濃度為f5mg/mL的分散液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸鹽緩沖液； 試劑2 :生物素標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤溶液，使用時以含有疊氮鈉O. 2g/L、BSAl. Og/L的pH 7. 2、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5 μ g/mL ； 試劑3 :辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人MGMT特異性單克隆抗體，使用時以含有O. 05%甘油和O. 2g/L的硫柳汞的防腐劑溶液稀釋至濃度為2 μ g/mL ； 試劑4 06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，溶劑為含有O. 5%牛血清白蛋白、1%酪蛋白的pH 7. 2、0· 02mol/L的磷酸鹽緩沖液； 試劑5 :發(fā)光底物液，為過氧化氫-魯米諾發(fā)光液或者AMPH)溶液； 試劑6 :濃縮洗滌液，為含有O. 19Γ0. 5%吐溫-20、0. 1%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，pH7. 4，使用時蒸餾水稀釋20倍。
2.利用如權(quán)利要求I所述的試劑盒對O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行檢測的方法，所述方法包括 (1)提取待測樣品的總蛋白質(zhì)； (2)向試管中加入25μ L上述處理后的樣品蛋白質(zhì)，再加入50 μ L試劑2，37°C恒溫振蕩反應(yīng)30min,加入50 μ L試劑I, 37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后,將試管架置于磁分離器上分尚5min,然后倒出上層清夜；往試管中加入500 μ L試劑6,充分洗漆2^3次后,置于磁分尚器上分離5min，除去上清液，再加入50 μ L試劑3，37°C恒溫振蕩反應(yīng)5min后，將試管架置于磁分離器上分離5min，然后倒出上層清夜，加入500 μ L試劑6，充分洗滌2 3次后，置于磁分離器上分離5min,除去上清,加入300 μ L試劑5,充分混勻后，暗處放置2min后置于磁分離器，待所有磁性微球富集于試管底部后，置于化學(xué)發(fā)光儀測定，獲得其發(fā)光值； (3)取梯度濃度的試劑4，按照步驟(2)的方法分別測定其發(fā)光值，以所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均值(RLU)減去濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的發(fā)光值(RLUtl),再取對數(shù)值作為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的自然対數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (4)根據(jù)樣品溶液的發(fā)光值，按照步驟(3)計(jì)算方法取對數(shù)值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即獲得樣品中的MGMT含量。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述待測樣品為臨床組織樣品或臨床細(xì)胞株樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，它包含有鏈霉親和素磁珠，生物素化的O6-芐基鳥嘌呤，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶特異性抗體anti-MGMT的酶標(biāo)記物，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，發(fā)光底物液，濃縮洗滌液。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述試劑盒用于MGMT的檢測方法，它包括步驟首先進(jìn)行樣品總蛋白質(zhì)提取，然后采用試劑盒檢測，最后分析檢測結(jié)果。本發(fā)明提供了一種檢測人組織或細(xì)胞中的MGMT活性的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及檢測方法，具有操作簡便、快速，檢測結(jié)果靈敏度高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，在MGMT活性臨床檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/577GK102707060SQ201210180020
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者何睿, 梁媛媛, 溫漢華, 焦艷華, 陳燦玉, 黃志堅(jiān) 申請人:杭州師范大學(xué)