專利名稱：基于16S rDNA的細(xì)菌核酸指紋特征譜的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)菌核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類與鑒定的方法。
背景技術(shù)：
早期的細(xì)菌學(xué)分類主要是采用以形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征為依據(jù)的傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分類方法。但是由于細(xì)菌的這種表面特征往往受很多人為因素的影響與限制，特別是人們主觀判斷的差異反而難以反映出細(xì)菌的自然親緣關(guān)系，這就體現(xiàn)了只建立在形態(tài)特征和生理生化特征基礎(chǔ)上的傳統(tǒng)分類學(xué)的局限性。因此，Colweel提出了一個(gè)新的細(xì)菌分類學(xué)術(shù)語(yǔ)“多相分類(Polyphasictaxonomy)”，它是指綜合利用微生物多種不同信息，包括表型和基因型的信息進(jìn)行分類的方法。分子分類和系統(tǒng)發(fā)育信息豐富了多相分類的內(nèi)容，共同推動(dòng)細(xì)菌分類向著自然分類系統(tǒng)靠近。應(yīng)用于分類的分子指標(biāo)主要為DNA和RNA，而DNA同源性分析是確定正確的分類地位，建立自然分類系統(tǒng)的最直接的方法。此類方法簡(jiǎn)便易行，分辨率高，在細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中起著越來(lái)越重要的作用。使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌分類和鑒定的原理在于，組成遺傳物質(zhì)DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質(zhì)量差異，對(duì)細(xì)菌基因組DNA上某個(gè)或某幾個(gè)片段進(jìn)行PCR和酶切后，將產(chǎn)生分子量和豐度各異的片段，使用質(zhì)譜檢測(cè)可產(chǎn)生核酸指紋圖譜，不同細(xì)菌之間基因組DNA存在差異，將產(chǎn)生不同的核酸指紋圖譜，建立數(shù)據(jù)庫(kù)后，可以實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可完成對(duì)細(xì)菌的鑒定。已有一些公開文獻(xiàn)使 用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行分類和鑒定，例如，中國(guó)專利申請(qǐng)CN102337223A、“產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法”，公開了一種檢測(cè)產(chǎn)黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALD1-T0F鑒定方法，其中從平板上挑取產(chǎn)黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，預(yù)處理得到粗蛋白溶液在色譜柱上分離純化，并在羧甲基陽(yáng)離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進(jìn)行MALD1-T0F鑒定。該方法僅適用于特定微生物，且需要多重蛋白純化過(guò)程，最終用MALD1-T0F鑒定特征蛋白Pc-Arctin，其過(guò)程繁瑣、適用面窄，不能實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜分類細(xì)菌或微生物的目的。中國(guó)專利申請(qǐng)200910157210、“一種李斯特菌屬細(xì)胞中脂肪酸組分的分析方法”公開了一種利用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)分析法針對(duì)細(xì)菌脂肪酸進(jìn)行分類的方法，包括李斯特菌復(fù)壯，用牛津瓊脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂平板分別分離和純化李斯特菌，培養(yǎng)單個(gè)典型菌落的李斯特菌并制成菌懸液，用甲醛滅活處理，把經(jīng)甲醛處理后的菌懸液平均分裝在離心管洗滌，用鹽酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)分析。雖然該方法打破傳統(tǒng)細(xì)菌分類學(xué)的局限，減少人為因素對(duì)傳統(tǒng)形態(tài)分類帶來(lái)的誤差，同時(shí)為新的菌種和毒種的分類鑒定提供強(qiáng)有力的工具，但該法仍然屬于利用質(zhì)譜法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)分析分類，并未針對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)。國(guó)際專利申請(qǐng) W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公開了一種使用MALD1-MS (基質(zhì)輔助激光解吸和電離質(zhì)譜)用于識(shí)別生物材料的方法和裝置，包括準(zhǔn)備包含試樣和MALDI基質(zhì)材料的液體，并將其用于形成液體的連續(xù)流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發(fā)射到飛行中的液滴，或?qū)⒘魇l(fā)射到飛行中，然后分散成液滴?？墒褂脧膰娔∷C(jī)中已知的液滴形成技術(shù)。對(duì)飛行中的液滴電離出材料。測(cè)量來(lái)自各個(gè)液滴的電離材料的質(zhì)譜。但該方法目的在于如何改善MALD1-MS檢測(cè)生物物質(zhì)的靈敏度，并不涉及質(zhì)譜鑒定和分類任意微生物，因此也不能解決上述技術(shù)問(wèn)題。
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朱健等人(“高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法對(duì)格爾德霉素粗品中各組分的初步判別及分類”，《中國(guó)抗生素》，2011年03期)報(bào)道了應(yīng)用高效液相色譜-電噴霧多級(jí)質(zhì)譜法(LC-ES1-MSn)對(duì)格爾德霉素(GDM)粗品中各組分進(jìn)行與質(zhì)量數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息方面的初步判別及分類。該方法針對(duì)格爾德霉素(GDM)中不同組分的多級(jí)質(zhì)譜碎片進(jìn)行的分析整理，并對(duì)各種化合物進(jìn)行了準(zhǔn)確分類，但并不涉及針對(duì)細(xì)菌特定物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方法。劉海洪(“MALDI TOF MS在細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用”，《微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展》，2003年02期)報(bào)道了“細(xì)菌體內(nèi)含有大量的生物標(biāo)志分子能用于細(xì)菌的化學(xué)分類和鑒定，針對(duì)如根據(jù)細(xì)菌的組成成分獲得指紋圖譜檢測(cè)和鑒定細(xì)菌”，并對(duì)該方法預(yù)測(cè)其理論上的可行性。然而，該研究?jī)H僅是理論上探討了利用MALDI TOF MS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類的方向，其既沒(méi)有指明所針對(duì)細(xì)菌的何種組分進(jìn)行檢測(cè)，也沒(méi)有說(shuō)明具體研究方法和過(guò)程。由于細(xì)菌中可用于分類的組分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)種類太多，且質(zhì)譜技術(shù)針對(duì)不同待測(cè)物也存在各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)的組合和選擇，因此在此之后的近10年內(nèi)并沒(méi)有利用MALDI TOF MS進(jìn)行細(xì)菌分類的新的報(bào)道。作為最接近的現(xiàn)有技術(shù)，中國(guó)專利申請(qǐng)201110154723、“MALDI TOF MS輔助鑒定單增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS輔助鑒定霍亂弧菌的方法”公開了一種利用MALDI TOF MS技術(shù)輔助鑒定細(xì)菌的方法，包括預(yù)處理細(xì)菌培養(yǎng)物，采集所有菌株樣品的MALDI TOF MS圖譜，根據(jù)軟件制備細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)圖譜，使用相同的方法檢測(cè)并采集待測(cè)細(xì)菌的圖譜，以及比較二者圖譜，根據(jù)匹配分?jǐn)?shù)進(jìn)行判定。由于該方法使用常規(guī)的處理(通過(guò)無(wú)水乙醇、甲酸和乙腈處理，并輔以離心，最后吸取上清液進(jìn)行檢測(cè))，盡管其在一定程度上能表征該細(xì)菌的特征圖譜，但由于其待測(cè)物中含有蛋白質(zhì)、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被離子化的分子，其得到的圖譜實(shí)質(zhì)上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對(duì)的圖譜信息量過(guò)大，并且因待檢分子過(guò)于龐大而導(dǎo)致其圖譜特征性偏低，只適用于某具體細(xì)菌而無(wú)法推廣到其他大量的細(xì)菌檢測(cè)中。研究證明，細(xì)菌rRNA區(qū)域。rRNA是研究細(xì)菌進(jìn)化和親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，它含量達(dá)80%，并存在于所有細(xì)菌中，rRNA基因由保守區(qū)和可變區(qū)組成，在細(xì)菌中高度保守，素有“細(xì)菌化石”之稱，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的分子鐘。其中，16S rDNA序列由于分子大小適中(約1. 5kb)，突變率極低，已經(jīng)成為細(xì)菌分類和種屬鑒定的重要標(biāo)記(Olsen GJ, Pace NR, Nuell M, et al. Nucleic Acids Res, 1991, 19 ( supp I):2017-2021.)。雖然目前16S rDNA序列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法，大約2500個(gè)種的16S rDNA全序列已經(jīng)被報(bào)道，根據(jù)它們的序列同源性，已經(jīng)構(gòu)建了各種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹。但由于16S rDNA序列在原核生物中的高度保守性,對(duì)于相近種或同一種內(nèi)的不同菌株之間的鑒別分辨力較差。另外，目前以16S rDNA進(jìn)行細(xì)菌分類和鑒定的方法主要是采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)的方法。測(cè)序法應(yīng)用于臨床檢測(cè)，目前存在如下問(wèn)題(1)成本高；(2)耗時(shí)；(3)對(duì)于混合樣本，測(cè)序易產(chǎn)生套峰，難以進(jìn)行有效區(qū)分；(4) 16S rDNA全長(zhǎng)1. 5kb以上，一般需要經(jīng)過(guò)兩次測(cè)序并將結(jié)果進(jìn)行拼接，在這個(gè)過(guò)程中易引入誤差。如前所述，16S rDNA對(duì)細(xì)菌分類鑒定具有重要的意義，但是傳統(tǒng)測(cè)序等方法檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)；對(duì)于混合感染的樣品，測(cè)序法將得到混合的序列峰圖，難以進(jìn)行有效的區(qū)分，并且利用質(zhì)譜進(jìn)行待測(cè)物分析，需要選擇合適的待測(cè)物和優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，因此目前需要新的細(xì)菌分類技術(shù)(如質(zhì)譜法)來(lái)實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)、便捷的分類結(jié)果。因此，目前需要一種既能針對(duì)細(xì)菌中16S rDNA某特定區(qū)域進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，同時(shí)該方法又能普遍用于絕大多數(shù)細(xì)菌的質(zhì)譜分類和鑒定中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明原理在于發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量摸索和比對(duì)，針對(duì)841種細(xì)菌的研究，發(fā)現(xiàn)選用通用引物對(duì)細(xì)菌DNA保守DNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用特殊酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物處理后，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)可以得到各種細(xì)菌核酸指紋特征圖譜。本發(fā)明所述的細(xì)菌DNA基因組上一個(gè)區(qū)域，優(yōu)選是具有高度保守同時(shí)又具有一定多態(tài)性的區(qū)域。由于細(xì)菌屬于低等生物，各種細(xì)菌的基因組中普遍呈現(xiàn)為一定同源性的保守性，因此針對(duì)細(xì)菌基因組中任一相對(duì)保守的區(qū)域，使用通用引物即可擴(kuò)增出各種細(xì)菌彼此對(duì)應(yīng)的核酸區(qū)域。不同微生物的DNA片段酶切，具有不同的特征圖譜，因而將實(shí)際核酸質(zhì)譜圖譜進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的分類與鑒定。 因此，本發(fā)明第一目的是提供一種基于酶切的細(xì)菌核酸指紋圖譜制備方法。其特征在于，它至少包括如下步驟(I)PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌16S rDNA的PCR通用引物，分別擴(kuò)增多個(gè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物；(3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，分別在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟
(2)得到的各個(gè)細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物；(5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到不同細(xì)菌的特征核酸指紋譜圖。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCR反應(yīng)所擴(kuò)增的細(xì)菌核酸序列，包括但不限定于細(xì)菌16SrDNA上一個(gè)區(qū)域。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述細(xì)菌16S rDNA區(qū)域選自SEQ ID N0:3所示的區(qū)域，或者與SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選該序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一 實(shí)施方案中，步驟3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。上述任一方案中，其中所述細(xì)菌包括如表1所列的836種細(xì)菌。[LZOO]
權(quán)利要求
1.一種基于細(xì)菌16S DNA的核酸指紋圖譜制備方法，其特征在于，它至少包括如下步驟 (1)PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌16S rDNA的PCR通用引物，分別擴(kuò)增多個(gè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，分別在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的各個(gè)細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物； (5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到不同細(xì)菌的特征核酸指紋譜圖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)菌16SrDNA區(qū)域選自SEQ ID N0:3所示的區(qū)域，或者與SEQ ID N0:3所示序列具有至少60%同源性的序列，在其中的優(yōu)選實(shí)施方案中，優(yōu)選該序列具有 62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列；通用引物包括但不限于SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉(zhuǎn)錄和酶切產(chǎn)物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質(zhì)譜儀是MALDI TOF MS質(zhì)譜儀。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)菌包括如表I所列的836種細(xì)菌。
5.在上述任一方案中，其中所述細(xì)菌還包括布魯氏菌(5rwce77a)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis、,以及幽門螺桿菌pylori, Ηρ)。
6.利用權(quán)利要求1的方法用于建立細(xì)菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)的方法，至少包括上述步驟1-5，和； (6)將步驟5得到的各種細(xì)菌16SrDNA的核酸指紋特征圖譜，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行匯總和整理，得到所述的細(xì)菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)。
7.權(quán)利要求7的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權(quán)號(hào)為軟著登字第136879 號(hào)、登記號(hào) 2009SR10700。
8.利用權(quán)利要求5或6的方法所建立的細(xì)菌核酸指紋特征圖譜，用于細(xì)菌鑒定或分類的方法，包括 (I )PCR反應(yīng)使用針對(duì)細(xì)菌的PCR通用引物，擴(kuò)增待測(cè)細(xì)菌的核酸模板，得到含擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的PCR產(chǎn)物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產(chǎn)物； (3)轉(zhuǎn)錄和核酸酶切使用特定的轉(zhuǎn)錄和內(nèi)切酶，在一個(gè)反應(yīng)體系中，對(duì)步驟(2)得到的細(xì)菌的消化產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和核酸酶切，獲得一系列長(zhǎng)度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物； (5)質(zhì)譜儀檢測(cè)將步驟(4)得到的純化產(chǎn)物上點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，上質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，得到該細(xì)菌的核酸指紋特征圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與細(xì)菌核酸指紋特征圖譜庫(kù)進(jìn)行比較，從而判斷待測(cè)細(xì)菌的類別或種屬。
9.權(quán)利要求7的方法,其中步驟6通過(guò)BioExplore軟件進(jìn)行比較檢測(cè)。
10.提供能用于細(xì)菌分類和鑒定、耐藥篩選用途的試劑盒，包括 (1)用于擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA的通用引物對(duì)及其緩沖液； (2)SAP酶及其緩沖液； (3)RNAase及其緩沖液； (4)用于純化酶切產(chǎn)物的樹脂； (5)用于比對(duì)核酸指紋特征圖譜的分析軟件。
11.權(quán)利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQID NO: 1-2，所述軟件是BioExplore軟件，所述細(xì)菌16S rDNA區(qū)域選自SEQ ID N0:3所示的區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于細(xì)菌16S rDNA核酸指紋圖譜制備的方法，包括PCR擴(kuò)增、SAP酶消化、轉(zhuǎn)錄和核酸酶切、純化、質(zhì)譜儀檢測(cè)等步驟。基于該方法，建立常見細(xì)菌的核酸指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜峰圖，可對(duì)待檢細(xì)菌進(jìn)行分類與鑒定，結(jié)果可廣泛運(yùn)用于細(xì)菌分類和鑒定、遺傳進(jìn)化分析、耐藥篩選用途以及進(jìn)出口檢驗(yàn)等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060431SQ20121027332
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者馬慶偉, 趙洪斌, 張海燕, 趙艷梅 申請(qǐng)人:向華