專利名稱：一種提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量及促進(jìn)卵孢子萌發(fā)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量及促進(jìn)卵孢子萌發(fā)的方法。
背景技術(shù)：
由辣椒疫霉引起的辣椒疫病以及番茄和南瓜等茄科和葫蘆科作物上的疫病目前在亞洲、美洲、歐洲和澳洲普遍發(fā)生，在我國大部分省市也都有發(fā)生。由于辣椒疫病蔓延迅速，對寄主植物破壞性強(qiáng)，從苗期到結(jié)果期都可發(fā)病，嚴(yán)重危害了植株莖桿、葉片及果實(shí)并最終導(dǎo)致死苗和爛果乃至絕收，加之對于此類病害缺少抗病品種以及有效的農(nóng)業(yè)栽培管理措施等原因，導(dǎo)致其危害逐漸加重并難以控制，目前已成為我國蔬菜生產(chǎn)中的重要病害。辣椒疫霉屬于異宗配合病原卵菌，存在Ap A2兩種交配型，在田間可發(fā)生有性生殖產(chǎn)生卵孢子。辣椒疫霉的卵孢子是由有性世代產(chǎn)生的具有厚壁的一種休眠有性孢子，在自 然界中可以抵抗不良環(huán)境，是辣椒疫霉越冬的主要方式。自然條件下，辣椒疫霉卵孢子形成后通常需要經(jīng)過一段時(shí)間的休眠才能陸續(xù)萌發(fā)，但是在室內(nèi)條件下，一些野生型菌株或誘導(dǎo)獲得的突變體菌株卵孢子產(chǎn)生量少、萌發(fā)率低，給疫霉菌遺傳學(xué)等相關(guān)研究帶來了困難。遺傳分析研究要求辣椒疫霉在室內(nèi)培養(yǎng)條件下可以快速產(chǎn)生大量卵孢子，并能夠同時(shí)萌發(fā)，以縮短試驗(yàn)周期并保障研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于疫霉卵孢子產(chǎn)生以及萌發(fā)的研究也有相關(guān)報(bào)道，但是同屬不同種的疫霉菌株其卵孢子產(chǎn)生及萌發(fā)所需條件不同，且目前主要集中于對致病疫霉、苧麻疫霉、大豆疫霉、惡疫霉等卵孢子的產(chǎn)生以及萌發(fā)條件的研究，關(guān)于辣椒疫霉卵孢子的研究國內(nèi)未見報(bào)道。建立一種簡易、高效的誘導(dǎo)辣椒疫霉卵孢子大量產(chǎn)生及萌發(fā)的方法，是本領(lǐng)域亟待解決的一個技術(shù)問題，也為辣椒疫霉遺傳學(xué)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量的方法。本發(fā)明所提供的提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量的方法，包括如下步驟用10%V8蔬菜汁培養(yǎng)基培養(yǎng)辣椒疫霉菌株，培養(yǎng)條件為黑暗。上述過程中，所述培養(yǎng)的時(shí)間為15天-60天，具體為45天-60天；所述培養(yǎng)的溫度為25°C -28°C，具體為25°C。本發(fā)明的另一個目的是提供一種促進(jìn)辣椒疫霉卵孢子萌發(fā)的方法。本發(fā)明所提供的促進(jìn)辣椒疫霉卵孢子萌發(fā)的方法，包括如下步驟(I)將辣椒疫霉卵孢子在黑暗條件下培養(yǎng)15-45天；(2)用質(zhì)量百分含量為O. 05%—O. 25%的高錳酸鉀處理步驟(I)所得卵孢子；(3)將步驟(2)所得卵孢子在16h日光燈/8h黑光燈交替照射的條件下培養(yǎng)。上述過程中，所述步驟(I)中，培養(yǎng)的時(shí)間為15天、30天或45天；所述步驟(2)中，所述高錳酸鉀的質(zhì)量百分含量為O. 1% — O. 25%。上述過程中，所述步驟(2)中，所述高猛酸鉀的質(zhì)量百分含量為O. 1%或O. 25% ；
上述過程中，所述步驟(2)中，所述處理的方法為將所述卵孢子制成懸浮液，向懸浮液中加入高錳酸鉀，超聲處理20-40S。上述過程中，超聲處理的時(shí)間具體為30s，超聲的功率為250W，工作頻率為40KHz。上述過程中，所述步驟(3)中，培養(yǎng)的時(shí)間為5天。上述過程中，所述步驟(3 )中，所述培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基是S+L培養(yǎng)基。具體制備方法為:卵磷脂 O. lg，基礎(chǔ)培養(yǎng)液 IOml [MgSO4 · 7H20 IOOmg, (NH4) SO4 IOOmg, K2HPO4 60mg，CaCl2 ·2Η20 30mg, KH2PO4 30mg, ZnSO4 ·7Η20 3mg，蒸餾水 100ml]，葡萄糖 0. 04g，瓊脂粉 14g，蒸懼水定容至1L。上述過程中，步驟I)中，培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為10%V8蔬菜汁培養(yǎng)基。上述過程中，所述步驟(I)和步驟(3)中，溫度為25°C -28°C，具體為25°C。
上述過程中，在所述步驟(I)之前，包括如下步驟用權(quán)利要求I或2所述方法制備辣椒疫霉卵孢子。在室內(nèi)條件下誘導(dǎo)辣椒疫霉產(chǎn)生大量的卵孢子，并且產(chǎn)生的卵孢子能夠在同一時(shí)間大量萌發(fā)，對開展疫霉菌有性生殖后代的生物學(xué)遺傳及變異研究以及疫霉菌遺傳學(xué)相關(guān)研究都具有重要的意義。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)辣椒疫霉卵孢子大量產(chǎn)生及萌發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡易和有效的方法，為獲得大量辣椒疫霉單卵孢子群體用于抗藥性或其它遺傳學(xué)研究提供了保證。


圖I為辣椒疫霉自交培養(yǎng)方法。圖2為辣椒疫霉雜交對峙培養(yǎng)方法。圖3為辣椒疫霉卵孢子萌發(fā)圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用辣椒疫霉菌株Sx-3、Sx-22、Ηχ-l和Sx_2在文獻(xiàn)“崔曉嵐，孟慶曉，畢揚(yáng)等.辣椒疫霉對烯酰嗎啉的敏感基線及室內(nèi)抗藥性突變體研究.植物病理學(xué)報(bào).2009,39 (6) :630-637”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述V8汁均指V8蔬菜汁。實(shí)施例I、提高卵孢子產(chǎn)量一、培養(yǎng)基的篩選10%V8培養(yǎng)基V8蔬菜汁100ml，CaCO3 O. 2g，瓊脂粉14g，加蒸餾水定容至1L，高壓蒸汽滅菌，121° C，20min，待冷卻至40 50° C時(shí)，倒入滅菌培養(yǎng)皿中備用。SLA培養(yǎng)基β -谷甾醇20mg、卵磷脂500mg、CaCO3 O. 2g、天冬氨酸10mg、V8蔬菜汁100ml、瓊脂2g和去離子水900ml。將卵磷脂置于50ml水中，用勻漿機(jī)(500r/min)勻漿3min,把卵磷脂充分打散，加入V8汁、CaCO3、瓊脂，補(bǔ)足水至1000ml，將β -谷甾醇用少量(數(shù)毫升)二氯甲烷溶解后與培養(yǎng)基混合。天冬氨酸用少量的水溶解后單獨(dú)分裝于三角瓶內(nèi)，121° C滅菌20min，待培養(yǎng)基降至50° C左右，將天冬氨酸溶液加入培養(yǎng)基中，搖勻倒入滅菌培養(yǎng)皿中備用。色氨酸培養(yǎng)基β -谷甾醇30mg、L_色氨酸20mg、CaCl2 lOOmg、維生素B1 Img> 10%的V8培養(yǎng)基1000ml。將β-谷留醇先溶于少量二氯甲烷中，后加入10%的V8培養(yǎng)基中，121° C滅菌20min，L-色氨酸和維生素B1混合后溶于少量水中，單獨(dú)滅菌，在使用前待培養(yǎng)基降至50° C左右時(shí)加入，搖勻倒入滅菌培養(yǎng)皿中備用。辣椒疫霉自交產(chǎn)卵孢子產(chǎn)量的檢測方法(如圖I所示)將采自我國陜西的辣椒疫霉菌株Sx-3 (A2交配型)、Sx-22 (A1交配型)分別接種于上述10%V8培養(yǎng)基、SLA培養(yǎng)基或色氨酸培養(yǎng)基平板上，于25° C黑暗條件下培養(yǎng)5d，移去接種點(diǎn)的菌餅后使用瓶口直徑為4cm的滅菌三角瓶，將長滿菌絲的培養(yǎng)基打成直徑4cm的菌餅，將菌餅以菌絲面朝上的方式移入1%水瓊脂平板的中央，在菌絲面上覆一張滅菌的聚碳酸酯膜(47mm，孔徑O. 2 μ m)，輕壓此膜以排盡氣泡使之與菌餅緊密接觸，隨后將同樣大小的相對交配型菌株的菌餅以菌絲面朝下的方式置于聚碳膜上方，并與膜以及下方菌餅緊貼，使用封口膜封好后置于25° C黑暗條件下分別培養(yǎng)15d、30d、45d和60d后，計(jì)算辣椒疫霉卵孢子的產(chǎn)量。每個處理均有4個重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。 結(jié)果如表I.表I辣椒疫霉Sx-22和Sx-3在不同培養(yǎng)基上自交產(chǎn)生卵孢子的量
I /i V-siA Hi 存 V-10% Vs ιV;
__(> ( 3個/cm2)__(xitf 個,·__CxUJ3 IvZcm2) __
5 30 d 45 d _ J5d 30 d 45 cl 60 d 15d 30 d 45 i _ Sx-22 ndx I 23b 4.3b 5.4b nd nd 3,2a SJa ni 2,1 b 4.6b | 5.0b Sx-3 nd 5,4 ay 7J a TJ a nd 3.2 3_6 a 43 h nd 5.9 a 8,9 a 10,7 a Avmge — [ 4-2 5J 6J — .12 —2 M— 3J— — 4,0 6—8十 | 7.9 +表注xnd，未檢測到；y使用Fisher的統(tǒng)計(jì)方法比較0. 05水平下菌株產(chǎn)生卵孢子量的差異顯著性，相同字母代表沒有顯著性差異；z使用Fisher統(tǒng)計(jì)方法分析O. 05水平下菌株在其它培養(yǎng)基上產(chǎn)生卵孢子的量與在色氨酸培養(yǎng)基上產(chǎn)生量的差異顯著性，+和-分別代表顯著多于或是顯著少于。表I表明，辣椒疫霉在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)生卵孢子的量存在差異，從培養(yǎng)不同時(shí)間兩株自交菌株產(chǎn)生的平均卵孢子量可以看出，除30d時(shí)10%V8培養(yǎng)基上產(chǎn)生卵孢子的量與色氨酸培養(yǎng)基上產(chǎn)生的量無顯著性差異外，45和60d時(shí)10%V8蔬菜汁培養(yǎng)基上產(chǎn)生卵孢子的量都顯著高于其他培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)條件的篩選辣椒疫霉雜交卵孢子的產(chǎn)量將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的采自我國陜西以及河北的辣椒疫霉Hx-I (A1交配型)、Sx-2 (A2交配型)、Sx-3 (A2交配型)和Sx_22 (A1交配型)打取5mm大小的菌餅采用直接配對法即對峙培養(yǎng)的方法接于10%V8蔬菜汁培養(yǎng)基平板上(如圖2所示)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)為兩兩配對雜交，即Hx-I X Sx-2、Hx-I X Sx-3, Sx-22 X Sx-2和Sx_22 X Sx-3進(jìn)行雜交培養(yǎng)，使用封口膜封好后分別置于25° C下24h黑暗和24h光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理4次重復(fù)，分別于7d、15d、30d、45d和60d后計(jì)算卵孢子的產(chǎn)量。結(jié)果如表2。表2不同培養(yǎng)條件下4對辣椒疫霉雜交組合產(chǎn)生卵孢子的量
權(quán)利要求
1.一種提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量的方法，包括如下步驟用10%v8蔬菜汁培養(yǎng)基培養(yǎng)辣椒疫霉菌株，培養(yǎng)條件為黑暗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的時(shí)間為15天-60天，具體為45天-60天；所述培養(yǎng)的溫度為25°C -28°C，具體為25°C。
3.一種促進(jìn)辣椒疫霉卵孢子萌發(fā)的方法，包括如下步驟 (1)將辣椒疫霉卵孢子在黑暗條件下培養(yǎng)15-45天； (2)用質(zhì)量百分含量為0.05%—0. 25%的高錳酸鉀處理步驟(I)所得卵孢子； (3)將步驟(2)所得卵孢子在16h日光燈/8h黑光燈交替照射的條件下培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，培養(yǎng)的時(shí)間為15天、30天或45天； 所述步驟(2)中，所述高錳酸鉀的質(zhì)量百分含量為0. 1% — 0. 25%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，所述高錳酸鉀的質(zhì)量百分含量為0. 1%或0. 25%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，所述處理的方法為將所述卵孢子制成懸浮液，向懸浮液中加入高錳酸鉀，超聲處理20-40S。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，培養(yǎng)的時(shí)間為5天。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(I)和步驟(3)中，溫度為25°C -28°C，具體為25°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求3-8中任一所述的方法，其特征在于在所述步驟(I)之前，包括如下步驟用權(quán)利要求I或2所述方法制備辣椒疫霉卵孢子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量的方法及促進(jìn)卵孢子萌發(fā)的方法。本發(fā)明提供的提高辣椒疫霉卵孢子產(chǎn)量和促進(jìn)卵孢子萌發(fā)的方法，包括如下步驟用10%V8蔬菜汁培養(yǎng)基培養(yǎng)辣椒疫霉菌株，培養(yǎng)條件為黑暗，培養(yǎng)溫度為25°C-28°C。將辣椒疫霉卵孢子在黑暗條件下保持15-45天；用質(zhì)量百分含量為0.05%-0.25%的高錳酸鉀處理卵孢子后，制備卵孢子懸浮液，將其涂在S+L培養(yǎng)基上16h日光燈/8h黑光燈交替照射的條件下誘導(dǎo)卵孢子萌發(fā)。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)辣椒疫霉卵孢子大量產(chǎn)生及萌發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡易和有效的方法，為獲得大量辣椒疫霉單卵孢子群體用于抗藥性或其它遺傳學(xué)研究提供了保證。
文檔編號C12R1/645GK102807957SQ20121028443
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者劉西莉, 畢揚(yáng), 崔曉嵐, 王茜, 李健強(qiáng), 陳磊, 盧曉紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)