一種與大豆抗疫霉病相關(guān)的microRNA的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與大豆抗疫霉病相關(guān)的microRNA，屬于大豆分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆是一種重要農(nóng)作物，富含蛋白質(zhì)和脂肪以及對(duì)人體有利的活性成分如皂貳、 異黃酮、磷脂等，是世界上植物性蛋白和油分的主要來(lái)源之一。目前我國(guó)大豆種植面積、總 產(chǎn)及單產(chǎn)均居世界第四位，生產(chǎn)水平落后于世界大豆生產(chǎn)。2012年中國(guó)大豆種植面積718 萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量1280萬(wàn)噸，而進(jìn)口大豆達(dá)到創(chuàng)記錄的5750萬(wàn)噸，占據(jù)我國(guó)五分之四的大豆 市場(chǎng)。造成我國(guó)大豆生產(chǎn)滯后、供給嚴(yán)重不足、國(guó)內(nèi)大豆產(chǎn)業(yè)遭受進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆嚴(yán)重沖 擊的原因是多方面的，但主要原因之一是綜合抗病蟲(chóng)害和抗逆能力差，單產(chǎn)低，種植效益低 下，國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力弱。控制大豆合適的百粒重是實(shí)現(xiàn)大豆高產(chǎn)的有效辦法。但是，目前對(duì)可以 用于大豆育種過(guò)程中父母本篩選的標(biāo)記位點(diǎn)的報(bào)道較少，對(duì)于實(shí)現(xiàn)在育種前期對(duì)親本或者 雜交后代的百粒重遺傳背景進(jìn)行選擇的手段和方法還比較有限。
[0003] 通過(guò)對(duì)大豆抗病品種的篩選與鑒定，近些年在中國(guó)發(fā)現(xiàn)了許多抗病品種。由于新 的毒力小種的出現(xiàn)和長(zhǎng)期使用單一抗性品種，這些含有主效抗病基因的品種通?？共∮行?時(shí)間為8至15年。利用含有Rps抗病基因的栽培品種雖然能有效的控制大豆疫霉根腐病 的發(fā)生。但是隨著該品種種植年份的增長(zhǎng)，新的生理小種不斷出現(xiàn)，原有的抗病品種會(huì)逐漸 喪失抗性。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，miRNA為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過(guò)降解或抑制mRNA從而達(dá)到 負(fù)調(diào)控效果。由于miRNA在植物體中的這一重要角色，基于miRNA對(duì)植物抗病、耐性、生理 等方面的研宄日益增多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首先提供了一種與大豆抗疫霉病相關(guān)的microRNA :gma-miR482c-3p，其核 苷酸序列為：UUCCCAAUUCCGCCCAUUCCU。該microRNA所調(diào)控的靶基因 Glyma08g42971的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 所述gma-miR482c-3p與產(chǎn)生特異監(jiān)測(cè)蛋白的過(guò)程相關(guān)，涉及植物-病原 互作（Plant-pathogen interaction)通路中的應(yīng)答層面：Effector-triggered immunity(ETI)。ETI是通過(guò)產(chǎn)生特異的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測(cè)蛋白監(jiān)測(cè)病原菌產(chǎn)生的毒力蛋白，從而 達(dá)到對(duì)病原菌的高靈敏度的應(yīng)答。
[0006] 所述miRNA分子gma-miR482c_3p通過(guò)抑制或者降解的方式調(diào)控祀基因 Glyma08g42971。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種獲得gma-miR482c_3p的方法，一方面，通過(guò)比較疫霉根腐病 感染樣品與正常樣品的差異表達(dá)基因，結(jié)合軟件預(yù)測(cè)結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息，取交集，并進(jìn) 一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR確認(rèn)microRNA及其靶基因與大豆抗疫霉根腐病的關(guān)系；另一方面， 對(duì)篩選預(yù)測(cè)得到的miRNA-靶基因關(guān)系進(jìn)行歸納分類(lèi)，并對(duì)分類(lèi)結(jié)果的信息進(jìn)行歸納分析， 獲得與植物體積極適應(yīng)環(huán)境相關(guān)的通路的基因，進(jìn)一步確認(rèn)microRNA與大豆抗疫霉根腐 病相關(guān)。
[0008] 本發(fā)明所述的microRNA小分子gma-miR482c_3p的革El基因在接種疫霉根腐病菌 后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，不同時(shí)間段內(nèi)具有明顯變化，這一表達(dá)特性被基于莖環(huán)法的實(shí)時(shí)定 量PCR實(shí)驗(yàn)所驗(yàn)證，基于莖環(huán)法的實(shí)時(shí)定量PCR同時(shí)證實(shí)了 gma-miR482c-3p與其靶基因 Glyma08g42971的調(diào)控關(guān)系。本發(fā)明還通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)該miRNA小分子的功能進(jìn)行 了分析，進(jìn)一步證實(shí)了其與抗大豆疫霉根腐病相關(guān)。
[0009] 本發(fā)明通過(guò)比較疫霉根腐病感染樣品與正常樣品的差異表達(dá)基因，結(jié)合軟件預(yù)測(cè) 結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息，初步獲得候選mi CroRNA及其靶基因，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR確 認(rèn)microRNA及其革El基因與大豆抗疫霉根腐病的關(guān)系。同時(shí)還對(duì)miRNA-革El基因關(guān)系進(jìn)行聚 類(lèi)分析，并對(duì)聚類(lèi)分析結(jié)果進(jìn)行了注釋及代謝通路研宄，進(jìn)一步證實(shí)gma-miR482c-3p與抗 大豆疫霉根腐病相關(guān)。miRNA的抗病機(jī)制是通過(guò)作用于mRNA從而抑制或降解mRNA，從而達(dá) 到抗病效果的。目前已經(jīng)有大量的研宄是針對(duì)大豆抗疫霉根腐病的基因，而對(duì)大豆抗疫霉 根腐病的miRNA研宄鮮有報(bào)道。而抗病miRNA的提出，更是為抗病機(jī)制的研宄提供了一種 新的途徑。而gma-miR482c-3p對(duì)疫霉根腐病抗性的證明，為后續(xù)的研宄奠定了基礎(chǔ)，使后 續(xù)的研宄更為便捷。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1為miRNA-target關(guān)系預(yù)測(cè)韋恩圖。
[0011] 圖2為6個(gè)時(shí)間段內(nèi)，不同樣品中g(shù)ma-miR482c-3p、Glyma08g42971的表達(dá)量； CK :為不做任何處理的樣品，M :為不接種疫霉根腐病菌的樣品，T :為接種疫霉根腐病菌的 樣品。
[0012] 圖3為3個(gè)時(shí)間段內(nèi)miRNA與其預(yù)測(cè)靶基因的變化趨勢(shì)圖
[0013] 圖4為接種位置及方法圖示
[0014] 圖5為miRNA與植物-病原互作通路中功能位置標(biāo)注。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 在以下的實(shí)施方案中，除非特別說(shuō)明，否則所有操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 (第三版）（黃培堂等譯，北京：科學(xué)出版社，2002)所提供的方法進(jìn)行。
[0016] 實(shí)施例1預(yù)測(cè)篩選抗病gma-miR482c_3p
[0017] (1)篩選大豆中與抗疫霉根腐病相關(guān)的基因
[0018] 對(duì)侵染疫霉根腐病菌1號(hào)生理小種的綏農(nóng)10號(hào)大豆品種進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。采 用了侵染相同疫霉根腐病菌1號(hào)生理小種的SCKL，SML，STL0. 5, STL2和STL4這5個(gè)樣 品，用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit分別提取了總RNA作為測(cè)序樣品，樣品的表達(dá)譜 測(cè)序由華大基因完成。其中，SCKL為不做任何處理的樣品，SML為不接種疫霉根腐病菌 的樣品，STL0. 5、STL2、STL4為接種疫霉根腐病菌后分別于0. 5h、2h、4h取樣的樣品。接 種位置及方法如圖4所示，在SCKL，SML，STL0. 5, STL2, STL4這5個(gè)樣品的表達(dá)譜測(cè) 序數(shù)據(jù)中，一共檢測(cè)到33683個(gè)拼接序列片段。采用算法l〇g2Rati 〇(RPKM(Sample2)/ RPKM(samplel))對(duì)樣品間具有表達(dá)量變化的序列片段進(jìn)行了篩選，得到差異表達(dá)基因，當(dāng) log2Ratio(RPKM(sample2)/RPKM(samplel)) |>1時(shí)，說(shuō)明該基因在樣品1與樣品2之間為 差異表達(dá)基因。經(jīng)過(guò)上述方法的篩選，得到較為可靠的7401個(gè)受疫霉根腐病影響，發(fā)生表 達(dá)量變化的基因。
[0019] 其中，測(cè)序結(jié)果由RPKM表示基因的表達(dá)量，RPKM計(jì)算公式為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與大豆抗疫霉病相關(guān)的microRNA:gma-miR482c-3p，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。
2. -種權(quán)利要求1所述microRNA調(diào)控的靶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. -種獲得權(quán)利要求1所述microRNA的方法，其特征在于，通過(guò)比較疫霉根腐病感染 樣品與正常樣品的差異表達(dá)基因，結(jié)合軟件預(yù)測(cè)結(jié)果、數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息，取交集，獲得候選 microRNA及其靶基因，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR確認(rèn)microRNA及其靶基因與大豆抗疫霉 根腐病的關(guān)系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，對(duì)候選的miRNA-靶基因關(guān)系進(jìn)行生物信 息學(xué)的聚類(lèi)分析，獲得與植物體積極適應(yīng)環(huán)境相關(guān)的通路的基因，進(jìn)一步確認(rèn)microRNA與 大豆抗疫霉根腐病相關(guān)。
5. 權(quán)利要求1所述的miRNA分子在調(diào)控靶基因Glyma08g42971中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的miRNA分子在大豆抗疫霉根腐病中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p通過(guò)抑 制或者降解的方式調(diào)控靶基因Glyma08g42971的表達(dá)，達(dá)到抗疫霉根腐病的效果。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA分子gma-miR482c-3p涉及植 物-病原互作通路中的應(yīng)答層面，所述植物-病原互作通路中的應(yīng)答層面是通過(guò)產(chǎn)生特異 的細(xì)胞內(nèi)監(jiān)測(cè)蛋白監(jiān)測(cè)病原菌產(chǎn)生的毒力蛋白，從而達(dá)到對(duì)病原菌的高靈敏度的應(yīng)答。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種與大豆抗疫霉病相關(guān)的microRNA，屬于大豆分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)與已知抗病免疫相關(guān)基因的篩選得到抗疫霉病基因223個(gè)，miRNA256個(gè)。利用表達(dá)譜測(cè)序、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳镄畔W(xué)分析以及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)建立了與抗病相關(guān)miRNA-Target預(yù)測(cè)系統(tǒng)，可預(yù)測(cè)miRNA的功能，大大提高了大豆抗疫霉病基因以及miRNA的篩選鑒定效率。本發(fā)明提供了對(duì)MIRNA-target關(guān)系進(jìn)行分類(lèi)的方法，發(fā)現(xiàn)了通路Plant-pathogen interaction在對(duì)疫霉菌的防御中起到十分關(guān)鍵的作用。并證實(shí)了gma-miR482c-3p是通路Plant-pathogen interaction中的主要成分并與大豆對(duì)疫霉根腐病的抗病緊密相關(guān)。
【IPC分類(lèi)】A01P3-00, C12N15-10, A01N57-16, C12N15-31, C12N15-113
【公開(kāi)號(hào)】CN104726457
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510166506
【發(fā)明人】朱榮勝, 陳慶山, 辛大偉, 劉春燕, 胡振幫, 蔣洪蔚, 齊照明, 韓雪, 王志豪
【申請(qǐng)人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2015年4月9日