專利名稱：一種纖維二糖水解酶Tccel7A及其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種纖維ニ糖水解酶Tccel7A及其編碼基因及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
纖維素主要是植物利用ニ氧化碳和水在太陽光能作用下通過光合作用合成的地球上最豐富的可再生的生物質(zhì)(biomass)資源。纖維素是多個葡萄糖殘基以β_1，4-糖苷鍵連接而成的多聚物，其基本重復(fù)單位為纖維ニ糖。天然纖維素的基本結(jié)構(gòu)是由原纖維構(gòu)成的微纖維束集合而成。原纖維是由15-40根有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)構(gòu)成的纖維素分子長鏈所組成。纖維素的結(jié)晶部分是由纖維素分子進(jìn)行非常整齊規(guī)則地折迭排列形成。在天然纖維素中，木質(zhì)素和半纖維素形成牢固結(jié)合層，緊密地包圍纖維 ^(Zhang PYH, Lynd LR. 2004. Toward an aggregated understanding οι enzymatichydrolysis of cellulose:noncomplexed cellulase systems.Biotechnology andBioengineering, 88:797-824)。纖維素的降解通過纖維素酶的作用實現(xiàn)。纖維素酶是能將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一系列酶的總稱，主要包括內(nèi)切-1，4-β -D-葡聚糖酶(endo-Ι，4_β -D-glucanase，EC3. 2.I. 4)、纖維ニ糖水解酶[cellobiohydrolase, EC3. 2. I. 91;又叫外切 _1，4-β -D-葡聚糖酶(exo-1, 4- β -D-glucanase)]和 β-葡萄糖音酶(β -glucosidase, EC3. 2. I. 21) (ZhangPYHj Himmel ME, Mielenz JR. 2006. Outlook for ceilulase improvement: screening andselection strategies. Biotechnol Advan，24:452-481)。內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶(以下簡稱內(nèi)切葡聚糖酶)作用于纖維素分子內(nèi)部，隨機水解纖維素分子內(nèi)的β_1，4-糖苷鍵，產(chǎn)生短的纖維素鏈，暴露出新的纖維素末端。纖維ニ糖水解酶以有序方式(processive manner),沿著纖維素末端(還原端或非還原端)由外向內(nèi)水解β_1，4-糖苷鍵，釋放纖維ニ糖；此外，纖維ニ糖水解酶也作用于結(jié)晶纖維素，將纖維素長鏈從結(jié)晶區(qū)中剝離出來(Teeri TT. 1997. Crystallinecellulose degradation:new insight into tne function of cellobiohydrolase.Trends Biotechnol，1997，15:160-167)。β -葡萄糖苷酶將纖維ニ糖或其它可溶性的纖維寡糖水解成葡萄糖分子，可消除纖維ニ糖對內(nèi)切葡聚糖酶和纖維ニ糖水解酶的反饋抑制。在這三類酶的協(xié)同作用下，纖維素最終被水解為葡萄糖(Lynd LR，Weimer PJj WillemH Zj et al. 2002. Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol Biol Rev，66 :506-577 ;Zhang YHj Lynd LR. 2004. Toward an aggregatedunderstanding of enzymatic hydrolysis of cellulose:noncompIexed cellulasesystems. Biotechnology andBioengineering，88:797-824)。微生物是纖維素酶最主要的來源。目前，用于生產(chǎn)纖維素酶較多和研究最透徹的微生物是絲狀真菌(孟雷，陳冠軍，王怡等.2002，纖維素酶的多型性.纖維素科學(xué)與技術(shù)，10:47-55)。其中纖維素酶活力較強的主要為來自曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus )、木霉(Trichoderma)和青霉(Pinicielium)屬的菌株，尤以木霉屬菌株居多、活力最高，較為典型的有瑞氏木霉(Trichoderma reesei)、綠色木霉(Trichodermaviride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)，其中瑞氏木霉Rut_C30是目前公認(rèn)的最好的纖維素酶生產(chǎn)菌株(Martins LFj Rolling D，Camassola M，et al. 2008. Comparisonof Penicillium echinulatum and Trichoderma reesei ceilulases in relation totheir activity against various cellulosic substrates. Bioresource Technology,99:1217-1224;Gusakov AV.2011. Alternatives to Trichoderma reesei in biofuelproduction. Trends Biotechnology，29:419—425;Le Crom Sj Schackwitz W，PennacchioL，et al. 2009. Tracking the roots of cellulase hyperproduction by the fungusTrichoderma reesei using massively parallel DNA sequencing. Proc NatlAcad SciUSA,106:16151-16156)o在木霉的天然纖維素酶系中，纖維ニ糖水解酶占的比重很大，占到60% 80%。其中纖維ニ糖水解酶I (cellobiohydrolase I，CBH I )占50 60%，纖維ニ糖水解酶II(cel lobiohydrolase II，CBH II)占 20% 左右(Markov AV, Gusakov AV, Kondratyeva EG，et al.2005. New effective methoa ior analysis of the component composition oi enzyme complexes from Trichoderma reesei. Biochemistry，70:657-663)。纖維ニ糖水角軍酶在纖維素酶對結(jié)晶纖維素的水解過程中起非常重要的作用(Lynd LR, Weimer PJ, WillemH Z, et al. 2002. Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology.Microbiol Mol Biol Rev,66:506-577)。對纖維ニ糖水解酶I的研究，對于高效地降解天然纖維素中的結(jié)晶纖維素具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供一種纖維ニ糖水解酶Tccel7A及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白，為纖維ニ糖水解酶，命名為Tccel7A，來源于奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株 BM48-3,是如下 Ca)或(b)或(c)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維ニ糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列3由509個氨基酸殘基組成，為了便于蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)，還可在蛋白的氨基末端添加上信號肽序列。該蛋白自氨基末端(N端)第1-17位氨基酸殘基為信號肽(signal peptide)序列。上述蛋白中，所述ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的TcCel7A便于純化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I.為標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列
Poly-Arg__5-6 (通常為5個)RRRRR_
Poly-His2-10 (通常為 6HHHHHH個、
—FLAG_ 8_ DYKDDDDK _
Strep-tag _11 — 8 _ WSHPQFEK _
c-myc10EQKLISEEDL
上述(b)或(c)中的Tccel7A可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的Tccel7A的編碼基因可通過將序列表中序列2的自5端第I至1527位堿基所示的DNA序列中缺失ー個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行ー個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼上述蛋白的基因TCCe17A/CTCCel7A也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述基因可為如下I) -5)中任一所示的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列2自5'末端第52-1527位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有纖維ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有纖維ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在O. I X SSPE (或O. I X SSC)，O. 1%SDS的溶液中，在65° C下雜交并洗膜。上述序列表中的序列I由1653個脫氧核糖核苷酸組成，為Tccel7A的基因組基因，含有3個外顯子和2個內(nèi)含子，自5'端的第I至451位核苷酸為Tccel7A的外顯子1，自Y端的第452至512位核苷酸為Tccel7A的內(nèi)含子1，自Y端的第513至1207位核苷酸為Tccel7A的外顯子2，自5'端的第1208至1269位核苷酸為Tccel7A的內(nèi)含子2，自5'端的第1270至1651位核苷酸為Tccel7A的外顯子3，自5'端的第1651至1653位核苷酸為Tccel7A的終止密碼子TAA。上述序列表中的序列2由1530個脫氧核糖核苷酸組成，為Tccel7A的cDNA基因(cTccel7A),自5 '端的第I至1530位核苷酸為cTccel7A的開放閱讀框(Open ReadingFrame, ORF),自5'端的第1-3位核苷酸為CTCCe17A的起始密碼子ATG，自5'端的第1528-1530位核苷酸為cTccel7A的終止密碼子TAA，自5^端的第1_51位核苷酸為編碼信號肽的核苷酸。含有上述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述重組表達(dá)載體為將編碼上述蛋白的基因插入表達(dá)載體，得到表達(dá)所述蛋白的重組表達(dá)載體；上述表達(dá)載體可為在巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達(dá)的pPIC9、pPIC3、pHIL-Dl、pA0804、pA0815、pPSC3K 或 pPIC9K。重組表達(dá)載體具體為在 pPIC9K 的Avr II和Not I酶切位點間插入序列表中的序列2的自5'端第52至1527位脫氧核苷酸得到的重組表達(dá)載體PGXN9K4831。上述重組菌為將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，得到的重組菌；所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為酵母菌；所述酵母菌具體可為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏畢赤酵母優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GSl 15, KM71 (可購自美國Invitrogen公司)或SMDl 168 (可購自美國Invitrogen公司)。本實施例為GXN9K4831-16，宿主菌為巴氏畢赤酵母GS115。擴(kuò)增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述蛋白在作為纖維ニ糖水解酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
上述基因或上述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備纖維ニ糖水解酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的另ー個目的是提供一種制備纖維ニ糖水解酶的方法。本發(fā)明提供方法，為發(fā)酵上述的重組菌，即得到纖維ニ糖水解酶。上述方法中，所述發(fā)酵的培養(yǎng)基為BMMY培養(yǎng)基；所述發(fā)酵為在甲醇誘導(dǎo)下進(jìn)行，甲醇在發(fā)酵體系中的終濃度可為O. 5-1. 0% (體積
百分含量)。所述發(fā)酵具體為將重組菌GXN9K4831-16在BMMY培養(yǎng)基中28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)；且每12h向培養(yǎng)產(chǎn)物中加入甲醇，前24h加入甲醇至終濃度1% (體積百分含量)，24h以后加入甲醇至終濃度I. 5%(體積百分含量);共振蕩培養(yǎng)60h，得到纖維ニ糖水解酶Tccel7A。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株BM48-3中克隆得到了一個新的纖維ニ糖水解酶基因TCCe17A/CTCCel7A，可在宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因以生產(chǎn)纖維ニ糖水解酶Tccel7A，用于纖維素的降解。對該纖維ニ糖水解酶Tccel7A進(jìn)行酶活相關(guān)分析，其酶促反應(yīng)的最適PH為5. O、最適溫度為45°C;在最適pH和最適溫度下，該酶對底物對硝基苯基-β-D-纖維ニ糖苷(p-nitrophenyl β -D-cellobioside, pNPC)的比活力為O. 62U/mg ;而且ImMol/L的Ca2+可以把纖維ニ糖水解酶Tccel7A的活性提高16. 08%,達(dá)到 0.72U/mg。


圖I為提取的木霉BM48-3基因組DNA電泳圖。圖2為含有木霉BM48-3的全長Tccel7A基因的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖3為提取的木霉BM48-3的總RNA電泳圖。圖4為含有木霉BM48-3的全長Tccel7A cDNA基因(cTccel7A)的PCR產(chǎn)物的電泳圖。圖5為重組質(zhì)粒pGXN9K4831的Sal I酶切線性化產(chǎn)物的電泳圖。圖6為重組畢赤酵母GXN9K4831鑒定的菌落PCR產(chǎn)物電泳圖。圖7為重組畢赤酵母GXN9K4831在含800 μ g/mL抗生素G418的YPD培養(yǎng)基平板上長出的單菌落。
圖8為純化的纖維ニ糖水解酶TcCel7A的SDS-PAGE分析和酶譜分析。圖9為纖維ニ糖水解酶TcCe17A的最適作用pH曲線。圖10為纖維ニ糖水解酶TcCel7A的最適作用溫度曲線圖11為纖維ニ糖水解酶TcCe17A的pH耐受性曲線圖12為纖維ニ糖水解酶TcCe17A的溫度耐受性曲線圖13為纖維ニ糖水解酶TcCel7A的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax的確定。圖14為纖維ニ糖水解酶TcCel7A水解濾紙的產(chǎn)物的HPLC分析圖譜。
具體實施方式
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的百分比％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值或平均值土標(biāo)準(zhǔn)差。以下實施例中的轉(zhuǎn)速，均為在半徑為4. 5-5. 5cm的離心半徑下的轉(zhuǎn)速。下述實施例中所用到的材料包括表達(dá)載體pPIC9K(購自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為V17520);巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115 (購自Invitrogen公司，產(chǎn)品目錄號為C18100);限制性內(nèi)切酶Avr II、Not I和Sal I , DNA聚合酶，PrimerStar等試劑購自Takara公司。下述實施例中BMMY培養(yǎng)基每升含有胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，IOOmLlM磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，IOOmL 10XYNB，2mL 500X 生物素，5mL 甲醇。IM 磷酸鉀緩沖液(K2HPO4-KH2PO4 緩沖液，pH 6. 0)132mL IM K2HPO4 溶液與 868mLlM KH2PO4溶液混合，調(diào)節(jié)pH至6. O。配制好后高壓滅菌。10XYNB 即 13. 4%YNB :100m L 水中加入 13. 4gYNB。500X 生物素即 O. 002% 生物素IOOmL水中加入20mg生物素。10XYNB、500X生物素需單獨配制并過濾除菌并4°C保存。配制BMMY時先將20g胰蛋白胨和IOg酵母提取物溶于700mL去離子水井高壓滅菌，待用之前添加其它成分。下述實施例中纖維ニ糖水解酶的酶活檢測方法如下以對硝基苯基-β -D-纖維ニ糖苷(p-nitrophenyl-β -D-cellobioside, pNPC)為底物測定纖維ニ糖水解酶的活力，參照 Odoux 等所描述的方法(Odoux E, Escoute J, Verdeil L, et al. 2003. Localizationof β -glucosidase activity and glucovanil丄in in vanilla bean. Ann Botany,92:437-444)。具體步驟如下I)、用去離子水配制IOmM的對硝基苯酹(p-NP, p-Nitrophenol)標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行5個梯度稀釋(KT1-KT5);取140 μ I每個稀釋度的ρ-ΝΡ溶液，分別加入70μ I 0. 4Μ的Na2CO3溶液，用移液器小心吸打混勻，避免出現(xiàn)氣泡。取200 μ I混合液，加入96孔酶標(biāo)板，410nm處測定光吸收值；得到光吸收值和p_NP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)式為y=9. 363x+0. 0271 (R2=O. 9988), y 為光吸收值(OD410)，x 為 p-NP 濃度(mM)。2)、用去離子水配制25mM的p-NPC溶液作為底物，用小管分裝，管外用鋁箔包裹避光，保存于_20°C冰箱。3)、向L5ml EP管中加入58 μ I特定pH值的緩沖液和14 μ I 25mM的p_NPC溶液，放置于一定溫度的水浴鍋中預(yù)熱5min,加入68 μ I酶液,一定溫度下保溫反應(yīng)一段時間,カロ入70 μ I O. 4Μ的Na2CO3溶液以終止酶促反應(yīng)，取200 μ I反應(yīng)液，加入到96孔酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀于410nm處測定光吸收值；根據(jù)制作的p_NP標(biāo)準(zhǔn)曲線和光吸收值，計算反應(yīng)體系中產(chǎn)生P-NP的量和酶活力。纖維ニ糖水解酶活力単位(U)的定義一定條件下，酶水解pNPC，每min催化產(chǎn)生Ιμπιο ρ_ΝΡ所需的酶量為ー個酶活力單位(U)。比酶活定義姆mg蛋白質(zhì)所含的酶活力(U/mg)。實施例I、蛋白Tccel7A的基因組DNA和cDNA的獲得一、奶油木霉(Trichoderma cremeum)菌株 BM48-3 的獲得I、土壤樣品的采集采集中國云南省迪慶藏族自治州白馬雪山國家自然保護(hù)區(qū)奔子欄轄區(qū)約5-20cm淺土層的土壌。
2、菌株的分離篩選(I)用蒸餾水配制分離培養(yǎng)基；每升分離培養(yǎng)基中含有=KH2PO4 2. 0g、(NH4)2SO4I. 4g、尿素 O. 3g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 O. 3g、FeSO4 · 7H20 5. Omg、MnSO4 .H2Ol. 56mg、ZnSO4 · 7H20 I. 4mg、CoCl2 2. Omg,Avicel (Sigma PH101) 10g、瓊月旨 15g ；pH5. 0 ;121°C濕熱滅菌20min ;滅菌后冷卻至45_50°C時倒平板。(2)取IOg 土樣放入250ml三角燒瓶，加入90ml無菌水并加入適量的玻璃珠，于磁力攪拌器上攪拌30min,使土樣與水充分混合,將細(xì)胞分散。取Iml 土壤懸液加入盛有9ml無菌水的指形瓶中充分混勻，然后從中取Iml至另一盛有9ml無菌水的指形瓶中，混勻，以此類推制成10'10_2、10_3不同稀釋度的土壌溶液，各取100 μ I涂布在分離培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)。(3) 3-5天后，觀察真菌菌落生長情況，挑選單菌落，轉(zhuǎn)接到新的分離培養(yǎng)基上，劃線分離純化。(4)配制pH 5. O的基本培養(yǎng)基(液體)。每升基本培養(yǎng)基中含有KH2PO4 2. Og,(NH4)2SO4 I. 4g、尿素 0. 3g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g、FeSO4 · 7H20 5. Omg、MnSO4 · H2OI. 56mg>ZnSO4 *7H20 I. 4mg、CoCl2 2. 0mg、Tween_80 2ml、蛋白腺 I. 0g、鉄皮 20g、Avicel (結(jié)晶纖維素，Sigma PHlODlOg ;用800ml去離子水溶解，然后調(diào)節(jié)pH值至5. O (用IM HCl水溶液或IM NaOH水溶液調(diào)節(jié))；用去離子水定容至IL ;121°C濕熱滅菌20min。(5)將步驟(3)得到的產(chǎn)纖維素酶的真菌菌株接種至基本培養(yǎng)基(液體)中，28°C、ISOrpm培養(yǎng)5-7天，取上清液，以結(jié)晶纖維素(Avicel)為底物進(jìn)行纖維素酶活力測定，從中篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株BM48-3。3、菌株的鑒定菌株BM48-3的分子鑒定；具體鑒定步驟如下提取菌株BM48-3的總DNA 并作為模板，利用通用引物 ITSl (5 ' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 ')和 ITS4(5' TCCTCCGCTTATTGATATG3' )，PCR擴(kuò)增得到其ITS，經(jīng)測序獲得一條606bp的核苷酸序列。ITS同源性比對分析表明其與Hypocrea cremea菌株GJS 91-125的ITS(GenBank登錄號AY737760)的比對得分最高，序列覆蓋度為100%，一致性為99%。根據(jù)分子鑒定結(jié)果，參照木霉屬菌株的無性型和有性型命名，將菌株BM48-3初步鑒定為奶油木霉(Trichodermacremeumノ。
ニ、蛋白Tccel7A的基因組DNA的克隆I、木霉菌株BM48-3的基因組DNA的提取參考周小玲等人的方法(周小玲，沈微，饒志明，等.2004. ー種快速提取真菌染色體DNA的方法.微生物學(xué)通報，31:89-92.)。具體步驟如下(I)在PDA平板上活化低溫保存的木霉菌株BM48-3，28°C培養(yǎng)3至5天。(2)將活化好的木霉菌株BM48-3轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基(每升含有蛋白胨3g、酵母提取物 O. 5g、葡萄糖 10g、K2HP044g、(NH4) 2S042g、CaCl2O. 35g、MgSO4 · 7Η200· 3g)中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)3天。(3)先用八層無菌紗布過濾培養(yǎng)物以收集菌體，沖洗菌絲，再用無菌吸水紙吸取菌絲的水分，盡量使菌體干燥，便于研磨。 (4)將菌絲體倒入已滅菌并用液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，不斷迅速加入液氮，快速有力研磨。需始終保持研缽內(nèi)有少量液氮，使菌絲體一直處于低溫環(huán)境。(5)待菌絲體被研磨至粉末狀，將大約100μ L體積的粉末移至I. 5mL離心管中，立刻加入600 μ L真菌DNA提取液(200mM Tris-HCl, IOmM EDTA, 1%SDS, 500mMNaCl,pH8. 0)，吹打混勻，室溫放置IOmin。(6)加入等體積的苯酹/氯仿混合液，用カ振蕩混合，10，OOOrpm離心lOmin。(7)吸取400 μ L上清液至新的I. 5mL離心管中，重復(fù)步驟(6)。(8)吸取上清液至新的I. 5mL離心管中，加入兩倍體積的無水こ醇，輕輕上下顛倒混勻，_20°C放置30min。(9) 12，OOOrpm離心15min,輕輕將液體倒出，加入75%こ醇洗漆沉淀，13，OOOrpm離心2min。再用75%こ醇重復(fù)洗滌沉淀一次。(10)室溫晾干沉淀至呈半透明色，加入20μ L IXTE溶液溶解沉淀。(11)電泳檢測提取的總DNA (圖I)。2、擴(kuò)增蛋白Tcce17Α的基因組DNA的引物分析了 4個已經(jīng)發(fā)表的木霉屬菌株的cbh I基因的核苷酸序列緑色木霉(Hypocrea virens)菌株 UKMl 的 cbh I (GenBank 登錄號 EU872026)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的 cbh I (GenBank 登錄號 AF223252)、木霉屬菌株 XSTl 的cbh I (GenBank 登錄號 AY368686)和綠色木霉(Trichoderma viride)菌株 AS3. 3711 的cbh I (GenBank 登錄號 AB021656),借助網(wǎng)站 http://blocks, fhcrc. org/codehop. html設(shè)計出PCR擴(kuò)增Tccel7A基因(DNA)的簡并引物cbh I-3 f和cbhl_3r，引物cbhト3f的序列為5 ' -ATGTATCRGAARTTGGCCGTCA-3 '，引物 cbhl_3r 的序列為5 ' -AGGCACTGAGAGTAGWATGGGTTC-3;。3、蛋白Tccel7A的基因組DNA的克隆以菌株BM48-3基因組DNA為模板，以引物cbhl_3f和cbhl_3r為引物，PCR擴(kuò)增得到1653bp PCR產(chǎn)物(圖2)。將PCR產(chǎn)物與載體pMD18_T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α菌株，涂布在表面涂有X-gal和IPTG的含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)過夜，隨機挑取平板上長出的白色菌落，提取質(zhì)粒，用EcoRI和PstI雙酶切驗證重組質(zhì)粒，將雙酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定。將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒寄送上海生物工程有限公司采用雙脫氧核苷酸法對該基因進(jìn)行雙向雙鏈測序。用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的軟件 Blast (nttp: / /www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)對序列進(jìn)行分析，該質(zhì)粒上克隆的PCR廣物的基因具有序列表中序列I所示的核苷酸，該基因命名為Tccel7A。序列表中序列I自5'端的第1_3位核苷酸為Tccel7A的起始密碼子ATG，自5 ^端的第1651-1653位核苷酸為Tccel7A的終止密碼子TAA。Tccel7A基因的完整DNA序列長度為1653bp，其中包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。第ー個內(nèi)含子長度為61bp，第二個內(nèi)含子長度為62bp。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列3，該蛋白命名為Tccel7A。也可人工合成序列I。三、蛋白Tccel7A的cDNA的克隆I、木霉菌株BM48-3總RNA的提取用Trizol法提取菌株BM48-3的總RNA。具體步驟如下 (I)將菌株BM48-3接種至RNA提取液體培養(yǎng)基內(nèi)，該培養(yǎng)基每升含有酵母提取物 lg、Avicel PH-101 30g、(NH4)2SO4 2. 8g,K2HPO4 4g、MgSO4 · 7H20 0. 6g、CaCl2O. 5g、Urea0. 6g、Tween-80 2mL、微量元素 0. ImL, pH 調(diào)至 5. 0。微量元素每升含有FeS04 · 7H20 10g、MnSO4 · H2O 3. 2g、ZnSO4 · 7H20 2. 8g、CoCl2 4. 0g。28°C、200rpm 振蕩培養(yǎng) 3 天。(2)收集菌體，用DEPC水沖洗菌絲，滅菌紗布過濾。用滅菌的吸水紙吸去菌絲體表面水分，使菌絲團(tuán)盡量干、薄。(3)將菌絲體倒入已滅菌并用液氮預(yù)冷的研缽內(nèi)，不斷迅速加入液氮，快速有力研磨。研磨大約三次左右，按50-100mg菌絲體加入ImL Trizol的量加入60°C預(yù)熱的Trizol。(4)吹打混勻，室溫放置 5min，4°C、12000rpm 離心 lOmin。(5)吸取上清液至新的I. 5mL離心管中，按姆mL Trizol加入200 μ L氯仿,振蕩混勻至液體呈乳白色，室溫放置lOmin。(6) 4°C、12，OOOrpm離心lOmin，吸取上層水相至新的離心管中。(7)按姆mL Trizol 加入 500 μ L 的異丙醇，混勻，室溫放置 lOmin。4°C> 12, OOOrpm離心lOmin,輕輕棄去上清液。(8)加入ImL 75%こ醇，渦旋離心管，使沉淀懸浮。4°C、8000rpm離心5min，盡量吸
干上清。(9)真空干燥或室溫晾干5 lOmin。加入30 50 μ L DEPC處理水溶解RNA。(10)ΤΒΕ瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，測量OD值判斷總RNA的濃度和純度(0D26CI/28Q)。(11)加入適量無RNase I活性的DNase I (Takara公司)，消化掉溶液中殘余的DNA，操作步驟、反應(yīng)體系按Takara公司說明書進(jìn)行和配制，得到總RNA (圖3)。2、cDNA第一鏈的合成使用Takara 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA synthesis 試劑盒合成 cDNA的第一鏈，操作步驟及反應(yīng)體系按該公司的說明書進(jìn)行和配制。3、蛋白 Tccel7A 的 cDNA 的克隆根據(jù)Tccel7A基因的完整DNA序列，設(shè)計引物cbhl_48f(5' -CACATGTATCGGAAGTTGGCC-3')和 cbhl_48r (5 ' -CTATTACAGGCACTGAGAGTAG-3')，以上述合成的cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增得到1530bp PCR產(chǎn)物(圖4)。
將上述擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物寄送上海生物工程有限公司采用雙脫氧核苷酸法對該PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向雙鏈測序。用NCBI (National Center for BiotechnologyInformation, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)上的軟件 Blast (nttp:"www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)對序列進(jìn)行分析，該PCR產(chǎn)物的基因具有序列表中序列2所示的核苷酸，該基因命名為cTCCel7A。序列表中序列2的DNA自5'端的第1_3位核苷酸為CTCCe17A的起始密碼子ATG，自5'端的第1528-1530位核苷酸為cTccel7A的終止密碼子TAA，自5'端的第1-51位核苷酸為編碼信號肽的核苷酸。cTCCel7A基因的完整DNA序列長度為1530bp。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列3 (509個氨基酸)，其中自N’末端第1-17位為信號肽，該蛋白命名為Tccel7A。序列2可人工合成。實施例2、蛋白Tccel7A及其編碼基因CTCCe17A的功能驗證

一、含有cTccel7A基因重組質(zhì)粒pGXN9K4831的構(gòu)建為了在pPIC9K系統(tǒng)中表達(dá)cTccel7A，人工合成cTccel7A基因的除了編碼信號肽和終止密碼子以外的全部編碼序列(即自序列表中序列2的5 '端第52-1527位核苷酸。以人工合成的序列表中序列2的5 '端第52-1527位所示的核苷酸為模板，以48hfl (5; -TACCTAGGCATCATCATCATCATCATCAGTCGGCCTGCACCCTAACA-3')和 48hrl(5' -CCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGAGAGTAGTATG~3/ )(斜體序列編碼組氨酸標(biāo)簽)為引物，得到1479bp PCR產(chǎn)物。該1479bp PCR產(chǎn)物表達(dá)的蛋白的氨基酸序列為序列表中序列3自N’末端第18-509位氨基酸殘基。將上述PCR產(chǎn)物用Avr II和Not I酶切，得到的酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的PPIC9K載體骨架連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGXN9K4831。經(jīng)過測序，該pGXN9K4831為將序列表中序列2的5 ^端第52-1527位所示的核苷酸插入pPIC9K的Avr II和Not I位點間得到的重組表達(dá)載體；其中起始密碼子和終止密碼子由表達(dá)載體PPIC9K提供。表達(dá)產(chǎn)物的N端和C端都有一個由表達(dá)載體提供的His標(biāo)簽(6XHis Tag)。ニ、含有cTccel7A基因重組畢赤酵母的構(gòu)建用Sal I酶線性化含cTccel7A的質(zhì)粒pGXN9K4831以及對照空載體pPIC9K，用線性化的質(zhì)粒DNA電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GSl 15，具體如下I、畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備(I)挑取2個生長良好、直徑約為2mm的畢赤酵母GS115單菌落,接種至含5mLYB)培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基中含有胰蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g)的指形瓶中。28 V、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。(2)吸取500 μ L菌液，接至含IOOmL YI3D培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)IOh左右至0D_=0. 8 I. 3。(3)將菌液移至40mL圓底離心管中，4°C、2500rpm離心3min，輕輕拍打管底，用30mL預(yù)冷的無菌水將沉淀重懸。(4) 4°C、2500rpm離心3min，用30mL預(yù)冷的IM山梨醇將沉淀重懸。(5)重復(fù)步驟(4)。(6)4°C、2500rpm離心3min，輕輕倒掉上清，利用離心管里殘余的IM山梨醇重懸沉淀的菌體，制備成畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。(7)將畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞按每管100 μ L分裝到預(yù)冷的離心管中并盡快用于后續(xù)的電擊轉(zhuǎn)化。2、重組質(zhì)粒pGXN9K4831和空載體pPIC9K電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115(I)分別用Sal I酶酶切線性化重組質(zhì)粒PGXN9K4831和空載體pPIC9K，純化酶切產(chǎn)物(圖5，其中I為空載體pPIC9K酶切產(chǎn)物電泳圖，2為重組質(zhì)粒pGXN9K4831酶切產(chǎn)物電泳圖)。(2)將10 μ L (約5 μ g)線性化后的質(zhì)粒與100 μ L畢赤酵母感覺態(tài)細(xì)胞輕輕混勻，置于冰水混合物中。(3)設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù)為電壓1.5kV、電容25 yF、電阻200 Ω、電擊時間為 4 IOmSec,進(jìn)行電擊。(4)電擊完畢后，迅速加入900 μ L預(yù)冷的IM山梨醇溶液，混勻，將菌懸液均勻涂布于MD平板上(按100 μ L涂布I個平板)。(5)將平板倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至2 4天后單菌落出現(xiàn)；得到轉(zhuǎn)PGXN9K4831的單菌落和轉(zhuǎn)空載體pPIC9K的對照單菌落。3、重組畢赤酵母的篩選與鑒定將MD平板上長出的轉(zhuǎn)pGXN9K4831的單菌落和轉(zhuǎn)空載體pPIC9K的對照單菌落(保證單菌落在1000個以上)分別用液體MD培養(yǎng)基全部洗下，通過G418濃度梯度篩選帶多拷貝的重組子。將洗下的菌落稀釋至一定濃度，均勻地涂在G418濃度為100、200、500、800、1000、1200、1500 μ g/mL 的系列 YPD 平板上。在高濃度G418平板上挑取單菌落和對照單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定；所用引物為 5 ' AOX (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ')和 3 ' AOX(5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')。PCR反應(yīng)體系為:10XEx Taq緩沖液 2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM) 2 μ L，兩種引物各 I μ L，畢赤酵母細(xì)胞適量，Ex Taq DNA聚合酶O. 25 μ L，ddH20 18. 25 μし反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘，92°C變性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸I. 5分鐘，35個循環(huán)，最后，72°C延伸5分鐘。轉(zhuǎn)化pGXN9K4831得到的單菌落的PCR結(jié)果見圖6，得到2000bp的PCR產(chǎn)物的為陽性重組菌，從G418濃度為800、1000、1200 μ g/mL的YPD平板上長出的多個酵母單菌落中共得到30個陽性重組菌，分別命名為GXN9K4831-1 30。轉(zhuǎn)化空載體pPIC9K得到的對照單菌落得到500bp的PCR產(chǎn)物，其為陰性對照重組菌,命名為GXN9K。轉(zhuǎn)化pGXN9K4831單菌落在含800 μ g/mL抗生素G418的YPD培養(yǎng)基平板上長出的單菌落如圖7所示。三、誘導(dǎo)重組畢赤酵母中cTccel7A基因表達(dá)纖維ニ糖水解酶I、重組畢赤酵母GXN9K4831-1 30的cTccel7A基因的誘導(dǎo)表達(dá)(I)挑取上述驗證得到的30個直徑約2mm、生長良好的GXN9K4831_f 30，分別接種至含5mL YPG培養(yǎng)基的指形瓶中，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)12h。(2)吸取適量菌液接種至含有45mL YPG培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，使瓶內(nèi)培養(yǎng)基OD600 ^ O. 6 O. 8，覆蓋八層無菌紗布，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)12 16h。(3)待菌液生長至OD6tltl ^ 15 20,移至滅菌50mL圓底離心管中，室溫,2500rpm離心3min，收集菌體，加入45mL BMMY培養(yǎng)基，輕輕拍打管底，重懸沉淀的菌體。(4)將重懸的菌液轉(zhuǎn)移至新的滅菌的500mL三角瓶中，覆蓋六層無菌紗布，28°C、250rpm振蕩培養(yǎng)。每12h向培養(yǎng)液中加入甲醇，前24h加入甲醇至終濃度1%，24h以后加入甲醇至終濃度I. 5%。(5)每12h測定菌液OD6。。井取適量培養(yǎng)液，4°C、12000rpm離心lOmin，吸取上清液即為發(fā)酵液。以GXN9K為對照，采用同樣的方法，得到對照發(fā)酵液。
2、重組畢赤酵母發(fā)酵液的纖維ニ糖水解酶活力測定將得到的各個重組畢赤酵母發(fā)酵液和對照發(fā)酵液分別進(jìn)行纖維ニ糖水解酶活力檢測，以PNPC作為底物，按前述方法進(jìn)行酶活力測定；纖維ニ糖水解酶活力定義酶水解pNPC，每min釋放出Ιμπιο p_NP所需的酶量為ー個酶活力單位(U)。結(jié)果是重組畢赤酵母第16號轉(zhuǎn)化子即GXN9K4831-16降解pNPC的酶活力最高，產(chǎn)酶最高的培養(yǎng)時間即最佳收獲時間為60h。在最佳收獲時間其發(fā)酵上清液對底物pNPC酶活カ為O. 035±0. 001U/mL。選取重組畢赤酵母GXN9K4831-16來表達(dá)纖維ニ糖水解酶Tccel7A。對照發(fā)酵液檢測不到酶活力。上述結(jié)果說明，cTccel7A基因表達(dá)的蛋白Tccel7A為纖維ニ糖水解酶。3、纖維ニ糖水解酶Tccel7A的純化將上述I得到的GXN9K4831-16發(fā)酵液使用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，洗滌緩沖液為:洗滌緩沖液 I 50mM NaH2PO4,300mM NaCl、20mM Imidazole、ImMPMSF, ρΗ8· O。洗滌緩沖液II V :除了 Imidazole分別為20、40、60、80、IOOmM以外，其它成分濃度與洗滌緩沖液I 一致。依次用洗滌緩沖液I V對柱子進(jìn)行洗脫，收集洗脫液并進(jìn)行測定。測定為采用SDS-PAGE、自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native_PAGE)和酶譜分析；酶譜分析為將酶液進(jìn)行自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)，將凝膠置于干凈的培養(yǎng)皿中，加入ImL 2. 5mM的pNPC水溶液，用玻棒涂勻，保鮮袋包裹培養(yǎng)皿，37°C放置I至2小時。直接在凝膠上觀察條帶的顏色變化。結(jié)果如圖8所示，A為TcCe17A的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為純化的TcCel7A ；B為TcCel7A的自然聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE)圖，其中泳道I為純化的TcCel7A ；C為和B中泳道I相對應(yīng)的純化的TcCel7A的酶譜分析；從該圖可以看出，經(jīng)過Ni-NTA柱純化后的產(chǎn)物在SDS-PAGE上只顯示出一條大小約為57kDa的主要的蛋白質(zhì)條帶(圖8A泳道I)，在自然PAGE上也只顯示出一條主要的蛋白質(zhì)條帶(圖SB泳道I);自然PAGE上的純化的表達(dá)產(chǎn)物降解pNPC顯示黃色(圖8C泳道I)。證實純化的表達(dá)產(chǎn)物Tccel7A具有纖維ニ糖水解酶的活性，得到純化的纖維ニ糖水解酶Tcce17A。四、純化的纖維ニ糖水解酶Tccel7A的酶學(xué)特性I、最適作用pH值將上述得到的純化的纖維ニ糖水解酶Tccel7A進(jìn)行酶活力檢測，分別采用0. IM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0),0. IM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0)，0· IM Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O), O. IM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8. 5、9. 0、9. 5,10. 0)，反應(yīng)溫度采用37°C，以pNPC作為底物，按前述方法進(jìn)行酶活力測定；纖維二糖水解酶酶活力定義37°C條件下，酶水解pNPC,每min釋放出Ιμπιο p_NP所需的酶量為一個酶活力單位(U)。以最高酶活力為100%，其它pH值的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以pH值為橫坐標(biāo),相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖,見圖9。結(jié)果表明，纖維二糖水解酶Tccel7A酶促反應(yīng)的最適作用PH值為5. O。2.最適作用溫度將純化的纖維二糖水解酶Tccel7A進(jìn)行酶活力檢測，分別采用不同的反應(yīng)溫度(25 °C、30 0C >35 0C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C),反應(yīng)緩沖液采用 ρΗ5· O 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，以PNPC作為底物，按前述方法進(jìn)行酶活力測定；纖維二糖水解酶酶活力定義pH5. O條件下，酶水解pNPC，每min釋放出I μ mo I p-NP所需的酶量為一個酶活 力單位(U)。以最高酶活力作為100%，其它溫度的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見圖10。結(jié)果表明，纖維二糖水解酶Tccel7A酶促反應(yīng)的最適作用溫度為45°C。3. pH 耐受性將純化的纖維二糖水解酶Tccel7A進(jìn)行酶活力檢測，分別采用O. IM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. 0),0. IM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0)，0· IM Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O), O. IM 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 8. 5、9· 0、9· 5,10. 0)，參照 Eckert 和 Schneider所描述的方法(EckertK, Schneider E. 2003. A thermoacidophiIic endoglucanase (CelB)from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequence similarity toarabinofuranosidases belonging to family 51 of glycoside hydrolases. Eur JBiochem, 270:3593-3602)，將酶保存于不同pH值的緩沖液中，于4°C放置24小時后在最適pH值(pH5. 0)和最適溫度(45°C)下測定酶活。以pNPC作為底物，按前述方法進(jìn)行酶活力測定；纖維二糖水解酶活力定義pH5. 0、45°C條件下，酶水解pNPC，每min釋放出I μ mo I p-NP所需的酶量為一個酶活力單位(U)。以最高酶活力為100%，其它pH值保存液的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以保存液的PH值為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見圖11。結(jié)果表明，純化的纖維二糖水解酶Tccel7A在最適pH5. O的條件下,pH耐受性最強,酶活力最高。pH4. 5時酶活力與最適PH5. O條件下接近，pH4. O和5. 5的條件下，能夠保持60%以上的酶活力。4.溫度耐受性將純化的纖維二糖水解酶Tccel7A進(jìn)行酶活力檢測，分別采用不同的保存溫度(20 0C >25 0C >30 0C >35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >55 °C >60 °C >65 °C >70 °C),參照 Inoue 等所描述的方法(Inoue T, Moriya S，Ohkuma M, et al. 2005. Molecular cloning andcharacterization of a cellulase gene from a symbiotic protist of the lowertermite, Coptotermes formosanus. Gene, 349:67-75),將酶保存于不同溫度下，放置 I 小時后在最適pH值(pH5. O)和最適溫度(45°C )下測定酶活力。以pNPC作為底物，按前述方法進(jìn)行酶活力測定；纖維二糖水解酶活力定義pH5. 0、45°C條件下,酶水解pNPC，每min釋放出Ιμπιο p-NP所需的酶量為一個酶活力單位(U)。以最高酶活力為100%，其它保存溫度的酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力，以保存溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活力為縱坐標(biāo)作圖，見圖12。結(jié)果表明，純化的纖維二糖水解酶Tccel7A在45°C及以下的溫度條件下，酶活穩(wěn)定性較好，能夠保持90%以上的酶活。5、TcCel7A的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km、Vmax的測定在該酶的最適作用條件(pH5.0、45°C)下，以pNPC作為底物，在不同底物濃度(O. flmM)、相同酶蛋白質(zhì)濃度(O. 061μ8/μ I)條件下測定TcCel7A酶活力，圖13A為pNPC的濃度對反應(yīng)速度的影響曲線，看出底物PNPC濃度越大，酶反應(yīng)速度越快，在底物pNPC濃度為O. 2 O. 8mM范圍內(nèi)，底物pNPC濃度和酶反應(yīng)速度基本呈線性關(guān)系。繪制了底物濃 度和反應(yīng)速度的雙倒數(shù)圖，見圖13B。根據(jù)雙倒數(shù)圖得出TcCel7A的Km為2. 43mM, Vmax為I. 32 μ mo I pNP/min.mg。6、TcCel7A的底物特異性檢測在該酶的最適作用條件(pH5.0、45°C)下，測定了 TcCel7A對不同底物的酶活力，酶活力定義為在 ρΗ5· 0、45<€條件下，酶水解 pNPC 或 pNPG(p-Nitrophenyl_ β -D-glucopyranoside),每min釋放出I μ mol p_NP所需的酶量為一個酶活力單位(U)?；蛘?在pH5.0、45°C條件下，酶水解其它纖維素類底物，每min釋放出I μ mol還原糖(相當(dāng)于等量的葡萄糖或木糖)所需的酶量為一個酶活力單位(U)。結(jié)果見表2，TcCel7A對包括結(jié)晶纖維素Avicel的各種底物(木聚糖除外)普遍有酶活力。對人工合成底物PNPC的酶活力最高，酶活力為O. 72±O. 04U/mg ;對結(jié)晶纖維素Avicel有相當(dāng)高的酶活力；對濾紙有較高的酶活力。表2為纖維二糖水解酶TcCel7A的底物特異性檢測分析

底物特異性酶活力相對酶活力(％)
_(U/mg)_
IOmMpNPC0.72±0.02100.0±0.00
IO mM pNPG0.09士0.0212·14±1·42
1% 結(jié)晶纖維素 Avicel 0.16±0.03 22.76±2.891% 酸膨脹纖維素 0.32±0.05 48.30 + 2.471%羧甲基纖維素(低度粘度) 0·34±0·01 47.62 + 2.291%羧甲基纖維素(中度粘度) 0.42±0.02 58.21 ±3.561% 羥乙基纖維素 0.39±0.01 54.08+1.171%樺木木聚糖未檢出未檢出 % 濾紙(Whatman I )_0.48±0.02_68.00±4 167、TcCel7A水解濾紙的產(chǎn)物鑒定與分析
準(zhǔn)備5個無菌EP管，分別加入400 μ L O. IM檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ρΗ5. O)、4 μ g濾紙和100 μ L上述純化制備的TcCel7A，置于45 °C搖床，150rpm振蕩，分別反應(yīng)10min、30min、Ih和2h,沸水煮5min滅活纖維二糖水解酶TcCel7A,冷卻；12，OOOrpm離心5min,取上清液，HPLC檢測上清液中的糖組分，色譜儀器為島津CBM-10A系統(tǒng)，檢測器型號為RID-10A，色譜柱為Benson公司制造，型號為BP_800Pb，柱溫保持在80°C，流動相為水，流速為O. 8mL/min。標(biāo)樣為葡萄糖(glucose, Gl)、纖維二糖(cellobiose, G2)、纖維三糖(cellotriose, G3)、纖維四糖(cellotetraose，G4)。結(jié)果見圖14所示，A.標(biāo)準(zhǔn)物葡萄糖(Gl)、纖維二糖(G2)、纖維三糖(G3)、纖維四糖(G4)的HPLC分析圖譜；B-E :纖維二糖水解酶TcCel7A水解濾紙不同時間后的產(chǎn)物的HPLC分析圖譜，B、水解10分鐘，C、水解30分鐘，D、水解I小時，E、水解2小時；由圖中可以看出，最初反應(yīng)的lOmin，水解產(chǎn)物量非常少；反應(yīng)30min，可以明顯的看出水解產(chǎn)物為纖維二糖和纖維三糖；反應(yīng)lh，水解產(chǎn)物為纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，分別占總水解產(chǎn)物量的68. 5%,24. 3%和7. 2% ;反應(yīng)2h，水解產(chǎn)物同樣為纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，分 別占總水解產(chǎn)物量的77. 3%、21· 5%和I. 2%。隨著反應(yīng)時間的延長，水解產(chǎn)物量不斷增加。其中，以纖維二糖產(chǎn)量提高幅度最大，纖維二糖為主要水解產(chǎn)物，纖維三糖和纖維四糖是水解反應(yīng)的副產(chǎn)物，這與纖維二糖水解酶I主要降解纖維素產(chǎn)生纖維二糖是相符的。水解產(chǎn)物中包含纖維二糖、纖維三塘和纖維四糖，可能是纖維二糖水解酶I反復(fù)作用底物濾紙的結(jié)果如經(jīng)過該酶反復(fù)作用某一多糖鏈產(chǎn)生纖維六糖，再次作用又產(chǎn)生纖維二糖和纖維四糖；同理，該酶反復(fù)作用某一多糖鏈產(chǎn)生纖維五糖，再次作用產(chǎn)生纖維二糖和纖維三糖。證實TcCe17A確實具有纖維二糖水解酶I水解纖維素產(chǎn)生纖維二糖的能力。8、金屬離子對TcCe17A酶活力的影響在最適作用條件(pH5. 0、45°C)下,在酶反應(yīng)體系中加入ImM的金屬離子,測定以PNPC為底物的TcCel7A酶活力。酶活力定義pH5. 0、45°C條件下，酶水解pNPC，每min釋放出Ιμπιο p-NP所需的酶量為一個酶活力單位(U)。以不加任何金屬離子的酶反應(yīng)體系為對照，比酶活為0. 62±0. 02U/mg，設(shè)定該酶活力為100%，計算其它加入金屬離子的酶反應(yīng)體系的相對酶活力，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，終濃度為ImM的Ca2+對該酶的酶活有顯著的促進(jìn)作用。表3為金屬離子對TcCel7A酶活力的影響
權(quán)利要求
1.ー種蛋白，是如下(a)或(b)或(c)的蛋白質(zhì) (a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)由序列表中序列3自N末端第18-509位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (c)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維ニ糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因為如下I)-5)中任一所示的基因 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)序列表中序列2自5‘末端第52-1527位核苷酸所不的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼具有纖維ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子； 5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有纖維ニ糖水解酶活性蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在干 所述重組表達(dá)載體為編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因插入表達(dá)載體，得到表達(dá)所述蛋白的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在干 所述重組菌為將權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌中，得到的重組菌；所述宿主菌具體為巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris);所述巴氏畢赤酵母進(jìn)ー步具體為巴氏畢赤酵母GSl 15。
7.權(quán)利要求I所述蛋白在作為纖維ニ糖水解酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備纖維ニ糖水解酶中的應(yīng)用。
9.一種制備纖維ニ糖水解酶的方法，為發(fā)酵權(quán)利要求4或6所述的重組菌，即得到纖維ニ糖水解酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種纖維二糖水解酶Tccel7A及其編碼基因及應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有纖維二糖水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明從木霉(Trichoderma sp.)菌株BM48-3中克隆得到了一個新的纖維二糖水解酶基因Tccel7A/cTccel7A，可在宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因以生產(chǎn)纖維二糖水解酶，用于纖維素的降解。
文檔編號C12N1/19GK102816752SQ20121030675
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者馮家勛, 周青鳥, 秦秀林, 劉君梁, 張政 申請人:廣西大學(xué)