一種高效水解大豆異黃酮糖苷的β-葡萄糖苷酶基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型β-葡萄糖苷酶，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。它的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本發(fā)明還公開了含上述新型β-葡萄糖苷酶的表達(dá)載體，及重組β-葡萄糖苷酶及其在高效水解大豆異黃酮糖苷中的應(yīng)用。該新型重組β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌表達(dá)體系中具有高效的可溶性表達(dá)，該酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為45℃和pH6.0，具有良好的熱穩(wěn)定性和較寬的pH酶解范圍。同時(shí)該酶對(duì)大豆苷、染料木苷具有高效的水解作用，水解效率為100%。
【專利說(shuō)明】—種高效水解大豆異黃酮糖苷的葡萄糖苷酶基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種3 -葡萄糖苷酶新基因，尤其涉及一種高效水解大豆異黃酮糖苷的@ -葡萄糖苷酶基因及其重組酶和重組酶的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]P -葡萄糖苷酶(P -glucosidase)屬于糖苷水解酶家族,又稱P -D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(3-D-glucoside glucohydrolase ；EC3.2.1.21), 一方面,該酶可以催化水解
糖苷鍵，釋放出葡萄糖和相應(yīng)的糖苷配基。另一方面，該酶還能催化轉(zhuǎn)糖苷縮合反應(yīng)，合成低聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，游離型的大豆異黃酮糖苷才能發(fā)揮其生物活性，3 -葡萄糖苷酶在催化水解結(jié)合型糖苷產(chǎn)生游離型糖苷方面具有重要作用，顯著提高異黃酮糖苷的水解效率，從而為工業(yè)上大批量生產(chǎn)高活性大豆異黃酮苷元產(chǎn)品提供捷徑。在纖維素降解過(guò)程中，葡萄糖苷酶可以與其他幾種纖維素降解酶協(xié)同作用，將纖維素降解為葡萄糖，后者經(jīng)微生物發(fā)酵作用即可產(chǎn)生燃料乙醇等能源物質(zhì)。在食品行業(yè)中，該酶能夠利用3 -葡萄糖苷酶水解風(fēng)味前體物質(zhì)3 -糖苷以釋放出風(fēng)味活性物質(zhì)糖苷配基，從而增強(qiáng)葡萄酒、果汁和茶葉等產(chǎn)品的香氣。另外，在醫(yī)藥領(lǐng)域中，可通過(guò)檢測(cè)人體血清中(6-葡萄糖苷酶活性的高低來(lái)判斷是否患有乳腺癌。因此，3 -葡萄糖苷酶在生產(chǎn)有活性大豆異黃酮苷元、能源、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。
[0003]大豆異黃酮主要有12種化學(xué)成分，大豆苷元、染料木素和黃豆黃素3種游離型異黃酮苷元以及它們和丙二酰基葡糖糖、乙?；咸烟?、葡萄糖以3 -葡萄糖苷鍵的方式結(jié)合成的9種異黃酮糖苷組成。大豆異黃酮具有抗腫瘤、擴(kuò)張血管和抗氧化等作用，同時(shí)還可預(yù)防骨質(zhì)疏松癥和婦女更年期綜合癥等疾病，因此，受到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。研究表明，大豆苷元、染料木素和黃豆黃素3種游離型異黃酮苷元是大豆異黃酮發(fā)揮生物活性功能的主體，而占大豆異黃酮總量80%~99%的9種結(jié)合型糖苷則無(wú)生物活性。這些異黃酮糖苷只有被水解為游離型的苷元后才能被小腸壁吸收，發(fā)揮其生物活性作用，但大豆自身含有的內(nèi)源性P -葡萄糖苷酶的酶活性很低，只能水解22%~29%的異黃酮糖苷，因此，在豆制品中添加高活性的3-葡萄糖苷酶以提高異黃酮糖苷水解效率在食品工業(yè)中具有重要意義。
[0004]目前，已經(jīng)從不同微生物中分離出來(lái)多種(6-葡萄糖苷酶，主要包括里氏木霉(Trichoderma Reesei)、黑曲霉(Aspergillus niger)、斜臣卜青霉(Penincilliumdecumbens)、土曲霉(Aspergillus terreu)、多粘性芽抱桿菌(Bacillus polymyxa)、鏈霉菌(Streptomyces)和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)等。鑒于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)技術(shù)分離出的3-葡萄糖苷酶在酶的活性、穩(wěn)定性、底物特異性等方面存在各式各樣的差異，以及環(huán)境中99%的微生物是不可培養(yǎng)的，所以，為了適應(yīng)不斷發(fā)展的、不同領(lǐng)域的工業(yè)應(yīng)用，迫切需要從自然界中挖掘和鑒定具有新特性的(6-葡萄糖苷酶。
[0005]宏基因組學(xué)(Metagenomics)是一種不依賴于微生物的分離培養(yǎng),直接以特定生態(tài)環(huán)境中微生物群體基因組總和作為研究對(duì)象，同時(shí)利用序列分析和功能篩選作為研究手段，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)從而篩選出新的基因及生理活性物質(zhì)。宏基因組技術(shù)作為一種新興學(xué)科領(lǐng)域，在很大程度上促進(jìn)了環(huán)境微生物資源的利用，特別是未培養(yǎng)微生物資源的開發(fā)利用。因此該方法為發(fā)現(xiàn)更多的新型(6-葡萄糖苷酶提供了有效途徑。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用宏基因組技術(shù)從海底泥中獲得具有高效水解大豆異黃酮糖苷性質(zhì)的新型葡萄糖苷酶的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種(6-葡萄糖苷酶的新基因。
[0007]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述(6-葡萄糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法。
[0008]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述新型(6-葡萄糖苷酶的DNA表達(dá)載體。
[0009]本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞而獲得的基因工程菌。
[0010]本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供利用上述表達(dá)載體構(gòu)建的重組(6-葡萄糖苷酶及其制備方法。
[0011]本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供利用上述重組(6-葡萄糖苷酶在高效水解大豆異黃酮糖苷中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種新型(6-葡萄糖苷酶的DNA，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]本發(fā)明提供的上述新型P -葡萄糖苷酶，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0014]本發(fā)明的第二個(gè)目的是通`過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種新型(6-葡萄糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法，提取海底泥的總DNA并純化，將純化后的總DNA經(jīng)Hind III酶切，連接到克隆載體PUC118上，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)涂布含七葉苷和檸檬酸鐵銨的LB平板顯色法快速篩選得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。
[0015]本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種含有上述新型(6-葡萄糖苷酶的DNA的表達(dá)載體。
[0016]本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種基因工程菌，通過(guò)如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞而得。優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
[0017]本發(fā)明的第五個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種重組(6-葡萄糖苷酶的制備方法，包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組
葡萄糖苷酶。
[0018]上述重組(6-葡萄糖苷酶的制備方法中，寄主細(xì)胞是大腸桿菌。
[0019]上述重組(6-葡萄糖苷酶的制備方法，其具體過(guò)程為:包括用上述表達(dá)載體的目的片段經(jīng)Bam H1.Hind III雙酶切，與pET_28a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。
[0020]所述的IPTG終濃度為0.1-1.3mM,誘導(dǎo)溫度為18_37°C。
[0021]本發(fā)明提供的重組(6-葡萄糖苷酶，包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組3 -葡萄糖苷酶的方法和步驟。[0022]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明所述重組(6-葡萄糖苷酶在高效水解異黃酮糖苷中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果是:
[0024]①.本發(fā)明從海底泥樣品構(gòu)建好的宏基因組文庫(kù)中得到一個(gè)新的P -葡萄糖苷酶的DNA序列，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)其功能研究，發(fā)現(xiàn)該序列在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳,得到一條單一的蛋白條帶,減去融合蛋白的大小,初步確定該^ -葡萄糖苷酶的分子量約為52kDa。
[0025]②.本發(fā)明將SEQ ID N0.1所示的DNA序列克隆到原核表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆子的誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白，研究其酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果如下:
[0026](I)在大腸桿菌表達(dá)體系中，該重組蛋白具有高效可溶性表達(dá)；
[0027](2)以對(duì)硝基苯-0 -D-吡喃葡萄糖苷(P NPG)為底物，測(cè)得該重組P -葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為45°C，該酶在溫度低于60°C時(shí)非常穩(wěn)定，60°C保溫Ih后，相對(duì)酶活保持在80%以上，70°C保溫IOmin后仍有50%以上的相對(duì)酶活。表明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性；該酶的最適反應(yīng)PH為6.0，在pH5.5-8.5的范圍內(nèi)，能夠保持80%以上的相對(duì)酶活，說(shuō)明其具有較寬的PH酶解范圍；測(cè)定金屬離子和生化試劑對(duì)酶活力影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，ImM Al3+與IOmM Triton X-100對(duì)重組P -葡萄糖苷酶的酶活有明顯的促進(jìn)作用；相反的，當(dāng)反應(yīng)體系中含有ImM Cu2+UOmM Tween-80時(shí)，該酶酶活受到強(qiáng)烈的抑制；當(dāng)含稀釋酶液的反應(yīng)體系中分別含有 IOmM EDTAUmM FeCl3、lmM CaCl2UmM MgSO4UmM Al2 (SO4) 3、ImM MnCl2UmMZnSO4時(shí)，該P(yáng) -葡萄糖苷酶的活性沒(méi)有顯著改變。
[0028]③.本發(fā)明在研究重組(6-葡萄糖苷酶Bgll-1l水解大豆異黃酮糖苷反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在分別含有0.5mg / mL大豆苷和染料木苷的反應(yīng)體系中進(jìn)行水解反應(yīng)lh，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析，結(jié)果表明其水解速率為100%。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1為實(shí)施例1中重組P -葡萄糖苷酶的SDS-PAGE電泳圖；
[0030]其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量maker, Linel為重組蛋白全細(xì)胞粗提物，Line2為重組蛋白上清粗提物，Line3為純化的重組蛋白；
[0031]圖2為實(shí)施例3中重組蛋白水解底物P NPG的最適溫度結(jié)果折線圖；
[0032]圖3為實(shí)施例3中重組蛋白水解底物P NPG的熱穩(wěn)定性結(jié)果折線圖，其中不同符號(hào)代表不同溫度，5(TC (_)，55°C ( ? ),60°C ( A ) ,65°C(^) and70°C (?);
[0033]圖4為實(shí)施例3中重組蛋白水解底物P NPG的最適pH結(jié)果折線圖；
[0034]圖5為實(shí)施例3中重組蛋白水解底物P NPG的pH穩(wěn)定性結(jié)果折線圖；
[0035]圖6為重組蛋白水解大豆苷(daidzin)和染料木苷(genistin)的高效液相色譜(HPLC)分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0037]實(shí)施例1宏基因組文庫(kù)的建立和陽(yáng)性克隆子的獲得、基因克隆與表達(dá)
[0038]1、總DNA的提取:[0039]稱取5g 樣品，加入 13.5mL DNA 提取緩沖液(0.1M Tris,0.1M EDTA-Na,0.1MNa3PO4,1.5M NaCl, I % CTAB, pH 值 8.0)，劇烈震蕩 3_5min，加入 200 y L 溶菌酶(IOOmg /ml)，反復(fù)顛倒5-6次，37°C水浴30min，加入1.5mL20% SDS，65°C水浴Ih (期間每隔15min上下顛倒幾次)，8000r / min離心5min,取上清液,用等體積氯仿抽提2次，16000r / min離心IOmin,取上清,加入0.6倍體積的異丙醇，室溫放置2h, 20000r / min離心20min,棄上清，沉淀加5mL預(yù)冷的70%乙醇,20000r / min離心IOmin,收集DNA沉淀,風(fēng)干,用適量TE緩沖液溶解。
[0040]2、試劑盒法純化DNA:按照OMEGA膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
[0041]3、宏基因組電泳檢測(cè):用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的純度和質(zhì)量。
[0042]4、酶切總DNA:用限制性內(nèi)切酶Hind III部分酶切總DNA，回收2_10kb的酶切片段，方法同試劑盒法純化DNA。
[0043]5、酶切片段的電泳檢測(cè):方法同宏基因組電泳檢測(cè)。
[0044]6、酶切片段的連接:將回收得到的酶切片段和pUC118 / Bam HI (BAP)載體連接過(guò)夜，向連接產(chǎn)物中加入0.6倍體積的異丙醇，室溫沉淀1.5h，14000r / min離心20min，棄上清并向沉淀中加入70%無(wú)水乙醇洗滌2次，風(fēng)干并加入適量dd H2O重溶。
[0045]7、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:
[0046]吸取5iiL的連接產(chǎn)物加入IOOiiL的大腸桿菌DH5a高效感受態(tài)中，2500V/cm(Eppdorf2510 電擊儀)電擊 I 次，46°C熱激 6min，37°C，180rpm 搖床培養(yǎng) 45_60min，吸取30-40 u L涂布于含有氨芐青霉素(100 u g / mL)、七葉苷(I U g / mL)、檸檬酸鐵銨(2 y g /mL)和IPTG(ImM)的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。由此構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量達(dá)40000個(gè)轉(zhuǎn)化
子，多樣性好的宏基因組文庫(kù)。
[0047]8、文庫(kù)篩選和陽(yáng)性克隆子的鑒定:將涂布后的平板至于37°C培養(yǎng)24_48h，由于^ -葡萄糖苷酶可以將七葉苷水解生產(chǎn)七葉亭，其與鐵離子反應(yīng)生成黑褐色沉淀，因而顯黑色的菌落即為陽(yáng)性克隆子。通過(guò)篩選得到一株陽(yáng)性克隆子。
[0048]從平板將陽(yáng)性克隆子挑出并接種至IOmL含氨芐青霉素(100 U g / mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220r / min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，取2mL菌體進(jìn)行質(zhì)粒提取，對(duì)插入片段測(cè)序，將測(cè)定的序列經(jīng)過(guò)NCBI的BLASTn軟件分析比較，發(fā)現(xiàn)該DNA由1245個(gè)堿基組成，將其命名為Bgl 1-11，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該DNA編碼的多肽，含414個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。其中SEQ ID N0.2為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.3的對(duì)照?qǐng)D。
[0049]9、基因片段的克隆:根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)引物；F1和F2，引物兩端插入能插入pET-28a(+)載體的Bam HI和HindIII酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
[0050]Fl 5' -TTATGGATCCATGACGGAGACGCGGGTGCCTG
[0051]F25' -TCA GAAGCTTGGTCGAGAGCGGGAGCGACGC
[0052]利用兩條引物，以質(zhì)粒pUC118-Bgll_ll為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系如表1所示:
[0053]表1.PCT 體系
【權(quán)利要求】
1.一種(6-葡萄糖苷酶DNA，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種新型(6-葡萄糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.一種包含權(quán)利I所述的P -葡萄糖苷酶DNA的表達(dá)載體。
4.一種基因工程菌，其特征在于通過(guò)如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞而得。
5.一種重組3 -葡萄糖苷酶的制備方法，其特征是:用權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得重組3 -葡萄糖苷酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組(6-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于:將如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的目的片段經(jīng)及? m、Hind III雙酶切，與pET-28a (+)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，得到高效可溶性表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組P-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征是IPTG終濃度為0.1-1.3 mM，誘導(dǎo)溫度為 18-37°C。
8.如權(quán)利要求1所述的新型(6-葡萄糖苷酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征是:提取環(huán)境中的總DNA并純化，將純化后的總DNA kAHind III酶切，連接pUC118載體，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a高效感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)涂布含七葉苷和檸檬酸鐵銨的LB平板顯色法得到陽(yáng)性克隆子，經(jīng)測(cè)序和BLAST比較并設(shè)計(jì)引物，從而克隆到目的片段。
9.權(quán)利要求2所述的重組(6-葡萄糖苷酶在水解大豆異黃酮糖苷中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的`應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用條件為pH5.5-8.5。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK103789331SQ201310149771
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】劉玉煥, 童鈴, 曹立創(chuàng), 李良, 郭耿珊, 汪思迪 申請(qǐng)人:中山大學(xué)