專利名稱：：以金納米團(tuán)簇來減緩氧化壓力和/或老化的方法、組合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本揭示內(nèi)容是有關(guān)于一種金納米團(tuán)簇的用途；尤其是有關(guān)以紅光金納米團(tuán)簇來減緩氧化壓力和/或老化的新穎用途。
背景技術(shù)：
：依據(jù)先前研究成果顯示，老化過程與各相關(guān)疾病所引起的退化過程，部分是肇因于自由基氧化壓力和/或硫基/二硫酸鹽(thio/disulfate)氧化還原反應(yīng)的氧化轉(zhuǎn)移(BeckeamenandAmes,Physiol.Rev.199878:547-581)。也有人推論認(rèn)為氧化壓力是肇因于相關(guān)的血管疾病或血管因子。因此，此
技術(shù)領(lǐng)域：
亟需找出一種可減緩氧化壓力，對抗老化和各種血管疾病癥狀的制劑。因此，可減緩氧化壓力甚至老化過程的制劑，將來有潛力被發(fā)展成為可用來治療血管疾病的藥劑或藥學(xué)組合物。
發(fā)明內(nèi)容以下為本
發(fā)明內(nèi)容的簡要說明，目的是使通常知識者能對本揭示內(nèi)容有一些基本認(rèn)識。此
發(fā)明內(nèi)容非本揭示內(nèi)容的概要，且未界定本揭示內(nèi)容的主要/關(guān)鍵組件或勾劃出本發(fā)明的范疇。本
發(fā)明內(nèi)容的目的為簡要地呈現(xiàn)本揭示內(nèi)容的概念，更進(jìn)一步的詳細(xì)內(nèi)容將記載于實(shí)施方式內(nèi)。本發(fā)明是基于意外發(fā)現(xiàn)紅光金納米團(tuán)簇可以有效地減緩一培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化，因此可作為一制劑，以便有效地抵抗或抑制細(xì)胞老化，且可進(jìn)一步發(fā)展成為一種可治療由血管因子(如，發(fā)炎或血管疾病)誘發(fā)的氧化壓力和/或老化的藥劑。本揭示內(nèi)容為一種可減緩培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化的方法。此方法包括讓一有效量的金納米團(tuán)簇與該培養(yǎng)細(xì)胞接觸，其中金納米團(tuán)簇粒徑約為O.I至20納米。在一實(shí)例中，上述金納米團(tuán)簇為二氫硫辛酸(dihydrolipoicacid,DHLA)涂覆的金納米團(tuán)簇。該培養(yǎng)細(xì)胞是選自于人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanaroticendothelialcell,HAEC)、人類表皮細(xì)胞、人類內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞(humanendothelialprogenitorcell,HEPC)、人類胚胎干細(xì)胞(humanembryonicstemcell)和人類間葉干細(xì)胞(humanmesenchymalstemcell)所組成的群組中。與培養(yǎng)細(xì)胞接觸的金納米團(tuán)簇的總量約為1-1，OOOnM。另外，本揭示內(nèi)容為前述金納米團(tuán)簇的用途，用來制造出一種能減緩培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化的試劑。再者，本揭示內(nèi)容為一種用來治療一個體的氧化壓力和/或老化癥狀的藥學(xué)組合物。此藥學(xué)組合物包含一有效量的前述金納米團(tuán)簇和一藥學(xué)上可接受的賦形劑。其中該個體為人或動物，較佳是哺乳類。另一方面，一種以金納米團(tuán)簇來治療一個體的氧化壓力和/或老化癥狀的方法也屬于本發(fā)明范疇。本方法包括對該個體施用前述的藥學(xué)組合物來減緩該個體的氧化壓力和/或老化。該氧化壓力和/或老化是由一血管因子所造成，例如由發(fā)炎或血管疾病所造成。所述的血管疾病可以是動脈粥狀硬化、冠狀動脈疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,Ml)、缺血(ischemia)、中風(fēng)、夕卜圍動脈阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性動脈阻塞(pulmonaryvasculardisease)。前述的個體可為人類或動物，最好是哺乳類。本揭示內(nèi)容的實(shí)施例將詳細(xì)闡述于實(shí)施方式及申請專利范圍內(nèi)。參照實(shí)施方式及申請專利范圍能更進(jìn)一步充分了解本揭示內(nèi)容的特征，目的，和發(fā)明優(yōu)點(diǎn)。圖I為金納米團(tuán)簇之化學(xué)結(jié)構(gòu)組成的示意圖；且圖2為人類動脈細(xì)胞有或無以實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇處理，并于處理后第1、7、21或28天，分別以相位差顯微鏡或熒光顯微鏡拍攝的照片。具體實(shí)施例方式本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，在不超出本發(fā)明范疇下，可針對本發(fā)明做許多的改變或改良，因此這類等效物應(yīng)視為仍屬本發(fā)明范疇內(nèi)。本文中實(shí)施例僅是作為闡述本發(fā)明之用，本發(fā)明范疇不限于此。本揭示內(nèi)容記載的特定專有名詞如以下所述。于本說明書所使用記載的技術(shù)和科學(xué)專有名詞，其含義與目前一般本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解相同，除非另有規(guī)定。本揭示內(nèi)容所使用的單數(shù)形式的“一(a,an)”「」和“該(the，said)”包含復(fù)數(shù)參照物，除非文義另有規(guī)定。本揭示內(nèi)容中所記載的名詞“約”，一般為或0.5%的特定值或范圍。另外，名詞“約”，是指本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)可的一平均值的可接受的標(biāo)準(zhǔn)誤差。本揭示內(nèi)容中所記載的名詞“藥學(xué)上可接受(pharmaceuticallyacceptable)”組分，為一種與危害比率(Benefit/riskratio)相襯的適合人類和/或動物使用且無不良副作用(如毒性，刺激性和/或過敏性反應(yīng))的成分。本揭示內(nèi)容中所記載的名詞“有效量(aneffectiveamount)”,是指足以產(chǎn)生一預(yù)期反應(yīng)的金納米團(tuán)簇的用量。對體外試驗應(yīng)用而言，可減緩所培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化的該有效量會隨著不同因子而有所改變，例如與金納米團(tuán)簇接觸的細(xì)胞類型或是細(xì)胞經(jīng)過繼代培養(yǎng)的次數(shù)。該有效量的表示方式，可以是所施加金納米團(tuán)簇的總濃度(nM)、金納米團(tuán)簇的總質(zhì)量(例如，克、毫克或微克)、金納米團(tuán)簇的總質(zhì)量與培養(yǎng)基總體積的比例(例如，毫克/毫升)。較佳是，所施加的金納米團(tuán)簇的濃度在約I至1，OOOnM間；較佳是在約10至3，OOnM間；更佳是在約30至IOOnM間。對活體內(nèi)試驗的應(yīng)用而言，例如，減緩一個體的氧化壓力和/或老化癥狀的體內(nèi)應(yīng)用，該有效量也會隨著不同因子而改變，例如特定的治療條件，實(shí)驗對象的生理條件(例如，體重、年齡或性別)，哺乳類或動物的類型，治療期間，同時施用的其它治療(如果有的話)種類，和所使用的特定配方。該有效量的表示方式，可以是該金納米團(tuán)簇的總質(zhì)量(如克、毫克或微克)，或是該金納米團(tuán)簇之總質(zhì)量與該個體體重間的比例(例如，毫克/公斤)。本揭示內(nèi)容中所記載的名詞“賦形劑(excipient)”，是指可以成為金納米團(tuán)簇之媒介/載體的任何惰性物質(zhì)(例如粉狀或液狀)。此該賦形劑一般而言是安全、無毒的，并且廣義而言，可涵蓋任何于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)上應(yīng)用于藥學(xué)組合物制備之已知物質(zhì)，例如，充填劑(fillers)、稀釋劑(diluents)、凝結(jié)劑(agglutinants)、接著劑(binders)、潤滑劑(lubricatingagents)、助流劑(glidants)、穩(wěn)定劑(stabilizer)、著色劑(colorants)、潤濕劑(wettingagents)、分解劑(disintegrants)等。本揭示內(nèi)容中所記載之名詞“血管因子(vascularfactor)”或“血管疾病(vasculardisease)”,是指任何會對血管系統(tǒng)(包括心臟和血管)產(chǎn)生影響的因此或疾病。在本揭示內(nèi)容中，血管因子或疾病包括任何會使血管功能失控的因子或疾病，例如發(fā)炎、血管狹窄或血管阻塞。血管疾病的實(shí)例包括，但不限于，動脈粥狀硬化、冠狀動脈疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,MI)、缺血(ischemia)、中風(fēng)、外圍動脈阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性動脈阻塞(pulmonaryvasculardisease)。本揭示內(nèi)容之實(shí)施方式是關(guān)于以金納米團(tuán)簇來制備藥學(xué)組合物或藥劑以減緩培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化，或一個體的由血管因子或疾病所引起的氧化壓力和/或老化之癥狀。本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇為紅光金納米團(tuán)簇；特別是，以二氫硫辛酸涂覆之金納米團(tuán)簇。本發(fā)明所用的涂覆有二氫硫辛酸的金納米團(tuán)簇乃是此項
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的，其制備過程(Linetal.,2009ACSNano3:395-401)也是此項
技術(shù)領(lǐng)域：
所熟知的，因此，不需進(jìn)一步解釋其制備過程。涂覆有二氫硫辛酸的金納米團(tuán)簇，在激發(fā)波長約為420納米的條件下，可發(fā)射出650納米的偏振光，因此其發(fā)射波長范圍為紅色光至近紅外線范圍。每個金納米團(tuán)簇粒徑約為0.I至20納米間，較佳范圍為約I至15納米間，更佳范圍為約2至13納米。以上所揭露的金納米團(tuán)簇的粒徑為干燥狀態(tài)下的金納米團(tuán)簇，然而，如果用于本揭露內(nèi)容的金納米團(tuán)簇是水溶性的或至少可分散于液體培養(yǎng)基和/或水中，將會更好；由于與周邊溶劑分子(例如，水)稱合，因此金納米團(tuán)簇的流體動力學(xué)粒徑(hydrodynamicsize)明顯大于其干燥尺寸。于一實(shí)施例中，金納米團(tuán)簇的流體動力學(xué)粒徑(hydrodynamicsize)約相當(dāng)于0.I至30千耳頓(kDa)的聚乙二醇。根據(jù)一實(shí)施例，當(dāng)本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇與培養(yǎng)細(xì)胞接觸時，具有抗氧化和/或老化活性。在此實(shí)施例中，于培養(yǎng)基中加入約I至1，OOOnM金納米團(tuán)簇與培養(yǎng)細(xì)胞一起培育一段時間，例如I至10小時，較佳為約3至7小時，更佳為約4至6小時，并且于反應(yīng)過程中需置換新鮮培養(yǎng)基。經(jīng)金納米團(tuán)簇處理后的培養(yǎng)細(xì)胞，至少能維持細(xì)胞形態(tài)7天，較佳為14天，更佳為21天，特佳為28天。適合以本發(fā)明納米金團(tuán)處理的細(xì)胞，包含但不限于人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、人類表皮細(xì)胞、人類內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞、和人類間葉干細(xì)胞。另一方面，本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇可用來制備一藥學(xué)組合物或一藥劑，藉以治療一個體的氧化壓力和/或老化癥狀。本揭示內(nèi)容的該藥學(xué)組合物或該藥劑具有一有效量的金納米團(tuán)簇；和一藥學(xué)上可接受的賦形劑。適合的接受該藥學(xué)組合物或該藥劑的個體乃是具有血管疾病所引起的氧化壓力和/或老化，例如，由動脈粥狀硬化、冠狀動脈疾病(coronaryarterydisease,CAD)、心肌梗塞(myocardialinfraction,MI)、缺血(ischemia)、中風(fēng)、外圍動脈阻塞(peripheralvasculardisease)、或肺源性動脈阻塞(pulmonaryvasculardisease)所引起的氧化壓力和/或老化。該個體為人類或哺乳類，例如猴子和黑猩猩。該藥物組合物或該藥劑的投藥方式可為系統(tǒng)性或局部性?？墒褂萌魏我话愠Ｒ姷耐端幏绞絹硎┯帽景杆衣兜慕鸺{米團(tuán)簇?？梢韵铝蟹绞絹硗端帲?，口服、舌面、舌下含服、頰內(nèi)、直腸或不經(jīng)腸道方式(即，繞過腸道，如靜脈注射(intravenously)、動脈注射(intraarterially)、心臟注身寸(intracardially)、表皮注身寸(intracutaneously)、皮下注射(subcutaneously)、皮膚貼片(transdermally)、腹腔(intraperitoneally)或肌肉注射(intramuscularly)),其中口服或靜脈投藥較適宜。對于本揭示內(nèi)容的應(yīng)用來說，本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇可制造成一般配方，例如，錠劑、糖衣錠、丸劑、顆粒劑、氣霧劑、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液、軟膏、霜劑或凝膠或任何形式，特別是使用惰性、基本上無毒并且為藥學(xué)上可接受的載體或溶劑來制造。為此，本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇在任一情況下的治療有效量，即足以達(dá)到指定或所需劑量范圍之量，相對于總混合物的重量而言，為約O.001至約99%(百分比濃度)之間，較佳為約0.01至約95%(百分比濃度)。盡管，根據(jù)不同的體重和/或投藥途徑的類型，藥劑的個體反應(yīng)，配方的類型和/或投藥的時間或間隔，適當(dāng)?shù)仄x上述劑量范圍是必要的。因此，于某些情況下，可投予較上述劑量范圍小的藥量或是在其它情況下，則是需要超過上述上限值的藥量。于給予高劑量情況下，建議將高劑量分成數(shù)個單劑量于一規(guī)定內(nèi)間內(nèi)投藥，例如，一天內(nèi)?？捎谶m當(dāng)條件下，以溶劑和/或載體(適當(dāng)情況下，也可使用乳化劑和/或分散齊IJ)來稀釋本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇，以將其制成配方。例如，在以水作為稀釋劑的情況下，若情況準(zhǔn)許，也可使用有機(jī)溶劑作為輔助性溶劑。根據(jù)不同投藥途徑，為達(dá)到預(yù)期的效果，本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇之劑量范圍約0.001至約500毫克/公斤體重，較佳為約0.001至約100毫克/公斤體重，更佳為約0.01至約50毫克/公斤體重。盡管，根據(jù)不同的體重和/或投藥途徑，藥劑的個體反應(yīng)，配方的類型和/或投藥的時間或間隔，適當(dāng)?shù)仄x上述劑量范圍可能是必要的。因此，于某些情況下，投藥量少于上述表示的劑量范圍或超過上限值，亦可以達(dá)到所需的劑量。當(dāng)所給予的是高劑量情況下，建議將高劑量分成數(shù)個單劑量于一規(guī)定期間內(nèi)投藥，例如，一天內(nèi)；投藥方式以數(shù)個單劑量或持續(xù)性投藥(即，持續(xù)性靜脈注射)。此投藥方式較可能應(yīng)用于慢性治療(即錠劑的形式)上。實(shí)施例I制備金納米團(tuán)簇本發(fā)明的熒光金納米團(tuán)簇是以先前所述方法(參見Linetal.,ACSNano20093:395-401)進(jìn)行制備。簡言之，經(jīng)由單相反應(yīng)(Singlephasereaction)(參見JanaandPeng,JAmChemSoc2003125:14280-14281)來合成6-納米的與雙十二烷基二甲基溴化銨(didodecyldimethylammonium)穩(wěn)定結(jié)合的金納米團(tuán)簇(AuNPODDAB),其組成結(jié)構(gòu)如圖I所示。再逐漸滴加入黃金前驅(qū)溶液(氯化金溶于雙十二烷基二甲基溴化銨-甲苯溶液)使電漿吸收作用逐漸耗失，直至溶液轉(zhuǎn)變成黃色透明狀為止。接著，將先前制備的納米團(tuán)簇加入至還原態(tài)硫辛酸中以進(jìn)行配位基置換；還原硫辛酸需新鮮制備，其是以硫辛酸與溴化四丁基銨(TBAB)摩爾比為4:1的比例混合。上述步驟生成深褐色納米團(tuán)簇凝塊混合物，以紫外線燈照射(365納米，30分鐘)納米團(tuán)簇凝塊使凝塊凝集。去除上清液，加入甲醇至納米團(tuán)簇凝塊以重新懸浮并分散納米團(tuán)簇凝塊，接著加入氯仿沉淀去除游離的界面活性齊U。此干燥的納米團(tuán)簇沉淀物可再次以硼酸緩沖液(pH9)懸浮散開。接著進(jìn)行超高速離心(110，OOOrpm)三次，去除多余的硫辛酸。為了收集金納米團(tuán)簇，加入PBS緩沖液至30千道耳頓分子量截斷(MWCO)濃縮離心管，至納米團(tuán)簇透明溶液膠體穩(wěn)定且不具電漿吸收波鋒為止。該金納米團(tuán)簇的濃度，于波長420納米下的吸光系數(shù)約為450，OOOM-1Cm'實(shí)施例2降低培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)(ROS)2.I培養(yǎng)細(xì)胞與傳送實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇將人類動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基MV(此培養(yǎng)基名稱為“完全培養(yǎng)基(completeculturemedium)”購于PromoCel1，Heidelberg,Germany)中。以每平方公分10，000細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種至I%明膠涂覆的塑料皿或2%明膠涂覆的蓋玻片上，培養(yǎng)于含有95%空氣與5%CO2的37°C培養(yǎng)箱內(nèi)。實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇以無血清的完全培養(yǎng)基且和有/無添加陽離子脂質(zhì)試劑(LipofectAMINE2000,Invitrogen,Carlsbad,Calif·ornia,USA)一起被傳送至人類動脈內(nèi)皮細(xì)胞。簡言之，以250微升無血清或抗體的培養(yǎng)基稀釋該實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇和一脂質(zhì)載體。經(jīng)培養(yǎng)5分鐘后，被稀釋的該實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇和該脂質(zhì)載體充分混合培養(yǎng)10分鐘。將金納米團(tuán)簇/脂質(zhì)載體復(fù)合物加入含有細(xì)胞的塑料皿和條件培養(yǎng)基(即，事先經(jīng)過喂養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)培養(yǎng)3至5天之培養(yǎng)基)。培養(yǎng)4小時后，以新鮮的培養(yǎng)基置換包含該實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇的培養(yǎng)基，接著定時以顯微鏡下觀察該人類動脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞型態(tài)變化并且以流式細(xì)胞儀分析活性氧物質(zhì)。于室溫下，所有的樣本以顯微鏡(DMIRBE,Leica,ffetzlar,Germany)物鏡20倍/光圈O.4及CXD照相機(jī)(DC300F,Leica)記錄之，結(jié)果示于圖2。圖I為人類動脈細(xì)胞有/無以實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇處理，并于處理后第1、7、21或28天分別以相位差顯微鏡或熒光顯微鏡拍攝的照片。該些照片可以證實(shí)實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇能夠維持人類動脈上皮細(xì)胞之細(xì)胞型態(tài)至少28天。2.2以實(shí)施例I的金納米團(tuán)簇降低活性氧物質(zhì)利用偵測一熒光染劑，2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯染料(2,7-dichlorodihydrofluoresceindiacetatedye,DCFDA)(購于Invitrogen,GrandIsland,NY,USA)，來評估人類動脈內(nèi)皮細(xì)胞氧活性物質(zhì)含量，進(jìn)而推估出細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力。該熒光染劑與細(xì)胞反應(yīng)的最終濃度為10μM0培養(yǎng)I小時后，以HBSS緩沖液沖洗細(xì)胞，接著以胰蛋白酶懸浮細(xì)胞，立即以FACScan流式細(xì)胞儀分析。以FLI偵測器偵測二氯熒光黃(DCF)訊號，此訊號為DCFDA熒光物質(zhì)的氧化形式，藉以偵測熒光強(qiáng)度的中位數(shù)值量，進(jìn)而可相對地評估細(xì)胞內(nèi)之氧化程度，結(jié)果如表一所示。表I以金納米團(tuán)簇人降低人類動脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧物質(zhì)情況權(quán)利要求1.一種用以減緩一培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化的方法，包含在該培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)加入一有效劑量的一金納米團(tuán)簇，其中該金納米團(tuán)簇的粒徑為I至20納米。2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該金納米團(tuán)簇是外層涂覆有二氫硫辛酸的金納米團(tuán)簇。3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該培養(yǎng)細(xì)胞選自于人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、人類表皮細(xì)胞、人類內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞、和人類間葉干細(xì)胞所組成的群組中。4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中該有效劑量的金納米團(tuán)簇約在I至1，OOOnM間。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該有效劑量的金納米團(tuán)簇約在10至3，OOnM間。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該有效劑量的金納米團(tuán)簇約在30至IOOnM間。7.—種金納米團(tuán)簇的用途，該金納米團(tuán)簇是可用來減緩培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化，且該金納米團(tuán)簇的粒徑為I至20納米間。8.如權(quán)利要求7所述的用途，其中該金納米團(tuán)簇是外層涂覆有二氫硫辛酸的金納米團(tuán)簇。9.如權(quán)利要求7所述的用途，其中該培養(yǎng)細(xì)胞選自于人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、人類表皮細(xì)胞、人類內(nèi)皮前驅(qū)細(xì)胞、人類胚胎干細(xì)胞、和人類間葉干細(xì)胞所組成的群組中。10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中該培養(yǎng)細(xì)胞為人類主動脈內(nèi)皮細(xì)胞。全文摘要本揭示內(nèi)容為一種以金納米團(tuán)簇來減緩培養(yǎng)細(xì)胞的氧化壓力和/或老化，或減緩一個體由血管因子或疾病所引起的氧化壓力和/或老化癥狀的方法、組合物及用途。本揭示內(nèi)容的金納米團(tuán)簇粒徑約為0.1至20納米，且較佳是涂覆有二氫硫辛酸的金納米團(tuán)簇。文檔編號C12N5/071GK102952775SQ20121030738公開日2013年3月6日申請日期2012年8月27日優(yōu)先權(quán)日2011年8月26日發(fā)明者葉宏一,張恒雄,林政鞍,王學(xué)孝申請人:中原大學(xué),葉宏一,王學(xué)孝