專利名稱：一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法。
背景技術(shù)：
菌種的強(qiáng)弱直接影響到發(fā)酵效價(jià)。因此選育出一種優(yōu)質(zhì)菌種對(duì)于紅霉素發(fā)酵來說具有非常重要的意義。紅霉素產(chǎn)生菌的常規(guī)誘變選育方法是先制備一定濃度的孢子懸浮液，孢子懸浮液是將生長至孢子狀態(tài)保存的斜面用無菌水刮取制成混懸液，然后采用各種物理和化學(xué)的誘變劑進(jìn)行誘變處理。該誘變方法針對(duì)孢子進(jìn)行誘變，由于孢子是菌種在生長繁殖過程中所產(chǎn)生的有繁殖和休眠作用的細(xì)胞，它的營養(yǎng)細(xì)胞通過細(xì)胞壁加厚和積存養(yǎng)料而能抵抗不 良環(huán)境條件，因此，通常對(duì)菌種的保藏均采用保藏其孢子態(tài)的細(xì)胞，從而達(dá)到穩(wěn)定保存的目的。但是，也正因?yàn)殒咦拥倪@種生理特性，致使孢子對(duì)誘變劑有一定的抗逆性，從而大大減弱了誘變劑對(duì)遺傳物質(zhì)的誘變效應(yīng)，導(dǎo)致突變率低，無法滿足生產(chǎn)需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種可獲得較高突變率，誘變方法簡便、易控制，且可快速有效地獲得高的正突變率，誘變菌種性狀穩(wěn)定的含孢子芽體菌種的誘變選育方法。本發(fā)明是基于以下原理而設(shè)計(jì)I、通過多次試驗(yàn)觀察到在一定的培養(yǎng)條件下將孢子培養(yǎng)至剛剛萌發(fā)或生長為菌絲體時(shí)，孢子在條件發(fā)生變化后萌發(fā)首先消耗自身儲(chǔ)存的養(yǎng)料，從而使細(xì)胞壁變薄，且結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，特別是菌絲體，它的細(xì)胞膜通透性增加，故而抗逆性會(huì)大大減弱，對(duì)誘變劑特別敏感。同時(shí)我們也觀察到菌絲體對(duì)干燥環(huán)境和誘變劑都過于敏感，在誘變過程中濃度和死亡率難以控制，不宜操作，容易導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。2、離子注入微生物誘變選育是核技術(shù)應(yīng)用于生物研究，進(jìn)行物理科學(xué)與生命科學(xué)交叉學(xué)科研究的典型范例，其作用機(jī)理是高能量離子體對(duì)生物體有兩個(gè)沉積作用，即能量沉積和質(zhì)量沉積。能量沉積指注入的離子與生物體大分子發(fā)生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物體大分子逐步獲得能量進(jìn)而發(fā)生鍵斷裂，原子被擊出位，生物大分子留下斷鍵或缺陷的過程。質(zhì)量沉積即注入的離子與生物大分子形成新的分子。這兩種雙重作用，從而使生物體產(chǎn)生死亡，引起自由基間接損傷，染色體重復(fù)、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學(xué)效應(yīng)。所以，離子注入誘變可得到較高的突變率，且突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定。本發(fā)明正是利用菌種自身生理生化特點(diǎn)，結(jié)合離子注入誘變得到紅霉素產(chǎn)生菌，具體為
一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征是將培養(yǎng)好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。上述紅色糖多孢菌孢子芽體的培養(yǎng)過程為首先制備孢子懸浮液，用滅菌的濾紙過濾，收集過濾孢子液，然后在過濾孢子液中加入S培養(yǎng)液，在34 37°C條件下培養(yǎng)13 15小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)有70 80%的孢子發(fā)芽則終止培養(yǎng)，離心收集孢子芽，用無菌生理鹽水洗滌，等體積懸浮。所述S培養(yǎng)基配比為葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏0.4%，MgSO4. 7H20O. 05%, KH2PO4 O. 2%, K2HPO4O. 4%，以 g/100ml H2O 計(jì)。所述離子注入誘變采用N離子注入機(jī)實(shí)現(xiàn)。 所述離子注入誘變具體為將培養(yǎng)好的紅色糖多孢菌孢子芽體放置在空白培養(yǎng)皿內(nèi)涂布均勻風(fēng)干，然后放置到N離子注入機(jī)中，抽真空，真空度達(dá)5*10_4Pa時(shí)，充入氮?dú)?，力口速電壓達(dá)20KV起弧進(jìn)行真空環(huán)境的離子注入誘變5 500秒。離子注入誘變后，先加無菌水洗脫，稀釋后涂平板培養(yǎng)，挑選形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的單菌落試管斜面培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵效價(jià)，初篩留種。本發(fā)明采用將離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌，可得到較高的突變率，并且可快速有效地獲得正突變率高的紅霉素菌株，將該菌株穩(wěn)定純化，用于生產(chǎn)可有效提高生產(chǎn)效益。
具體實(shí)施例方式I選育的步驟出發(fā)菌株(挑選生產(chǎn)使用菌株紅色糖多孢菌saccharopolysporaerythraea)，孢子萌發(fā)培養(yǎng)，孢子芽體的收集，離子注入誘變，分離培養(yǎng)，挑取單菌落接斜面，搖瓶考察，發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，初篩留種。2誘變篩選過程2. I挑選大生產(chǎn)使用的生長飽滿的工作細(xì)胞庫斜面，加入30ml無菌水，用接種環(huán)刮取孢子，將其懸浮在無菌水中，制成混合均勻的孢子懸浮液。用滅菌的濾紙進(jìn)行過濾，收集過濾孢子液備用。2. 2孢子萌發(fā)培養(yǎng)。2. 2. I孢子芽體的生理特點(diǎn)。孢子萌發(fā)是先吸水膨脹，然后長出芽管，孢子萌發(fā)以芽管長度超過孢子直徑一半為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。我們統(tǒng)計(jì)了孢子的萌發(fā)率和萌發(fā)時(shí)間。使用S培養(yǎng)液(使用S培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)配比液，其配比以g/100ml H2O計(jì)，葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏 0. 4%,MgSO4. 7Η200· 05%，KH2PO4 0. 2%, K2HPO4 0. 4% )培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)菌種，其萌發(fā)率一般在80%，孢子萌發(fā)的時(shí)間為13 15小時(shí)。2. 2. 2孢子芽體的培養(yǎng)。準(zhǔn)確吸取5ml過濾孢子液加入25ml的S培養(yǎng)液中，在35°C搖瓶柜內(nèi)振搖培養(yǎng)至13 15小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)約有70 80%的孢子發(fā)芽則終止培養(yǎng)。2. 2. 3離心收集孢子芽體。將培養(yǎng)好的發(fā)芽孢子的S液吸入離心管內(nèi)2000轉(zhuǎn)離心沉降，用無菌生理鹽水洗滌3遍，等體積懸浮。2. 2. 4孢子芽體的離子注入誘變的處理。吸取一定量的孢子芽體懸浮液放置在90mm的空白培養(yǎng)皿內(nèi)涂布均勻風(fēng)干，打開離子機(jī)真空箱體，放置培養(yǎng)皿開蓋，關(guān)上箱體門，對(duì)小靶室進(jìn)行抽真空，真空度達(dá)到5*104Pa時(shí)，開充氣閥，充入氮?dú)?，調(diào)節(jié)各模塊參數(shù)穩(wěn)定起弧后，加速電壓達(dá)20KV起弧進(jìn)行真空環(huán)境的離子注入誘變5 500秒，操作結(jié)束，取出平板，用無菌水進(jìn)行洗脫，將洗脫的懸浮液稀釋涂平板進(jìn)行培養(yǎng)(瓊脂培養(yǎng)基)。培養(yǎng)至6 8天后，觀察菌落生長成熟(有明顯的形態(tài)分化)后，將其終止培養(yǎng)，放置在冷藏箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?搖瓶篩選過程。取出保存?zhèn)溆玫姆蛛x平板，挑選分離平板上生長的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的單菌落接試管斜面(瓊脂培養(yǎng)基)，放置在恒溫室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟后冷藏，配置搖瓶培養(yǎng)基(黃豆餅粉2. 5 %、糊精2. O %、葡萄糖I. 90 %、碳酸鈣O. 5 %、硫酸銨0.1%、玉米漿1.2%、磷酸二氫鉀O. 04%，以g/100mlH20計(jì))，進(jìn)行搖瓶接種，將生長成熟的搖瓶種子培養(yǎng)液移種到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基(同搖瓶培養(yǎng)基)內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵搖瓶效價(jià)單位，初篩留種。4使用設(shè)備的特點(diǎn)。
4. I該N離子注入設(shè)備的設(shè)計(jì)采用雙潘寧工作原理。具有會(huì)切磁場的雙潘寧源產(chǎn)生的N離子經(jīng)過磁場和放電室?guī)缀谓Y(jié)構(gòu)的雙重約束，并且離子運(yùn)動(dòng)路程加長，增加了離子間的碰撞幾率，使得離子的能量均一，離子密度提高，且離子的運(yùn)動(dòng)方向基本一致。4. 2該設(shè)備采用氮?dú)鉃殡x子源。因?yàn)镹離子為DNA堿基的重要元素之一，N離子注入不僅可以直接引起堿基分子結(jié)構(gòu)的變化，還可以參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重組和修復(fù)。所以使我們的離子注入誘變可得到較高的突變率，且突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定。4. 3該設(shè)備離子注入在真空腔室內(nèi)進(jìn)行，模仿太空環(huán)境。本次試驗(yàn)獲得3株菌株提高率在15%以上。初篩搖瓶結(jié)果如下
菌株編號(hào)效價(jià)(u/ml)平均值(u/ml)對(duì)照(u/ml) 提高率％
^5532~ 49996082 5538477116. 076
O
~36# 5586 5423 5509 5506477115.41^
103# 4822 4986 5036 4948419218.0權(quán)利要求
1.一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征是將培養(yǎng)好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。
2.按照權(quán)利要求I所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征在于上述紅色糖多孢菌孢子芽體的培養(yǎng)過程為首先制備孢子懸浮液，用滅菌的濾紙過濾，收集過濾孢子液，然后在過濾孢子液中加入S培養(yǎng)液，在34 37°C條件下培養(yǎng)13 15小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)有70 80%的孢子發(fā)芽則終止培養(yǎng)，離心收集孢子芽，用無菌生理鹽水洗滌，等體積懸浮。
3.按照權(quán)利要求2所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征在于所述S培養(yǎng)基配比為葡萄糖1%，蛋白胨O. 4 %，酵母膏O. 4 %,MgSO4. 7H20 O. 05%,KH2PO4O. 2%, K2HPO4O. 4%,以 g/100ml H2O 計(jì)。
4.按照權(quán)利要求I所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征在于所述離子注入誘變采用N離子注入機(jī)實(shí)現(xiàn)。
5.按照權(quán)利要求I或4所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征在于所述離子注入誘變具體為將培養(yǎng)好的紅色糖多孢菌孢子芽體放置在空白培養(yǎng)皿內(nèi)涂布均勻風(fēng)干，然后放置到N離子注入機(jī)中，抽真空，真空度達(dá)5*10_4Pa時(shí)，充入氮?dú)?，力口速電壓達(dá)20KV起弧進(jìn)行真空環(huán)境的離子注入誘變5 500秒。
6.按照權(quán)利要求5所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征在于離子注入誘變后，先加無菌水洗脫，稀釋后涂平板培養(yǎng)，挑選形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的單菌落試管斜面培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，檢測發(fā)酵效價(jià)，初篩留種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌的選育方法，其特征是將培養(yǎng)好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。本發(fā)明采用將離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產(chǎn)生菌，可得到較高的突變率，并且可快速有效地獲得正突變率高的紅霉素菌株，將該菌株穩(wěn)定純化，用于生產(chǎn)可有效提高生產(chǎn)效益。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102851276SQ201210308738
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者李學(xué)兵, 郭惠芬, 陳荔, 楊玉芳, 蔣鴻 申請(qǐng)人:寧夏啟元藥業(yè)有限公司