專利名稱：一種四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素是從放線菌金色鏈霉菌(Streptomyces aureofa-ciens)的培養(yǎng)液分離出來的抗菌物質(zhì)，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素，對結(jié)核菌、變形菌等則無效。其作用機(jī)制是與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，從而阻止氨?；?RNA同核糖核蛋白體結(jié)合?，F(xiàn)有技術(shù)中，四環(huán)素自然選育流程為確定試驗方案一選擇出發(fā)株一制備平板分離培養(yǎng)基一分離平板的孵制一用具準(zhǔn)備和滅菌一制備單孢子懸浮液一分離培養(yǎng)一挑單菌落接斜面一搖瓶初篩一初篩留種一接復(fù)篩斜面一搖瓶復(fù)篩一復(fù)篩留種一性狀考察一聞廣 菌種復(fù)篩留種。上述方法存在著流程繁瑣、選育周期長、工作量大、需要專用設(shè)備(恒溫振蕩器)、能耗大、成本高、篩選效率低等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供一種有效縮短菌種選育周期，提高篩選效率，降低篩選成本的四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法。在菌種誘變篩選過程中，常常由于細(xì)胞壁的存在而影響其對外界理化因子的敏感性，從而大大減弱了誘變劑對遺傳物質(zhì)的誘變效應(yīng)，導(dǎo)致突變率低，無法滿足生產(chǎn)需求?；诖耍景l(fā)明采用溶菌酶對細(xì)胞脫壁后再進(jìn)行EDTA處理的方法，從而選育出四環(huán)素高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，具體方案為將培養(yǎng)好的出發(fā)菌株加水制成孢子懸浮液，搖瓶振蕩培養(yǎng)，過濾稀釋后，將懸浮液分裝于四個試管中，加入等量的EDTA分別作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分鐘后，統(tǒng)計正變率和死亡率，選出正變率高的作用時間，然后做進(jìn)一步的搖瓶篩選，選出提高率高的菌株。所述搖瓶振蕩培養(yǎng)時間15 25分鐘。所述溶菌酶加入量O. 2 O. 8ml。所述EDTA的加入濃度為O. 225 O. 295mol/L，加入濃度如果低于所給范圍，不足以消除金屬離子和有機(jī)雜質(zhì)對比色反應(yīng)的干擾，如果高于所給范圍，則會影響菌種的突變。所述搖瓶篩選為挑選單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，后挖塊接種子瓶和發(fā)酵瓶，搖床振蕩培養(yǎng)6 7天后放瓶測定化學(xué)效價，選取高效價菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩和特性考察。本發(fā)明與紫外線、離子注入等方法處理菌種相比較，具有操作簡單、費(fèi)用低、安全性高、對環(huán)境污染小、菌種突變率高，所產(chǎn)菌株搖瓶效價高等特點(diǎn)。本發(fā)明誘變菌種作用時間分別為3、4、5和7min，統(tǒng)計正變率和死亡率。結(jié)果顯示，作用處理時間5min時菌種正變率最高，為較好的選擇，這時的死亡率一般在15%左右。在平板分離培養(yǎng)基上分離的單菌落，菌落形態(tài)變化較小，但菌種的正變率較高。經(jīng)EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)+溶菌酶處理后將選出的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，搖瓶效價較對照提高了20%。
具體實(shí)施例方式(I)孢子懸浮液的制備向生長好的金色鏈霉菌茄瓶斜面中加15m無菌水，制成孢子懸浮液，移入一含有玻璃珠的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)20min，過濾、稀釋。⑵誘變處理把稀釋液分裝于四支已滅過菌的試管中各Iml，然后同時加入EDTA溶液O. 6ml，分別作用3分鐘，4分鐘，5分鐘和7分鐘，再加溶菌酶O. 8ml作用3分鐘后。將處理過的孢子液梯度稀釋至10_5，取每個稀釋度的O. 1,0. 3和O. 5ml孢子液涂平板(瓊脂培養(yǎng)基)，在最 適溫度33 35°C條件下培養(yǎng)90 IOOhr。(3)分別統(tǒng)計正變率和死亡率，選出正變率高的作用時間為5min的平板，挑選單菌落接于斜面培養(yǎng)基(瓊脂2.5%，麩皮4 %，MgSO4O. 015%，(NH) 2ΗΡ040 . 02 %,K2HPO4O. 02% )上，在最適溫度33 35°C培養(yǎng)90 IOOhr后，挖塊接種子瓶和發(fā)酵瓶，搖床振蕩培養(yǎng)7天后放瓶測定化學(xué)效價。挑選高效價菌株制備成冷凍液，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩、特性考察。挑選出了高單位菌株，搖瓶效價較對照提高了 20%。本次試驗突變率、死亡率結(jié)果統(tǒng)計如下
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^ll止:突變率％死亡韋％
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-^ψι本次試驗搖瓶效價及提高率突變率結(jié)果統(tǒng)計如下
I平均值^對is————...............................................................................
菌株效價(u/ml)β高率％
(u/ml)(u/ml )
Tsi18()0().....................1785()......................I.....7803 I...7..884I...6..:...7—.........
"68#I.....7. .....15「7.7.10Π328 17348^15319 Γ.3:......2................
83#18850 I 79h"0 1832() Γ8383^...............................20. O—
結(jié)論H 3# I 丨·株留種進(jìn)if傳代考察e
權(quán)利要求
1.一種四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征是將培養(yǎng)好的金色鏈霉菌菌株加水制成孢子懸浮液，搖瓶振蕩培養(yǎng)，過濾稀釋后，將懸浮液分裝于四個試管中，加入等量的EDTA溶液分別作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分鐘后，梯度稀釋至10_5，取每個稀釋度的O. I、O.3和O. 5ml孢子液涂平板培養(yǎng)，統(tǒng)計正變率和死亡率，選出正變率高的作用時間，然后做進(jìn)ー步的搖瓶篩選，選出提高率高的菌株。
2.按照權(quán)利要求I所述的四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征是所述搖瓶振蕩培養(yǎng)時間15 25分鐘。
3.按照權(quán)利要求I所述的四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征是所述溶菌酶加入量O.2 O. 8ml ο
4.按照權(quán)利要求I所述的四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征是所述EDTA溶液濃度為O.225 O. 295mol/L。
5.按照權(quán)利要求I所述的四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征在于所述搖瓶篩選為挑選單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)，后挖塊接種子瓶和發(fā)酵瓶，搖床振蕩培養(yǎng)6 7天后放瓶測定化學(xué)效價，選取高效價菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩和特性考察。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四環(huán)素高產(chǎn)菌的選育方法，其特征是將培養(yǎng)好的金色鏈霉菌菌株加水制成孢子懸浮液，搖瓶振蕩培養(yǎng)，過濾稀釋后，將懸浮液分裝于四個試管中，加入等量的EDTA溶液分別作用3、4、5和7min，加入溶菌酶作用3分鐘后，后梯度稀釋至10-5，取每個稀釋度的0.1、0.3和0.5ml孢子液涂平板培養(yǎng)，統(tǒng)計正變率和死亡率，選出正變率高的作用時間，然后做進(jìn)一步的搖瓶篩選，選出提高率高的菌株。本發(fā)明采用溶菌酶對細(xì)胞脫壁后再進(jìn)行EDTA處理的方法，從而選育出四環(huán)素高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株，與紫外線、離子注入等方法處理菌種相比較，具有操作簡單、費(fèi)用低、安全性高、對環(huán)境污染小、菌種突變率高，所產(chǎn)菌株搖瓶效價高等特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/01GK102851274SQ20121030841
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者李學(xué)兵, 陳卓 申請人:寧夏啟元藥業(yè)有限公司