一種用于處理生物樣本的組合物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于處理生物樣本的組合物。該用于處理生物樣本的組合物由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH值調(diào)節(jié)劑組成，其質(zhì)量比為2.0-12.0：2.5-12.0：0-0.4：0-0.5。本發(fā)明提供的組合物在用于富集生物樣本中的單個(gè)核細(xì)胞等時(shí)，在部分參數(shù)上超越了目前可商購(gòu)獲得的國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品，具有更高的安全性和有效性，為此類(lèi)產(chǎn)品的臨床轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了可能。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于處理生物樣本的組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于處理生物樣本的組合物及液體介質(zhì)，屬于生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]利用離心法富集生物樣本中的生物顆粒是生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)技術(shù)。許多生物顆粒均可以通過(guò)離心法這一技術(shù)實(shí)現(xiàn)富集，例如，動(dòng)物或植物的細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)菌、病毒或生物大分子等。這些在懸液中的生物樣本在離心作用下的表現(xiàn)主要取決于生物樣本的大小和密度，這可以通過(guò)斯托克斯方程(Stokes equation)得到解釋。斯托克斯方程(見(jiàn)下式)描述了球形顆粒在液體介質(zhì)中受到離心作用時(shí)運(yùn)動(dòng)速率的變化規(guī)律:
d2( P2-P1) X g
[0003]-
[0004]其中:d代表球形顆粒的直徑，P2代表球形顆粒的密度，P1代表液體介質(zhì)的密度，η代表液體介質(zhì)的粘度，g代表離心力。
[0005]通過(guò)斯托克斯方程很容易得到如下結(jié)論:(1)沉降速率與顆粒大小成正比；(2)沉降速率和顆粒密度/液體介質(zhì)的密度差成正比；(3)當(dāng)顆粒和液體介質(zhì)的密度相等時(shí)，顆粒的沉降速率為零；(4)沉降速率與液體介質(zhì)的粘度成反比；(5)沉降速率與離心力成正比。
[0006]根據(jù)斯托克斯方程，離心法富集顆粒需要借助一種適宜材料的液體介質(zhì)得以實(shí)現(xiàn)，在這種液體介質(zhì)中，不同的生`物顆粒由于其各自的顆粒大小、顆粒密度或其它理化及生物學(xué)特性不同而具有不同的表現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)其各自的富集目的。依據(jù)生物顆粒在液體介質(zhì)中的表現(xiàn)類(lèi)型不同，可以將離心法富集生物顆粒分為差速離心和密度梯度離心，而密度梯度離心又可以進(jìn)一步被分為速率-區(qū)帶離心和等密度離心。
[0007]等密度離心法是一種在細(xì)胞生物學(xué)中廣泛用于富集特定細(xì)胞的技術(shù)方案，其原理如上述由斯托克斯方程所得到的結(jié)論(3)中所闡釋的那樣:由于所選擇的液體介質(zhì)的密度等于或略大于欲富集的目的細(xì)胞，因此目的細(xì)胞在離心作用下，無(wú)論離心時(shí)間長(zhǎng)短，都將無(wú)法穿透液體介質(zhì)的界面沉到離心容器的底部，進(jìn)而在液體介質(zhì)的界面處(即平衡位置)得到富集。典型的等密度離心法是利用單次密度梯度離心法純化血液或骨髓樣本中的淋巴細(xì)胞，其中所采用的液體介質(zhì)通常是含有聚蔗糖-碘化物組合配方的具有生理滲透壓的水溶液。可商購(gòu)獲得的此類(lèi)產(chǎn)品有很多種，例如通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare)的產(chǎn)品Ficoll-Paque?PLUS、西格瑪集團(tuán)(Sigma)的產(chǎn)品Histopaquel077?等。這些常用的液體介質(zhì)大多采用相同的主要原料作為配方，即聚蔗糖400 (Ficoll 400)和泛影酸鈉(Diatrizoate),這是20世紀(jì)70年代由Boyum等人逐漸建立并不斷優(yōu)化而得到的十分成功的配方體系。
[0008]選擇這兩種主要原料作為介質(zhì)配方是有其深刻原因的，J Graham在他的著作Biological Centrifugation中詳細(xì)總結(jié)了適合作為密度梯度介質(zhì)的材料應(yīng)具備的特性，包括(I)能夠制備所需密度范圍的足夠的溶解度；(2)在所需密度范圍內(nèi)不形成高粘度的溶液；(3)當(dāng)待分離的生物樣本對(duì)滲透壓敏感時(shí)，密度梯度介質(zhì)既不高滲也不低滲；(4)可以調(diào)節(jié)PH值等參數(shù)與待分離的生物樣本保持一致；(5)不影響樣本的生物學(xué)活性；(6)無(wú)毒且不被細(xì)胞代謝；(7)不與離心管反應(yīng)，且不影響檢測(cè)過(guò)程；(8)容易從純化的產(chǎn)品中去除；(9)價(jià)格低廉等。應(yīng)當(dāng)指出，沒(méi)有一種產(chǎn)品可以同時(shí)滿足上述全部特性，因此適用于不同生物樣本的多種產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。例如，DNA的密度在1.50-1.80g/cm3之間，應(yīng)選用高密度介質(zhì)氯化銫或硫酸銫溶液等。聚蔗糖400和泛影酸鈉的組合配方除了能提供足夠的密度，又能夠避免過(guò)高的粘度影響分離效率，因此成為了細(xì)胞純化操作中構(gòu)建密度梯度介質(zhì)的一種良好選擇。
[0009]具體而言，聚蔗糖400是一種化學(xué)合成的高分子聚合物，平均分子量約為400kD，可溶于水，其最大水溶液密度可高達(dá)1.23g/mL，大于血液或骨髓樣本中密度最大的紅細(xì)胞，適用性較廣。此外，聚蔗糖400由于其多羥基大分子的特殊結(jié)構(gòu)，可與紅細(xì)胞表面吸附結(jié)合，破壞紅細(xì)胞表面的電荷層，從而降低紅細(xì)胞之間的靜電斥力，并通過(guò)“橋聯(lián)”模式促使紅細(xì)胞出現(xiàn)緝1錢(qián)狀沉淀。聚鹿糖400這種促進(jìn)紅細(xì)胞聚集沉降的作用對(duì)于淋巴細(xì)胞的純化是至關(guān)重要的。根據(jù)斯托克斯方程可知，紅細(xì)胞發(fā)生聚集而得的聚集體由于其具有更大體積而顯著加速了其沉降速度，這不僅大大提高了純化效率，更重要的是對(duì)于數(shù)量占絕對(duì)多數(shù)的紅細(xì)胞的去除而言，這種聚集沉降的作用保證了較高的淋巴細(xì)胞純度，有效減少了紅細(xì)胞的污染。然而，這種促進(jìn)紅細(xì)胞聚集沉降的作用也有其負(fù)面影響，盛佳等報(bào)道了高分子對(duì)于紅細(xì)胞的這種聚集沉降作用隨分子量變大而增強(qiáng)(盛佳等，紅細(xì)胞聚集的生物力學(xué)基礎(chǔ)，《力學(xué)進(jìn)展》，1999年，第29卷，第I期)，可知聚蔗糖400對(duì)于紅細(xì)胞的這種聚集沉降作用較強(qiáng)，而過(guò)快的沉降會(huì)致使淋巴細(xì)胞等目的細(xì)胞陷入紅細(xì)胞聚集體而發(fā)生目的細(xì)胞群的非特異性丟失，這也是離心法進(jìn)行淋巴細(xì)胞純化操作中低收率的一個(gè)原因。綜上所述，紅細(xì)胞的這種聚集應(yīng)受到合理控制，高分子這種促進(jìn)聚集的作用應(yīng)在適宜的范圍內(nèi)，速度應(yīng)適中。泛影酸鈉是臨床常用的一種小分子離子型碘對(duì)比劑，其與聚蔗糖400組合可以進(jìn)一步為組合體系提供適宜的粘度和滲透壓以提高純化效率。
[0010]利用密度梯度介質(zhì)完成淋巴細(xì)胞的富集是一項(xiàng)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作，其一般步驟包括:(I)用一定比例的平衡鹽溶液或生理鹽水對(duì)血液或骨髓樣本進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)?2)將稀釋后的樣本小心沿離心容器壁加入預(yù)裝有密度梯度介質(zhì)的離心容器中，保持樣本與介質(zhì)的界面清晰，不發(fā)生混合；(3)在一定溫度和一定離心條件下進(jìn)行離心，比如20° C時(shí)，離心力為400g的條件下離心30分鐘；(4)小心從離心機(jī)中取出裝有樣品的離心容器，利用巴斯德吸管或移液管等裝置吸取富集在樣本和介質(zhì)層交界面處的“白膜層” ；(5)用一定比例的平衡鹽溶液、生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌得到的細(xì)胞產(chǎn)品，除去血小板、細(xì)胞碎片與部分死細(xì)胞，以及殘余的密度梯度介質(zhì)；(6)將得到的細(xì)胞懸液用于細(xì)胞培養(yǎng)等后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在臨床應(yīng)用方面，特別是在細(xì)胞移植或成分輸血的情況中，得到的細(xì)胞懸液可能將被直接輸注入人體。
[0011]含有聚蔗糖400-泛影酸鈉組合配方的在售的密度梯度介質(zhì)產(chǎn)品已可以滿足實(shí)驗(yàn)室生物學(xué)研究的大部分需要。然而，這種組合配方對(duì)目的細(xì)胞的生物學(xué)影響也是不可忽略的，特別是其對(duì)一些特定細(xì)胞表面抗原表達(dá)量的影響已在多篇文獻(xiàn)中見(jiàn)諸報(bào)道。例如，Watson等人報(bào)道了聚鹿糖介質(zhì)對(duì)嗜中性粒細(xì)胞表面抗原的影響(Watson F等人，Neutrophil function in whole blood and after purification:changes inreceptor expression, oxidase activity and responsiveness to cytokines,Biosc1.Rep.1992，12(2): 123.) ；LundahI等人報(bào)道了通過(guò)聚鹿糖-泛影酸鈉組合配方分離而得的單核細(xì)胞與通過(guò)氯化銨裂解而得的單核細(xì)胞相比，⑶Ilb/⑶18比例發(fā)生了顯著改變(Lundahl J 等人，Altered expression of CDllb/CD18 and CD62L on human monocytesafter cell preparation procedures, J.1mmunol.Methods.1995, 180(1):93.)；又如Souques等人報(bào)道了通過(guò)聚蔗糖-泛影酸鈉組合配方分離而得的單核細(xì)胞的⑶16和⑶62L表面抗原均發(fā)生了顯著的過(guò)表達(dá)(Souques F等人，Modification of surface markerexpression on CD 14 monocytes of allergic patients after lysis or Ficollpurification, J.Tmmunol.Methods.1997, 204:153)。聚鹿糖 400 作為一種高分子量的聚合物，已具有較強(qiáng)的抗原性，能夠引起致敏反應(yīng)，這在在體實(shí)驗(yàn)中得到了明確證實(shí)，例如一些文獻(xiàn)中報(bào)道了利用聚蔗糖400作為半抗原的載體，增強(qiáng)小鼠對(duì)弱抗原的免疫反應(yīng)應(yīng)答等。更重要的是，聚蔗糖400本身缺乏藥用經(jīng)驗(yàn)，其毒理學(xué)、代謝動(dòng)力學(xué)等重要藥學(xué)數(shù)據(jù)缺失。顯而易見(jiàn)，含有聚蔗糖400的密度梯度介質(zhì)如果用于臨床用途時(shí)，所得的細(xì)胞產(chǎn)品中聚蔗糖400的殘留量必須受到最嚴(yán)格的控制，避免其與細(xì)胞產(chǎn)品一同輸注進(jìn)入人體，產(chǎn)生進(jìn)一步的不良后果，這一點(diǎn)在一些國(guó)家的法律法規(guī)中已有明確限制，例如，2011年5月美國(guó)藥典(USP)〈1043〉中就細(xì)胞、基因和組織工程產(chǎn)品輔料(Ancillary Materials forCell, Gene, and Tissue-Engineered Products)制定了普遍適用的指導(dǎo)方針，其中有三點(diǎn)可以為我國(guó)在相同領(lǐng)域設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)提供重要參考:(1)細(xì)胞、基因和組織工程輔料被定義為不在終產(chǎn)物中出現(xiàn)的物料，這要求輔料的使用應(yīng)選取最小用量，且生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)使輔料的殘留量最小化并形成高效的定量檢定殘留量的方法；(2)輔料按風(fēng)險(xiǎn)程度分級(jí)，治療用藥物、生物制品、醫(yī)療器械和植入材料屬于低風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，即得到高度認(rèn)證的產(chǎn)品；而沒(méi)有臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的化學(xué)試劑級(jí)物料屬于中等風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，殘留量需得到更嚴(yán)格控制；動(dòng)物源性提取物及有明確毒性的化學(xué)實(shí)體屬于高等風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別，殘留量需得到更嚴(yán)格的控制；(3)推薦采用最低風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別的產(chǎn)品，即采用的輔料選擇得到認(rèn)證的治療產(chǎn)品，因?yàn)槠涫艿胶芎玫蔫b定，具有備案的毒性資料，并嚴(yán)格按受控、備案的過(guò)程進(jìn)行制備。據(jù)此，很容易做出判斷，聚蔗糖400由于不是得到認(rèn)證的治療產(chǎn)品，其缺乏嚴(yán)格的管理標(biāo)準(zhǔn)，因此聚蔗糖400-泛影酸鈉組合配方的密度梯度介質(zhì)應(yīng)被歸為中等風(fēng)險(xiǎn)材料，經(jīng)其處理的細(xì)胞終產(chǎn)品中的殘留量需得到嚴(yán)格控制，而這對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)而言，生產(chǎn)周期和成本無(wú)疑將大大增加。因此，篩選一種更為高效，特別是一種得到認(rèn)證的治療產(chǎn)品作為原料的密度梯度介質(zhì)，將為密度梯度介質(zhì)的臨床應(yīng)用提供安全性和法律依從性上的雙重保障。
[0012]我國(guó)2009年頒布的《細(xì)胞移植治療技術(shù)管理規(guī)范》中明確提出了純化細(xì)胞所需試劑和器械均必須經(jīng)食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)審批，具有臨床應(yīng)用許可證。然而，目前仍沒(méi)有一個(gè)可商購(gòu)獲得的產(chǎn)品宣稱(chēng)可以用于臨床非診斷用途，聚蔗糖400對(duì)這類(lèi)產(chǎn)品的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了不可忽視的制約作用。
[0013]專(zhuān)利申請(qǐng)201110456878.2公開(kāi)了一種用于單個(gè)核細(xì)胞分離的組合物及復(fù)方淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)，其是由分子量大于40kD的右旋糖酐、羥乙基淀粉與泛影酸鈉或泛影葡胺組成的。該專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┑慕M合物及分離介質(zhì)的分離效果與常規(guī)分離介質(zhì)沒(méi)有顯著性差異，但是，該專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┑慕M合物和分離介質(zhì)的配方較復(fù)雜，含有三種主要原料，這對(duì)于需要嚴(yán)格控制內(nèi)毒素的此類(lèi)產(chǎn)品而言，為其制備帶來(lái)了巨大不便。胡文濱對(duì)無(wú)菌產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制做了較為詳細(xì)的總結(jié)(胡文濱，無(wú)菌產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制，河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2010年，第27卷，第4期)。在無(wú)菌產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素的控制中，用量較大的主要原料是攜帶內(nèi)毒素的重要媒介，因此，無(wú)論對(duì)于主要原料的內(nèi)毒素檢測(cè)還是涉及主要原料的生產(chǎn)操作或設(shè)備載體均是重要的控制點(diǎn)。這說(shuō)明，配方越復(fù)雜，涉及的主要原料種類(lèi)越多，生產(chǎn)工藝中對(duì)于內(nèi)毒素的控制將越困難，且生產(chǎn)成本將越高。這一配方的復(fù)雜性為其工業(yè)生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化帶來(lái)了巨大障礙。造成這一問(wèn)題的重要原因是基于專(zhuān)利申請(qǐng)201110456878.2中表明了如下帶有偏見(jiàn)的認(rèn)識(shí):即該組合物和分離介質(zhì)必須采用特定比例的兩種功能分子(右旋糖酐和羥乙基淀粉)才能夠提供適宜的紅細(xì)胞凝集速度，并實(shí)現(xiàn)良好的淋巴細(xì)胞純度和淋巴細(xì)胞回收率，并且，該專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)貏e指出這種適宜的紅細(xì)胞凝集速度是兩種分子中單一的某一種分子無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。
[0014]綜上所述，研發(fā)一種配方更為簡(jiǎn)單、生產(chǎn)工藝更為便捷、成本更低、且產(chǎn)品內(nèi)毒素更容易控制的用于處理生物樣本的組合物及液體介質(zhì)是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題之一，解決這一問(wèn)題將為實(shí)現(xiàn)臨床治療用途的密度梯度介質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于處理生物樣本的組合物，通過(guò)將藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑和/或PH值調(diào)節(jié)劑相混合得到一種具有良好效果的用于生物顆粒富集的組合物。
[0016]本發(fā)明的目的還在于提供一種采用上述組合物制成的液體介質(zhì)，其可以用于生物顆粒的富集純化，是一種良好的用于生物顆粒富集的液體介質(zhì)。
[0017]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先提供了一種用于處理生物樣本的組合物，其由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH值調(diào)節(jié)劑組成，其質(zhì)量比為 2.0-12.0:2.5-12.0:0-0.4:0-0.5 ;優(yōu)選為 3.5-12.0:3.5-12.0:0-0.3:0-0.4 ;更優(yōu)選為 5.0-12.0:5.0-11.0:0-0.25:0-0.4。
[0018]該用于處理生物樣本的組合物也可以稱(chēng)為用于生物顆粒富集的組合物。
[0019]本發(fā)明還提供了一種用于處理生物樣本的液體介質(zhì)，以重量百分比計(jì)，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉2.0-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑
2.5-12.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%、pH值調(diào)節(jié)劑0-0.5wt%和余量水組成；優(yōu)選地，以重量百分比計(jì)，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉3.5-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑3.5-12.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.3wt%、pH值調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%和余量水組成；更優(yōu)選地，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉5.0-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑5.0-11.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.25wt%、pH值調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%和余量水組成。
[0020]該液體介質(zhì)可以是由本發(fā)明所提供的上述組合物溶于水(優(yōu)選注射用水)得到的，其主要用于生物顆粒的富集和分離，因此，也可以稱(chēng)為用于生物顆粒富集的液體介質(zhì)。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，優(yōu)選地，上述液體介質(zhì)的pH值為5.0-7.5，優(yōu)選為
6.1-7.5。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案,優(yōu)選地,上述液體介質(zhì)的滲透壓為270_335m0sm/kg ；更優(yōu)選地，該液體介質(zhì)的滲透壓為280-320m0sm/kg。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，優(yōu)選地，上述液體介質(zhì)的密度為1.070-1.085g/mL ；更優(yōu)選地，該液體介質(zhì)的密度為1.077-1.083g/mL。
[0024]對(duì)于本發(fā)明所提供的液體介質(zhì)，通過(guò)在本發(fā)明所提供的范圍內(nèi)調(diào)整其成分組成可以使其具有不同的滲透壓、密度等，以適應(yīng)不同的生物樣本以及需要分離的目的細(xì)胞。
[0025]羥乙基淀粉是一種臨床最常用的血漿代用品，俗稱(chēng)706代血漿，是治療和預(yù)防低血容量的首選藥物，其結(jié)構(gòu)通式如下:
[0026]
【權(quán)利要求】
1.一種用于處理生物樣本的組合物，其由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、PH值調(diào)節(jié)劑組成，其質(zhì)量比為2.0-12.0:2.5-12.0:0-0.4:0-0.5 ;優(yōu)選為 3.5-12.0:3.5-12.0:0-0.3:0-0.4 ;更優(yōu)選為 5.0-12.0:5.0-11.0:O-0.25:0_0.4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉為分子量在130kD以上的藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉；優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0.5和/或羥乙基淀粉130/0.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑為醋碘苯酸鈉、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸鈉中的一種或幾種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的組合物，其中，所述pH值調(diào)節(jié)劑為無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸、多元酸的酸式鹽和緩沖對(duì)中的一種或幾種的組合。
6.一種用于處理生物樣本的液體介質(zhì)，以重量百分比計(jì)，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉2.0-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑2.5-12.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%、pH值調(diào)節(jié)劑0-0.5wt%和余量水組成；優(yōu)選地，以重量百分比計(jì)，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉3.5-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑3.5-12.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.3wt%> pH值調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%和余量水組成；更優(yōu)選地，該液體介質(zhì)由藥學(xué)上可接受的輕乙基淀粉5.0-12.0wt%、藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑5.0-11.0wt%、滲透壓調(diào)節(jié)劑0-0.25wt%、pH值調(diào)節(jié)劑0-0.4wt%和余量水組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的液體介質(zhì)，其中，該液體介質(zhì)的pH值為5.0-7.5，優(yōu)選為6.1-7.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的液體介質(zhì)，其中，該液體介質(zhì)的滲透壓為270-335m0sm/kg ;優(yōu)選地，該液體介質(zhì)的滲透壓為280-320m0sm/kg。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的液體介質(zhì)，其中，該液體介質(zhì)的密度為1.070-1.085g/mL ;優(yōu)選地，該液體介質(zhì)的密度為1.077-1.083g/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，該液體介質(zhì)為無(wú)菌的，并且，內(nèi)毒素含量< 0.5EU/mL。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，所述藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉為分子量在130kD以上的藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉；優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的羥乙基淀粉為羥乙基淀粉200/0.5和/或羥乙基淀粉130/0.4。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，所述藥學(xué)上可接受的離子型碘對(duì)比劑包括醋碘苯酸鈉、甲泛葡胺、泛影葡胺和泛影酸鈉中的一種或幾種的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求6-12任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽；優(yōu)選地，所述無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽包括無(wú)機(jī)酸鹽和/或有機(jī)酸鹽，其中，所述無(wú)機(jī)酸鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽和磷酸氫鹽中的一種或幾種的組合，所述有機(jī)酸鹽包括乙酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、D-乳酸鹽、L-乳酸鹽、D-酒石酸鹽、L-酒石酸鹽、丙二酸鹽、煙酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、檸檬酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、葡糖酸鹽、琥珀酸鹽和苯甲酸鹽中的一種或幾種的組合；更優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑包括鹽酸鹽、磷酸氫鹽、乙二胺四乙酸鹽和碳酸鹽中一種或幾種的組合；更優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑包括氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉和碳酸氫鉀中的一種或幾種的組合。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，所述pH值調(diào)節(jié)劑為無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸、多元酸的酸式鹽和緩沖對(duì)中的一種或幾種的組合；優(yōu)選地，所述無(wú)毒的藥學(xué)上可接受的酸包括無(wú)機(jī)酸和/或有機(jī)酸，所述無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、硫酸、硝酸和磷酸中的一種或幾種的組合，所述有機(jī)酸包括甲酸、乙酸、富馬酸、馬來(lái)酸、苯磺酸、D-乳酸、L-乳酸、D-酒石酸、L-酒石酸、丙二酸、煙酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、乙二胺四乙酸、葡糖酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸中的一種或幾種的組合，所述多元酸的酸式鹽包括硫酸氫鹽、碳酸氫鹽和磷酸氫鹽中的一種或幾種的組合，所述緩沖對(duì)包括甘氨酸-鹽酸、鄰苯二甲酸-鹽酸、磷酸二氫鈉-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉、乙酸-乙酸鈉、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀-氫氧化鈉、巴比妥鈉-鹽酸、Tri S-鹽酸、Tricine-氫氧化鈉、硼酸-硼砂、甘氨酸-氫氧化鈉和碳酸鈉-碳酸氫鈉中的一種或幾種的組合；更優(yōu)選地，所述PH值調(diào)節(jié)劑為鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、Tris-鹽酸緩沖對(duì)、鹽酸-甘氨酸緩沖對(duì)、乙酸、乙酸-乙酸鈉緩沖對(duì)、乙二胺四乙酸、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖對(duì)、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖對(duì)和Tricine-氫氧化鈉緩沖對(duì)中的一種或幾種的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求6-14任一項(xiàng)所述的液體介質(zhì)，其中，以重量百分比計(jì)，該液體介質(zhì)具有以下組成和參數(shù): 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉130/0.4,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的摩爾比為1:1的乙酸-乙酸鈉緩沖對(duì)，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉130/0.4,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5w`t%的摩爾比為1:1的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖對(duì)，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的摩爾比為1:1的乙酸-乙酸鈉緩沖對(duì),余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的HC1，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL,滲透壓為280-320m0sm/kg, pH 值為 6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈣、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL,滲透壓為 280-320m0sm/kg，pH 值為 6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.3wt%的氯化鈣、0-0.5wt%的摩爾比為1:1的鹽酸-甘氨酸緩沖對(duì)，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.3wt%的氯化鈣、0-0.5wt%的乙二胺四乙酸二鈉，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為 280-320m0sm/kg，pH 值為 6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的摩爾比為1:1的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖對(duì)，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.077g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的摩爾比為1:1的乙酸-乙酸鈉緩沖對(duì),余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.083g/mL，滲透壓為280-320m0sm/kg，pH值為6.1-7.5 ;或者， 該液體介質(zhì)的組成為:2.0-12.0wt%的羥乙基淀粉200/0.5,2.5-12.0wt%的泛影酸鈉、0-0.4wt%的氯化鈉、0-0.5wt%的磷酸二氫鉀，余量水；該液體介質(zhì)的密度為1.083g/mL，滲透壓為 280-320m0sm/kg, pH 值為 6.1-7.5。
16.權(quán)利要求6-15任一項(xiàng)所述的用于處理生物樣本的液體介質(zhì)在生物顆粒富集中的應(yīng)用；優(yōu)選地，上述應(yīng)用是采用所述液體介質(zhì)按照以下步驟進(jìn)行生物顆粒的富集: (1)用平衡鹽溶液或生理鹽水對(duì)生物樣本進(jìn)行預(yù)稀釋?zhuān)? (2)將稀釋后的生物樣本加入預(yù)裝有所述液體介質(zhì)的離心容器中，保持生物樣本與液體介質(zhì)的界面清晰，不發(fā)生混合； (3)在0°C-25° C下，使用400-800g離心力進(jìn)行15-30分鐘的離心處理； (4)取出裝有經(jīng)過(guò)離心處理的生物樣品的離心容器，利用巴斯德吸管或移液管吸取富集在生物樣本和液體介質(zhì)層交界面處的白膜層； (5)用平衡鹽溶液、生理鹽水或細(xì)胞培養(yǎng)基在200-400g的離心力下對(duì)白膜層進(jìn)行洗滌完成生物顆粒的富集，離心時(shí)間為5-10分鐘。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其中，所述生物樣本為血液樣本或組織樣本；優(yōu)選地，所述血液樣本為外周血、臍帶血或經(jīng)血，所述組織樣本為骨髓；更優(yōu)選地，所述血液樣本是經(jīng)過(guò)EDTA K2、檸檬酸鈉或肝素抗凝處理過(guò)的抗凝血液樣本。
【文檔編號(hào)】C12N5/078GK103667174SQ201210330832
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月7日
【發(fā)明者】王春有, 王冬明, 劉湘連, 甘朝 申請(qǐng)人:北京東方華輝生物醫(yī)藥科技有限公司