一種制備成熟紅細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，所述方法包括利用單個核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)制備成熟紅細(xì)胞的步驟，優(yōu)選地，所述單個核細(xì)胞來自臍血或外周血的白膜層。本發(fā)明還涉及利用所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞，以及單個核細(xì)胞用于制備成熟紅細(xì)胞的用途。本發(fā)明的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：原材料易得，可利用血液濾白后剩余的部分；節(jié)約成本，省卻了純化CD34+細(xì)胞的步驟。
【專利說明】一種制備成熟紅細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，具體地說，本發(fā)明涉及利用單個核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)制備成熟紅細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及利用所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞，以及單個核細(xì)胞用于制備成熟紅細(xì)胞的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]在過去的一個世紀(jì)中，同種異體輸血已經(jīng)成為治療嚴(yán)重缺血患者(例如，急性貧血、嚴(yán)重的血小板減少癥、血友病)的救命手段，但是，同種異體輸血導(dǎo)致疾病傳播(例如，肝炎、AIDS、梅毒、瘧疾以及其他血源性疾病)的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。今天，在北美、西歐等發(fā)達(dá)國家以及某些發(fā)展中國家，同種異體輸血一般都是安全的，這是因?yàn)楝F(xiàn)在已經(jīng)使用了高敏感性的檢測方法如核酸擴(kuò)增技術(shù)來篩查AIDS和其他感染性疾病。在美國，單次輸血感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)大約為1/1，000, 000(McCullough, J.在無病原血液供應(yīng)方面取得的進(jìn)步(Progresstoward a pathogen-free blood supply)。Clinical Infec.Dis.2003;37:88 - 95)? 但是，通過輸血發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)依然是存在的，因?yàn)槲⑸锔腥径加幸粋€窗口期，在這個時期內(nèi)，檢測結(jié)果是陰性的。對于那些新出現(xiàn)的病原體來說(例如，各種克雅病、西尼羅河病毒、A5N1和其他禽流感病毒)，目前還未納入檢測范圍。在第三世界國家，血源性傳播疾病普遍流行，這是由于供者血液篩選不嚴(yán)格、存在賣血現(xiàn)象以及依賴家庭供者獻(xiàn)血等造成的。在2008年，全球共采集了 93，000, 000個單位的血液，其中約有50%的血液是由發(fā)展中國家采集的，但是有42個國家無法對所有的血液進(jìn)行四種輸血感染微生物(HIV、乙型肝炎、丙型肝炎和梅毒)中的一種或多種的篩查，在發(fā)展中國家，只有47%的血液是在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控條件下進(jìn)行檢測的(World Health Organization.(2010).全球血液安全性與可用性一關(guān)鍵事實(shí)和數(shù)據(jù)(Global blood safety and availability—key facts and figures), 2010)。
[0003]除了疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)以外，同種異體供者血液在世界范圍內(nèi)都處于短缺狀態(tài)，并且這種短缺將長期存在。由于我國人口老齡化問題越來越突出，適于獻(xiàn)血的人群所占比例也在不斷下降，導(dǎo)致血源供應(yīng)緊張。另外，供者紅細(xì)胞只能儲存約5周的時間，在有大量傷員(如自然災(zāi)害，戰(zhàn)爭)需要輸血的情`況下，供應(yīng)短缺的問題將更加緊迫。再者，同種異體輸血需要供者和受體具有相匹配的抗原/抗體狀態(tài)，這也會導(dǎo)致血液供應(yīng)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)性短缺。
[0004]因此，目前輸血醫(yī)學(xué)依然面臨著很多問題，其中就包括血液供需矛盾突出、輸血感染依然存在、臨床輸血反應(yīng)時有發(fā)生以及稀有血型患者難以及時得到合適的血液等。這也使得從事輸血醫(yī)學(xué)研究的人一直在思考和研究如何能夠獲得更安全、更加標(biāo)準(zhǔn)化的血液制品，其中利用干細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)成熟的有功能的紅細(xì)胞就是大家一直努力的目標(biāo)，這些紅細(xì)胞可被稱為體外培養(yǎng)的紅細(xì)胞(cultured red blood cells, cRBC)。
[0005]從目前的研究現(xiàn)狀來看，體外培養(yǎng)擴(kuò)增紅細(xì)胞主要利用的是造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSCs)和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCsX
[0006]在體外利用造血干細(xì)胞生產(chǎn)成熟紅細(xì)胞的方法大致包括如下步驟:首先利用細(xì)胞因子如ΕΡ0、SCF、IL-3等刺激造血干細(xì)胞的擴(kuò)增并誘導(dǎo)其向紅系分化，然后單獨(dú)用EPO刺激使其進(jìn)一步擴(kuò)增，最后通過基質(zhì)細(xì)胞的支持使細(xì)胞去核形成成熟的紅細(xì)胞。利用這種方法已經(jīng)成功地培養(yǎng)出了成熟的有功能的紅細(xì)胞，其中比較成功的例子是利用造血干細(xì)胞(臍血、外周或骨髓來源的⑶34+細(xì)胞)通過添加EPO、SCF、IL-3、羥皮質(zhì)激素的無血清培養(yǎng)和基質(zhì)細(xì)胞(小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞或人間充質(zhì)干細(xì)胞)支持培養(yǎng)來獲得紅細(xì)胞，利用這種方法可以使臍血來源的造血干細(xì)胞擴(kuò)增(2-6) X IO6倍，并且所獲得的細(xì)胞中90%以上的都是去核的成熟紅細(xì)胞，這些細(xì)胞具有正常的變形能力和功能正常的血紅蛋白(GiarratanaMC, Kobari L, Lapillonne H等人,利用造血干細(xì)胞體外制備完全成熟的人紅細(xì)胞(Ex vivogeneration of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells)Nat.Biotechnol,2005, 23(I):69_74)。
[0007]但是用基質(zhì)細(xì)胞支持培養(yǎng)顯然難以在體外大規(guī)模生產(chǎn)紅細(xì)胞，以達(dá)到臨床應(yīng)用的水平，因此建立完全懸浮的液體培養(yǎng)體系來擴(kuò)增成熟的紅細(xì)胞是按照GMP標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)紅細(xì)胞的必然要求。Miharada等建立了一種四步液體培養(yǎng)方法從臍血⑶34+細(xì)胞中擴(kuò)增成熟紅細(xì)胞，在這四個步驟中分別添加不同的細(xì)胞因子，但是不用任何滋養(yǎng)層細(xì)胞，結(jié)果使細(xì)胞的總擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到6X105，其中GPA+細(xì)胞(代表晚幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞)占93.6 %,去核的紅細(xì)胞占50.0% (Miharada K, Hiroyama T, SudoK等，造血干祖細(xì)胞經(jīng)過體外分化形成的幼紅細(xì)胞的有效脫核(Efficient enucleation oferythroblasts differentiated in vitro from hematopoietic stem and progenitorcells), Nat Biotechnol, 2006，24:1255-1256)。另外一個試驗(yàn)小組利用 SCF、ΕΡ0、IGF-1和類固醇激素刺激，也從外周動員(G-CSF刺激從外周血中分離)的CD34+細(xì)胞中擴(kuò)增出了去核的紅細(xì)胞，但是這種方法只能使細(xì)胞擴(kuò)增幾十倍，并且其中去核的紅細(xì)胞只占細(xì)胞總數(shù)的 48.8% (Dorn I, Lazar-Karsten P, Boie S，Ribbat J 等，利用兩種不同的細(xì)胞培養(yǎng)體系將外周血來源的人CD34+細(xì)胞在體外增殖和分化成成熟紅細(xì)胞(Invitro proliferation and differentiation of human CD34+cells from peripheralblood into muture red blood cells with two different cell culture systems),Transfusion, 2008,48:1122-1132.)。從這些結(jié)果來看，目前所建立的液體培養(yǎng)體系無論是從細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)還是成熟紅細(xì)胞所占比例都還無法達(dá)到支持培養(yǎng)體系的擴(kuò)增效果。
[0008]到目前為止，人們利用了多種干細(xì)胞或祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，試圖能夠大規(guī)模地生產(chǎn)紅細(xì)胞，其中包括臍血、骨髓來源的和外周動員的CD34+細(xì)胞以及人胚胎干細(xì)胞，但是人們較少關(guān)注外周血來源的造血干/祖細(xì)胞，因?yàn)槿藗冋J(rèn)為外周血來源的造血干/祖細(xì)胞增殖能力較弱，并且其中所含的⑶34+細(xì)胞比例較低。然而，Boehm D等人研究發(fā)現(xiàn)，外周血來源的CD34+細(xì)胞在無基質(zhì)細(xì)胞支持的培養(yǎng)體系中可以擴(kuò)增1.5X IO6倍，與臍血來源的CD34+細(xì)胞所達(dá)到的擴(kuò)增效果相似。這說明外周血來源的CD34+細(xì)胞的增殖能力也是很強(qiáng)的(Boehm D，Murphy WG和Al-Rubeai M，人外周血來源的CD34+細(xì)胞用于體外生產(chǎn)紅細(xì)胞的潛倉泛(The potential of human peripheral blood derived CD34+cells for ex vivored blood cell production),J Biotechnol.2009;144(2):127-134)。
[0009]由于外周血單個核細(xì)胞中⑶34+細(xì)胞的含量確實(shí)很低，約為0.1%，并且從中分離CD34+細(xì)胞作為生產(chǎn)紅細(xì)胞的起始材料，不僅費(fèi)事費(fèi)力，而且會額外增加許多成本，因此亟需一種原材料來源豐富且制備方法簡便的紅細(xì)胞生產(chǎn)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)摸索，終于找到一種利用單個核細(xì)胞作為起始材料直接制備紅細(xì)胞的方法，這樣既可以利用血液處理時剩余的部分作為原材料，又可以省去分離⑶34+細(xì)胞的步驟。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)而完成。
[0011]本發(fā)明第一方面涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，所述方法包括利用單個核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)制備成熟紅細(xì)胞的步驟。
[0012]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述單個核細(xì)胞來自臍血或外周血；可以利用臍血或外周血的全血直接分離得到單個核細(xì)胞，也可以從臍血或外周血中分離出白膜層后再從白膜層制備得到單個核細(xì)胞。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自臍血全血；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自外周血的白膜層。
[0013]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述單個核細(xì)胞是根據(jù)血液中細(xì)胞的密度不同分離得到的。
[0014]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞經(jīng)過紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基和紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基的培養(yǎng)得到成熟紅細(xì)胞。
[0015]本發(fā)明第二方面涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其包括以下步驟:
[0016]a)取臍血或外周血，分離得到單個核細(xì)胞；
[0017]b)將步驟a)得到的單個核細(xì)胞接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3和紅細(xì)胞生成素，培養(yǎng)8-11天；優(yōu)選地，每3-5天(例如4天)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的上述培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
`[0018]c)收集步驟b)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加紅細(xì)胞生成素，繼續(xù)培養(yǎng)3-5天；
[0019]d)收集步驟c)中的細(xì)胞，用紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，即得到成熟紅細(xì)胞；優(yōu)選地，每3-5天(例如4天)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0020]根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中步驟a)中的單個核細(xì)胞可以利用臍血或外周血的全血直接分離得到，也可以從臍血或外周血中分離出白膜層后再從白膜層制備得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自臍血全血；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自外周血的白膜層。
[0021]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述單個核細(xì)胞是根據(jù)血液中細(xì)胞的密度不同分離得到的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述細(xì)胞因子的使用濃度為干細(xì)胞因子20-200ng/ml、白細(xì)胞介素3為5_20ng/mL和/或紅細(xì)胞生成素2-lOIU/mL。
[0022]根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中羥皮質(zhì)激素的使用濃度為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)時的常用濃度，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，羥皮質(zhì)激素的使用濃度為10_6m。
[0023]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞因子的濃度為50_200ng/ml，例如為50、100、200ng/ml ;所述白細(xì)胞介素3的濃度為5_20ng/mL，例如為5、10、20ng/ml ;所述紅細(xì)胞生成素的濃度為3-10IU/mL，例如為3、5、10IU/mL。
[0024]本發(fā)明第三方面涉及一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其包括以下步驟:
[0025]a)取臍血或外周血，分離得到單個核細(xì)胞；
[0026]b)將步驟a)得到的單個核細(xì)胞接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和FMS樣酪氨酸激酶3配基，培養(yǎng)5~9天(例如7天)；優(yōu)選地，每3-5天(例如4天)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0027]c)收集步驟b)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和胰島素樣生長因子1，繼續(xù)培養(yǎng)5~9天(例如7天)；優(yōu)選地，每2-3天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，使細(xì)胞濃度保持在I X 106/ml以下；
[0028]d)收集步驟c)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加紅細(xì)胞生成素，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天；
[0029]e)收集步驟d)中的細(xì)胞，用紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，即得到成熟紅細(xì)胞；優(yōu)選地，每3-5天(例如4天)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中步驟a)中的單個核細(xì)胞可以利用臍血或外周血的全血直接分離得到，也可以從臍血或外周血中分離出白膜層后再從白膜層制備得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自臍血全血；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自外周血的白膜層。
[0031]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述單個核細(xì)胞是根據(jù)血液中細(xì)胞的密度不同分離得到的。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中所述細(xì)胞因子的使用濃度為干細(xì)胞因子20-200ng/ml、白細(xì)胞介素3為5_20ng/mL和/或紅細(xì)胞生成素2-lOIU/mL。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述干細(xì)胞因子的濃度為50-200ng/ml，例如為50、100、200ng/ml ;所述白細(xì)胞介素3的濃度為5-20ng/mL，例如為5、10、20ng/ml ;所述紅細(xì)胞生成素的濃度為3-10IU/mL，例如為 3、5、10IU/mL。
[0033]根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中步驟b)所述細(xì)胞因子的使用濃度為:2_20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白細(xì)胞介素11和/或20-100ng/mL Flt3配基。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述骨形成蛋白4的濃度為5-20ng/ml,例如為5、10、20ng/ml ;所述白細(xì)胞介素11的濃度為5-20ng/mL，例如為5、10、20ng/ml ;所述Flt3配基的濃度為20_100ng/ml，例如為 20、40、100ng/ml。
[0034]根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中步驟c)所述細(xì)胞因子的使用濃度為:5_20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白細(xì)胞介素11和/或20_200ng/mL胰島素樣生長因子I。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述骨形成蛋白4的濃度為5-20ng/ml,例如為5、10、20ng/ml ;所述白細(xì)胞介素11的濃度為5-20ng/mL,例如為5、10、20ng/ml ;所述胰島素樣生長因子I的濃度為 20-200ng/mL，例如為 20、40、100、200ng/ml。
[0035]根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中羥皮質(zhì)激素的使用濃度為細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)時的常用濃度，在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，羥皮質(zhì)激素的使用濃度為10_6m。
[0036]本發(fā)明第四方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一至第三方面任一項(xiàng)所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞。
[0037]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述成熟紅細(xì)胞的平均細(xì)胞體積(MCV)為108~123fl ；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述成熟紅細(xì)胞的平均血紅蛋白含量(MCH)為31~37pg ;在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述成熟紅細(xì)胞的最大變形指數(shù)(DImax)為0.42~0.48 ;在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述成熟紅細(xì)胞的葡萄糖6磷酸脫氫酶的含量為31~36U/g Hb ;在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述成熟紅細(xì)胞的丙酮酸激酶含量為69~80U/gHb。
[0038]本發(fā)明第五方面涉及血液中的單個核細(xì)胞在制備成熟紅細(xì)胞中的用途。
[0039]根據(jù)本發(fā)明第五方面的用途，其中的單個核細(xì)胞可以利用臍血或外周血的全血直接分離得到，也可以從臍血或外周血中分離出白膜層后再從白膜層制備得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自臍血全血；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自外周血的白膜層。
[0040]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞是根據(jù)血液中細(xì)胞的密度不同分離提到的。
[0041]本發(fā)明第六方面涉及細(xì)胞因子組合物，其包含羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3和紅細(xì)胞生成素；優(yōu)選地，其還包含骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和FMS樣酪氨酸激酶3配基，或者優(yōu)選地，其還包含骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和胰島素樣生長因子I。
[0042]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子組合物由羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3和紅細(xì)胞生成素組成；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子組合物由羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和FMS樣酪氨酸激酶3配基組成；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子組合物由羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和胰島素樣生長因子I組成。
[0043]本發(fā)明還涉及本發(fā)明第六方面任一項(xiàng)的細(xì)胞因子組合物在由單個核細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞中的用途。
[0044]以下對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
[0045]術(shù)語“單個核細(xì)胞”在本文中是指血液中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，也包括造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞?？梢杂帽绢I(lǐng)域常用的方法制備單個核細(xì)胞，例如，可通過紅細(xì)胞裂解液(由790mg/L的碳酸氫`銨和7.7g/L的氯化銨混合而成)裂解紅細(xì)胞以分離單個核細(xì)胞。在本發(fā)明中，單個核細(xì)胞是根據(jù)血液中細(xì)胞的密度不同分離得到的。其可以利用臍血或外周血的全血直接分離得到，也可以從臍血或外周血中分離出白膜層后再從白膜層制備得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自臍血全血；在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述單個核細(xì)胞來自外周血的白膜層。通過分離白膜層，可分離出濃縮紅細(xì)胞和血衆(zhòng)以用于成分輸血。
[0046]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，分離方法是Ficoll-hypaque (葡聚糖一泛影葡胺)密度梯度離心法，因?yàn)檠褐懈饔行纬煞值谋戎卮嬖诓町?，因此得以分離。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀(buffy coat)，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌離心重懸可獲得單個核細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，取外周血白膜層細(xì)胞或臍血全血用磷酸鹽緩沖液稀釋，然后用淋巴細(xì)胞分離液分離，吸取單個核細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞，即得到單個核細(xì)胞。
[0047]術(shù)語“造血干細(xì)胞”是指造血干細(xì)胞是指骨髓中的干細(xì)胞，具有自我更新能力并能分化為各種血細(xì)胞前體細(xì)胞，最終生成各種血細(xì)胞成分，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，它們也可以分化成各種其他細(xì)胞。造血干細(xì)胞有兩個重要特征:其一，高度的自我更新或自我復(fù)制能力；其二，可分化成所有類型的血細(xì)胞。[0048]術(shù)語“祖細(xì)胞”是指在一定的微環(huán)境和某些因素的調(diào)節(jié)下，增殖分化為各類血細(xì)胞的祖細(xì)胞，也稱為造血祖細(xì)胞(hematopoietic progenitor cells, HPCs),它也是一種相當(dāng)原始的具有增殖能力的細(xì)胞，但已失去多向分化能力，只能向一個或幾個血細(xì)胞系定向增殖分化，故也稱定向干細(xì)胞(committed stem cell)。例如包括紅細(xì)胞系造血祖細(xì)胞、中性粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系造血祖細(xì)胞或巨核細(xì)胞系造血祖細(xì)胞。
[0049]術(shù)語“白膜層”在本文中是指抗凝血經(jīng)過自然沉降、離心或密度梯度離心后形成的一個組分，主要由白細(xì)胞和血小板組成?？鼓?jīng)過離心以后會形成上層的血漿、下層的紅細(xì)胞以及二者之間薄薄的一層白色膜狀物，約占血液總體積的1%，被稱為白膜層。
[0050]術(shù)語“臍血”在本文中是指胎兒出生后留在胎盤和臍帶中的血液，其中富含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。
[0051]術(shù)語“成熟紅細(xì)胞”在本文中是指血液中數(shù)量最多的一種血細(xì)胞，同時也是脊椎動物體內(nèi)通過血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介，同時還具有免疫功能。成熟的紅細(xì)胞是無核的，這意味著它們失去了 DNA。紅細(xì)胞也沒有線粒體，它們通過葡萄糖合成能量。
[0052]術(shù)語“干細(xì)胞因子”在本文中是指原癌基因c-kit表達(dá)產(chǎn)物的配體，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，體內(nèi)存在分泌型和跨膜型兩種形式。有活性的干細(xì)胞因子為同源二聚體，可刺激干細(xì)胞分化為不同譜系血細(xì)胞，并刺激肥大細(xì)胞增殖。
[0053]術(shù)語“白細(xì)胞介素3”在本文中是指由活化的⑶4+T細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，其主要作用為促進(jìn)骨髓中多能造血干細(xì)胞的定向分化與增殖，產(chǎn)生各種類型的血細(xì)胞。
[0054]術(shù)語“紅細(xì)胞生成素”在本文中是指由骨髓中紅細(xì)胞前體細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子。在人體環(huán)境中，它由肝臟和腎產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成數(shù)量的最重要細(xì)胞因子，它可以阻止紅系祖細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)其進(jìn)行有絲分裂，因此可以加速紅系祖細(xì)胞的增殖，大大提高紅細(xì)胞的生成數(shù)量。
[0055]術(shù)語“淋巴細(xì)胞分離液”可為本領(lǐng)域公知的淋巴細(xì)胞分離液，例如可以是HIST0PAQUE-1077 (Sigma公司)。在本領(lǐng)域中，淋巴細(xì)胞分離液的成分是一致的，如在本發(fā)明的實(shí)施方案中是指由葡聚糖和泛影葡胺組成的混合物，是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進(jìn)行細(xì)胞的分離純化的常用試劑，其密度為1.13。
[0056]術(shù)語“紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基”是指有利于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖和向紅細(xì)胞分化的培養(yǎng)基，其可按照本領(lǐng)域的常規(guī)配方和方法制備。在本文中是指由無血清培養(yǎng)基、胎牛血清和各種小分子組成的用于培養(yǎng)紅細(xì)胞的一種培養(yǎng)基。其中無血清培養(yǎng)基為適合造血細(xì)胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，例如可以為StemSpan SFEMCStemcell Technologies Inc.)、LONZAX-VIVO 15 (Lonza)或 8--η?Ρ Ο:^)-34 SFM (Life Technologies)。其中的小分子例如可包括生育酚、亞油酸、膽固醇、離子飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組人胰島素、乙醇胺、二巰基乙醇、肝素鈉、檸檬酸亞鐵、維生素C、谷氨酰胺，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述小分子包括生育酚、亞油酸、膽固醇、離子飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組人胰島素、乙醇胺、二巰基乙醇。
[0057]術(shù)語“紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基”是指有利于晚期幼紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞分化并完成脫核過程的培養(yǎng)基，其可按照本領(lǐng)域的常規(guī)配方和方法制備。在本文中是指由IMDM、胎牛血清和各種小分子組成的用于培養(yǎng)紅細(xì)胞的一種培養(yǎng)基。其中的MDM可用本領(lǐng)域其它常用培養(yǎng)基替代，例如alpha-MEM或DMEM，其中的小分子例如可包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氫二鈉、米非司酮、硫代甘油、Pluronic F68 (Sigma公司)、肝素鈉,在本發(fā)明的實(shí)施方案中,所述小分子包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氫二鈉和米非司酮。
[0058]在本發(fā)明中，“濃度”或“使用濃度”通常是指該細(xì)胞因子的終濃度。
[0059]在本發(fā)明中，各階段細(xì)胞培養(yǎng)的密度通常應(yīng)維持在IXlO6Ail以下，以保證細(xì)胞的正常生長。
[0060]在本發(fā)明中，制備得到的成熟紅細(xì)胞可進(jìn)行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能鑒定，例如包括細(xì)胞離心涂片染色，熒光抗體染色流式細(xì)胞儀分析、血紅蛋白含量測定、葡萄糖6磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶含量測定等。
[0061]發(fā)明的有益效果
[0062]本發(fā)明直接利用血液中的單個核細(xì)胞制備得到成熟紅細(xì)胞，該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):1)可利用血液處理后的剩余部分作為單個核細(xì)胞的來源，充分利用了廢棄物；2)省去了純化CD34+細(xì)胞的步驟，不僅可以節(jié)約成本，而且可以避免因純化而導(dǎo)致的CD34+細(xì)胞丟失；3)紅細(xì)胞的得率較高，按照初始單個核細(xì)胞數(shù)計(jì)算，得到的成熟紅細(xì)胞數(shù)增加約1000倍左右，由于外周血單個核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞的含量很低(約0.1%)，因此相當(dāng)于擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到了 IO60
【專利附圖】

【附圖說明】
[0063]圖1為外周血單個核細(xì)胞生產(chǎn)紅細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線；
[0064]圖2為外周血單個核細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的活細(xì)胞形態(tài)(400 X )；
[0065]圖3為不同培養(yǎng)天數(shù)時細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和去核過程(1000X Wrights-Giemsa染色)；
[0066]圖4為紅系細(xì)胞的不同發(fā)育階段(Pro-E:原幼紅細(xì)胞；Baso-E:嗜堿性幼紅細(xì)胞；Poly-E:多染幼紅細(xì)胞；0rtho_E:正染幼紅細(xì)胞；Enucleated:去核紅細(xì)胞)；
[0067]圖5為不同天數(shù)的培養(yǎng)物中處于各個發(fā)育階段的紅系細(xì)胞所占的比例；
[0068]圖6為FACS分析細(xì)胞的分化及去核過程；其中A為不同培養(yǎng)天數(shù)的細(xì)胞中紅系細(xì)胞的比例變化(ant1-glycophorin A抗體陽性)；B為細(xì)胞去核階段去核細(xì)胞的比例變化(ant1-glycophorin A 抗體陽性且 Syto dye 16 陰性);
[0069]圖7為細(xì)胞培養(yǎng)過程中集落形成細(xì)胞所占比例的變化；
[0070]圖8為外周血單個核細(xì)胞增殖分化過程中的紅系祖細(xì)胞增殖曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0071]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0072]實(shí)施例1:紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基的配制
[0073]配制IOOmL紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基需要如下成分:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，所述方法包括利用單個核細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)制備成熟紅細(xì)胞的步驟。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述單個核細(xì)胞來自臍血或外周血；優(yōu)選地，所述單個核細(xì)胞來自臍血或外周血的白膜層。
3.一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其包括以下步驟: a)取臍血或外周血，分離得到單個核細(xì)胞； b)將步驟a)得到的單個核細(xì)胞接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3和紅細(xì)胞生成素，培養(yǎng)8-11天； c)收集步驟b)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加紅細(xì)胞生成素，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 天； d)收集步驟c)中的細(xì)胞，用紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，即得到成熟紅細(xì)胞。
4.一種制備成熟紅細(xì)胞的方法，其包括以下步驟: a)取臍血或外周血，分離得到單個核細(xì)胞； b)將步驟a)得到的單個核細(xì)胞接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和FMS樣酪氨酸激酶3配基，培養(yǎng)5~9天； c)收集步驟b)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3、紅細(xì)胞生成素、骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和胰島素樣生長因子1，繼續(xù)培養(yǎng)5~9天； d)收集步驟c)中的細(xì)胞，接種到紅細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，添加紅細(xì)胞生成素，繼續(xù)培養(yǎng)3~5天； e)收集步驟d)中的細(xì)胞，用紅細(xì)胞脫核培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，即得到成熟紅細(xì)胞。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中步驟a)中是從臍血或外周血的白膜層分離得到單個核細(xì)胞。
6.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述干細(xì)胞因子的使用濃度為20-200ng/ml、白細(xì)胞介素3的使用濃度為5-20ng/mL和/或紅細(xì)胞生成素的使用濃度為2_10IU/mL。
7.權(quán)利要求4的方法，其中步驟b)所述骨形成蛋白4的使用濃度為2-20ng/mL、白細(xì)胞介素11的使用濃度為5-20ng/mL和/或Flt3配基的使用濃度為20_100ng/mL。
8.權(quán)利要求4的方法，其中步驟c)所述骨形成蛋白4的使用濃度為5-20ng/mL、白細(xì)胞介素11的使用濃度為5-20ng/mL和/或胰島素樣生長因子I的使用濃度為20_200ng/mLo
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法制備得到的成熟紅細(xì)胞。
10.血液中的單個核細(xì)胞在制備成熟紅細(xì)胞中的用途。
11.細(xì)胞因子組合物，其包含羥皮質(zhì)激素、干細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素3和紅細(xì)胞生成素；優(yōu)選地，其還包含骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和FMS樣酪氨酸激酶3配基，或者優(yōu)選地，其還包含骨形成蛋白4、白細(xì)胞介素11和胰島素樣生長因子I。
12.權(quán)利要求11的細(xì)胞因子組合物在由單個核細(xì)胞制備成熟紅細(xì)胞中的用途。
【文檔編號】C12N5/078GK103667188SQ201210355560
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】賈延軍, 張志欣 申請人:北京市紅十字血液中心