專利名稱：與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，特別涉及兩個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis) —年蔓生的草本植物，原產(chǎn)溫暖濕潤的喜馬拉雅山南麓的印度北部地區(qū)，傳入我國栽培已有2000多年的歷史，我國是黃瓜的次生起源中心。黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一。果實是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，黃瓜果實屬于瓠果，由子房和花托共同發(fā)育 而成。在黃瓜果實上有一個重要的性狀是果瘤,果瘤是黃瓜果實表面的瘤狀突起。果瘤基因的研究始于1913年,有果瘤是黃瓜的野生性狀,果瘤性狀是由Tu (Tuberculate fruit)基因調(diào)控，有果瘤(Tu)為顯性，無果瘤(tu)為隱性。2009年張微微等利用247個&群體將果瘤基因初步定位于第五染色體SSR標(biāo)記16203和SCAR標(biāo)記C_SC933之間，遺傳距離分別為
I.4cM和 5. 9cM,詳細(xì)結(jié)果可以參看；Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics))(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2009年第120卷第3期645-654頁發(fā)表的題為《Identificationand mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in thecucumber (Cucumis sativus L.)》(黃瓜果瘤基因緊密連鎖分子標(biāo)記初步定位)一文,上述標(biāo)記還存在分析群體相對較小，連鎖距離相對較遠(yuǎn)等問題。黃瓜育種中發(fā)現(xiàn)黃瓜果實均有刺，但是有些品種果實上沒有果瘤，刺和瘤是兩個不同的性狀，刺的形成是由Gl基因決定的，而Tu基因決定瘤的形成，雖然刺和瘤性狀是由不同的基因決定的，但有研究表明刺對于瘤具有隱性上位作用，曹辰興分離群體的遺傳分析結(jié)果表明控制莖、葉、果實表皮毛性狀的無毛基因?qū)刂乒鲂誀畹墓龌虼嬖陔[性上位作用(曹辰興等.黃瓜莖葉無毛性狀與果實瘤刺性狀的遺傳關(guān)系.園藝學(xué)報，2001，28(6) :565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究將有助于揭示黃瓜果刺基因形成的分子機制，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)水平的不斷發(fā)展，克隆目的基因的方法也層出不窮，圖位克隆方法利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因定位到染色體的一個具體位置的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因。SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高和廣泛適用的優(yōu)點，找到與果瘤基因Tu緊密連鎖的標(biāo)記，可為下一步圖位克隆這個基因打下堅實的基礎(chǔ)。隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種已提到重要位置。黃瓜果實刺瘤性狀屬于感觀品質(zhì)范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無果瘤、少刺的果皮，稱其為水果黃瓜，其市場價格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測表明無瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。黃瓜果瘤基因Tu控制果瘤的形成，它的研究將會推動品質(zhì)育種進(jìn)程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標(biāo)記是在DNA水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點，可在苗期進(jìn)行選擇，加快了育種的進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供兩個與黃瓜果瘤基因Tu更緊密連鎖的分子標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，命名為Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
上述與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，命名為Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段與果瘤Tu連鎖，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。上述與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物擴增得到。該引物由上海生工合成。本發(fā)明利用分子標(biāo)記和染色體步移法，提供兩個與黃瓜果瘤基因Tu更緊密連鎖的穩(wěn)定的SSR分子標(biāo)記，果瘤基因Tu在提供的兩個分子標(biāo)記之間，遺傳距離在O. 5cM之內(nèi)，物理距離僅50Kb左右；由于所有兩個分子標(biāo)記的開發(fā)均與已知的黃瓜基因組序列相關(guān)，由此而獲得的兩個分子標(biāo)記之間的物理圖譜將有利于Tu基因的最終克隆，便于分子標(biāo)記輔助育種體系的建立。本發(fā)明的分子標(biāo)記可簡便、快速、高通量地應(yīng)用于育種實踐。


圖I是Y32的PCR擴增結(jié)果標(biāo)記圖；S52為有瘤親本；S06為無瘤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的19有瘤或無瘤植株P(guān)CR擴增結(jié)果。下面的條帶代表與果瘤基因Tu連鎖，上面的條帶代表與無瘤基因tu連鎖。圖2是Y46的PCR擴增結(jié)果標(biāo)記圖；S52為有瘤親本；S06為無瘤親本R代表兩親本雜交后代；F2隨機擴增代表在F2群體中隨機挑選的19有瘤或無瘤植株P(guān)CR擴增結(jié)果。下面的條帶代表與果瘤基因Tu連鎖，上面的條帶代表與無瘤基因tu連鎖。圖3是黃瓜果瘤基因Tu的染色體步移示意圖Y32與Υ46代表與Tu基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，SSR16203與C-SC933代表已經(jīng)公布的標(biāo)記。拼接用到的是已經(jīng)公布的黃瓜品種基因組序列(http://cucumber, vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)使用的是 gyl4 品種的 Scaffold02633、Scaffold00154 和 9930 品種的 Scaffold000083、Scaffold000234中的序列，拼接后的序列總長度為1300kb。X代表F2群體剩余的交換株。
具體實施方式
一、遺傳分離群體的構(gòu)建與交換單株的鑒定UF2群體的構(gòu)建歐洲溫室類型自交系S06(母本)，表面光滑無果瘤，白刺較細(xì)?。蝗A南類型自交系S52(父本)，表面有果瘤，黑刺較粗大，S06自交系和S52自交系已在《自然科學(xué)進(jìn)展》2005年“黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位”一文中公開(潘俊松等.黃瓜SRAP遺傳連鎖圖的構(gòu)建及始花節(jié)位的基因定位.自然科學(xué)進(jìn)展，2005，15，167-172)。本實施例利用這兩個親本配制了雜交組合，F(xiàn)1為有果瘤，黑刺較粗大，F(xiàn)1代自交產(chǎn)生F2代群體。在2200株F2個體中，鑒定有/無果瘤表型,卡方分析法進(jìn)行驗證。2、交換單株的篩選 2. I黃瓜基因組DNA的提取常規(guī)方法一CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。2. 2標(biāo)記掃描F2分離群體利用已經(jīng)公開的與Tu基因連鎖的分子標(biāo)記SSR16203和SCAR標(biāo)記C_SC933和本發(fā)明中開發(fā)的兩個分子標(biāo)記(Y32、Y46)掃描上述獲得的F2分離群體，尋找標(biāo)記基因型(通過分析顯隱親本獲得)與性狀表現(xiàn)型(有瘤/無瘤)的差別單株，獲得標(biāo)記與Tu基因的交換單株。PCR 體系基因組 DNA 30ng，引物 O. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2,I X Taq緩沖液，O. 5U TaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 μ L，其中TaqDNA聚合酶購于Promega公司。PCR擴增程序為-MV 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。上述PCR產(chǎn)物檢測方法為標(biāo)記C_SC933使用3%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果；其余(SSR16203、Y32、Y46)PCR產(chǎn)物使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液為lXTBE，50W恒功率，電泳lh。電泳后進(jìn)行銀染。銀染方法為將帶膠的玻璃板放入固定液中，在搖床上輕輕搖動至指示劑顏色褪去，其中固定液的組成為冰醋酸、無水乙醇、蒸餾水的體積比為I : 10 100 ;用超純水洗Imin 3min ;將沖洗后的膠板放入染色液中搖動半小時，其中染色液的組分為2g/L硝酸銀；將染色后的膠板放入超純水中漂洗5s后放入裝有顯影液的塑料盒中，輕輕搖動至條帶清晰，放入自來水中沖洗3min;室溫下干燥，干燥后拍照，其中顯影液是在IL蒸餾水中加入15gNaOH和3ml甲醛混勻得到的。2. 3多態(tài)性片段的回收、克隆和測序?qū)⒍鄳B(tài)性片段從聚丙烯酰胺凝膠上切下，置于離心管中，用槍頭搗碎，加入超純水沖洗三遍，然后加入IOul超純水95°C水浴15min，快速離心取上清液，用相對應(yīng)的SSR引物進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為目標(biāo)條帶DNA 5ul，引物O. 5 umol/L，200umol/L dNTPs,IXTaq Buffer, I. 5mmol/L MgCl2, 2U Taq DNA 聚合酶，總反應(yīng)體系為 50ul，其中 TaqDNA聚合酶購于Promega公司。目標(biāo)條帶PCR擴增程序為94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；50°C 30s ；72°C Imin ；72°C 5min。將 PCR 產(chǎn)物中加入 goldview 熒光染料 3ul，4°C 下放置IOmin讓染料同DNA結(jié)合，然后加入上樣緩沖液2ul，混勻后通過I %瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入I. 5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收，其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號為Cat. No. SK1132。將回收產(chǎn)物與載體連接采用上海申能博彩公司的PUCm-T vector系統(tǒng)。用電擊法將連有目標(biāo)片段的T-vector轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測，進(jìn)行相關(guān)序列的測定。二、染色體步移與標(biāo)記開發(fā)I、黃瓜基因組序列的兼并拼接利用已經(jīng)公布的黃瓜品種9331和gyl4黃瓜基因組序列(http://cucumber, vcru.wise, edu/wenglab/gy 14-9930/index, html),將 SSR 分子標(biāo)記 16203 序列掃描黃瓜基因組9930數(shù)據(jù)庫中得到Scaffold000083，將Scaffold000083的末端序列掃描黃瓜基因組gyl4數(shù)據(jù)庫得到Scaffold02633，將Scaffold02633的末端序列掃描黃瓜基因組9930數(shù)據(jù)庫得到Scaffold000234，將Scaffold000234的末端序列掃描黃瓜基因組gyl4數(shù)據(jù)庫得到 Scaffold00154。Scaffold00154 序列中含有 SCAR 標(biāo)記 C_8C69 序列，用 DNAMAN 軟件對這4個Scaffold序列比對，兼并拼接得到SCAR標(biāo)記C_SC69和SSR標(biāo)記16203之間總長度1300Kb的序列?！?br> 2、遺傳分子標(biāo)記的開發(fā)本發(fā)明通過SSR分析軟件對獲得的1300Kb序列進(jìn)行掃面分析，對獲得的SSR位點用弓I物設(shè)計軟件Primer Premier5. O對設(shè)計引物,在兩親本間進(jìn)行PCR擴增并使用6 %變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。找出具有多態(tài)性的標(biāo)記，再次篩選用SSR標(biāo)記16203和SCAR標(biāo)記C_SC933獲得的2200株群體里的交換株。位于基因兩側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記向交換株逐漸減少的方向步移，最后距尚果瘤基因Tu兩側(cè)最近的2個SSR位點在兩未本間廣生差異(圖I和圖2)，隨后對其進(jìn)行測序并獲得SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 3和SEQ IDNO. 4中的序列信息，這兩個標(biāo)記分別命名為Y32和Y46，標(biāo)記Y32和Y46在2200株大群體中剩余的交換株分別剩余4株和2株。所有SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)體系均為；黃瓜DNA 20ng,雙向引物各0.2“11101/1，20(^11101/1(1見138，211111101/11%(12，1\了&9緩沖液，0· 5UTaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 μ 1，其中TaqDNA聚合酶購于Promega公司。擴增程序為94°C 3min ；35cycles,94°C 20s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。以上兩個新開發(fā)的分子標(biāo)記經(jīng)過分離群體驗證，均與Tu基因位點緊密連鎖(圖3，圖中X表示剩余的交換株)。由于都是特異性PCR擴增，故這些標(biāo)記具有高穩(wěn)定。利用這些標(biāo)記構(gòu)建的高密度遺傳和物理圖譜，將有助于黃瓜果瘤基因Tu的最終克隆。本發(fā)明利用果瘤親本S52和無果瘤親本S06雜交獲得F1, F1再自交獲得2200株F2分離群體。利用已經(jīng)公布的黃瓜品種9930和gyl4黃瓜基因組序列(http://cucumber,vcru. wise, edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)，能夠?qū)?SCAR 標(biāo)記 C_SC933 和 SSR 標(biāo)記16203之間的序列兼并拼接。拼接所用的gyl4黃瓜基因組序列有Scaffold02633、Scaffold00154，拼接所用的 9930 黃瓜基因組序列有Scaffold000083、Scaffold000234,拼接后的序列總長度為1300kb。首先用已經(jīng)公布的SCAR標(biāo)記C_SC933和SSR標(biāo)記16203篩選該擴大的群體，找出交換株。然后再用SSR分析軟件找出SSR位點，設(shè)計引物軟件，對1300kb序列分析設(shè)計了大量引物，找出親本間有多態(tài)性的引物，對交換株進(jìn)行篩選和染色體步移，最后確定最近的兩側(cè)標(biāo)記在Tu/tu基因位點間分別還有4和2個交換單株。上述黃瓜染色體步移的詳細(xì)情況如圖3所示。本發(fā)明中涉及的分子標(biāo)記SSR標(biāo)記16203和SCAR標(biāo)記C_SC933已公開。詳細(xì)參看Zhang W W 等在《Theoretical and Applied Genetics))(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2009 年第 120卷第 3 期 645-654 頁發(fā)表的題為《Identification and mapping of molecular markerslinked to the tuberculate fruit gene in the cucumber (Cucumis sativus L.)))(黃瓜果瘤基因緊密連鎖分子標(biāo)記定位)一文。本發(fā)明中PCR產(chǎn)物克隆測序中所使用的E. coli DH5 α菌株已在文獻(xiàn)《李欣，等。電轉(zhuǎn)化法制備高轉(zhuǎn)化效率的Ε. coli感受態(tài)細(xì)胞研究。食品與生物技術(shù)學(xué)報，2007，26 (6) 48 51》中公開；本發(fā)明中涉及的Ε. coli DH5a菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，購于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)東北二街19號。
權(quán)利要求
1.一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，命名為Y32，由SEQ ID NO. I所示的DNA片段和SEQ ID NO. 2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. I所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴增得到，其PCR擴增程序為94°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，命名為Y46，由SEQ ID NO. 3所示的DNA片段和SEQ ID NO. 4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO. 3所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO. 4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于由SEQ ID NO. 7所示的上游引物和SEQ ID NO. 8所示的下游引物擴增得到，PCR擴增程序為 940C 5min ；35cycles,94°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
兩個與黃瓜果瘤基因Tu緊密連鎖的分子標(biāo)記，第一個命名為Ｙ32，由SEQ ID NO.1所示的DNA片段和SEQ ID NO.2所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.1所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO.2所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。第二個命名為Ｙ46，由SEQ ID NO.3所示的DNA片段和SEQ ID NO.4所示的DNA片段組成；其中SEQ ID NO.3所示的DNA片段與果瘤基因Tu連鎖，SEQ ID NO.4所示的DNA片段與無瘤基因tu連鎖。本發(fā)明的兩個分子標(biāo)記Y32和Y46與已經(jīng)公開的SCAR標(biāo)記C_SC69和SSR標(biāo)記16203相比，與Tu基因位點的連鎖更加緊密，已經(jīng)將Tu基因定位在50Kb區(qū)間，對關(guān)于有瘤/無瘤的黃瓜分子標(biāo)記輔助育種體系的建立更有幫助。
文檔編號C12N15/11GK102925435SQ201210382890
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者楊緒勤, 潘俊松, 何歡樂, 蔡潤, 李月 申請人:上海交通大學(xué)