與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑒定方法，用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，由上游引物和下游引物組成，上游引物是SEQ?ID?No1所述序列，下游引物是SEQ?ID?No2所述序列。利用本發(fā)明的引物序列及其擴(kuò)增出的黃瓜抗黑斑病基因片段和黃瓜感黑斑病基因片段對構(gòu)建的F2代分離群體和黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行黑斑病抗性評價，其結(jié)果與人工接種鑒定符合率分別達(dá)95.60%、93.42%，在黃瓜育種中進(jìn)行資源抗性篩選具有很大的應(yīng)用價值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行抗黑斑病標(biāo)記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗黑斑病基因的探針；可以為進(jìn)行抗黑斑病基因定位、作圖與克隆。
【專利說明】與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段及抗性鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及黃瓜常規(guī)雜交育種、分子標(biāo)記輔助育種的方法與技術(shù)。特別是與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段、與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃瓜(CucumisSativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis)—年蔓生草本植物，是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，是中國種植面積最大的蔬菜之一。黃瓜黑斑病[Cucumber alternaria leaf spot, Alternaria cucumerina]是近幾年發(fā)展起來的一種由瓜鏈格孢菌引起、為害嚴(yán)重的真菌性病害，目前已成為黃瓜保護(hù)地、露地栽培的重要病害之一。俗稱烤葉病、燒葉病，幼苗、成株均可發(fā)病。主要危害葉片，一般先從黃瓜的中、下部葉片開始發(fā) 生，而后逐漸向上蔓延，最后僅剩下頂端幾片綠葉，病株似火烤狀。病斑多數(shù)沿葉脈兩側(cè)的葉肉組織發(fā)展，主脈一般不受害。發(fā)病嚴(yán)重時多個病斑連成一片，葉肉組織枯死，葉緣向上卷起，葉子焦枯，但不脫落。黃瓜黑斑病一般在4月中旬至5月上、中旬發(fā)生，發(fā)病率高達(dá)60%以上，減產(chǎn)10~20%。結(jié)瓜期發(fā)病，如果防治不及時，會造成絕產(chǎn)，給種植戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。尤其在蔬菜高度產(chǎn)業(yè)化的今天，基于傳統(tǒng)的抗病育種模式嚴(yán)重制約著黃瓜品種的更新?lián)Q代、生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化的步伐，利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段進(jìn)行黃瓜抗病分子標(biāo)記輔助育種勢在必行。
[0003]分子標(biāo)記的應(yīng)用為蔬菜育種學(xué)開辟了嶄新的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，它使蔬菜育種學(xué)家能直接從分子水平了解物種間的差異，也使育種過程更直觀，目的性更強(qiáng)。分子標(biāo)記輔助選擇(Molecular marker-assisted selection,MAS)技術(shù)目前已成為育種研究的熱點(diǎn)和重要手段，將分子遺傳技術(shù)應(yīng)用于蔬菜抗病遺傳育種的研究上，為材料的選擇提供了全新的手段。可在早代對表現(xiàn)優(yōu)良的基因型進(jìn)行鑒定，苗期即可在DNA水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，抗病性鑒定可在室內(nèi)完成，鑒定周期縮短到2天，而且穩(wěn)定可靠，不受季節(jié)、環(huán)境條件等因素的影響，可提高選擇速度，增強(qiáng)選擇的準(zhǔn)確性和可靠性，加快育種進(jìn)程，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]隨著蔬菜集約化生產(chǎn)和栽培技術(shù)的提高，黃瓜抗病育種已提到重要位置。黃瓜黑斑病是黃瓜生產(chǎn)上的重要病害。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，迄今為止，有關(guān)黃瓜黑斑病的分子標(biāo)記輔助育種研究尚缺乏系統(tǒng)的研究和報道。因而將黃瓜抗黑斑病基因與不抗黑斑病的其它品種的優(yōu)良品質(zhì)基因相結(jié)合，培育優(yōu)良抗病的黃瓜新品種和創(chuàng)造黃瓜新種質(zhì)是生產(chǎn)實(shí)踐中亟需解決的實(shí)際問題。篩選與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，獲得與黃瓜抗、感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，建立黃瓜抗黑斑病分子標(biāo)記輔助育種體系，將會推動傳統(tǒng)的“經(jīng)驗(yàn)育種”向高效的“精確育種”轉(zhuǎn)變，提升育種效率和技術(shù)水平，加速抗病育種的進(jìn)程，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列。[0006]本發(fā)明的第二個目的是提供一種與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段。
[0007]本發(fā)明的第三個目的是提供一種與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段。
[0008]本發(fā)明的最后一個目的是提供一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0010]用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，它由上游引物和下游引物組成，上游引物是序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
[0011]與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，是SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列。
[0012]與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，是SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列。
[0013]一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，包括如下步驟:
[0014](I)提取被鑒定樣品黃瓜基因組DNA ;
[0015](2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0016](3)將步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；
[0017](4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性:凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQID N0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質(zhì)資源或?qū)S瓜進(jìn)行抗黑斑病分子標(biāo)記輔助育種。
[0018]利用本發(fā)明的鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列及其擴(kuò)增出的黃瓜抗黑斑病基因片段和黃瓜感黑斑病基因片段對構(gòu)建的F2代分離群體和黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行黑斑病抗性評價，其結(jié)果與人工接種鑒定符合率分別達(dá)95.60%,93.42%，在黃瓜育種中進(jìn)行資源抗性篩選具有很大的應(yīng)用價值。以這些序列為依據(jù)，可以進(jìn)行抗黑斑病標(biāo)記輔助選擇、育種，用作黃瓜育種中檢測黃瓜抗黑斑病基因的探針；可以為進(jìn)行抗黑斑病基因定位、作圖與克隆，通過基因工程改良黃瓜品種的抗病性奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是利用鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法獲得的與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段和感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段電泳圖:
[0020]A為與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.3所示，122bp)；
[0021]B為與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.4示，126bp)；
[0022]1、4、7、8、10、11為抗病單株；2、3、5、6、9為感病單株，純合抗性株僅有抗性基因片段，純合感性株僅有感性基因片段。
[0023]圖2是利用一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，獲得的黃瓜感黑斑病母本L63和抗黑斑病父本L9雜交后代F2代分離情況圖譜:1、2、7、9、10、12、16、18、21、24、26、37、44、48、50、55、65、67、68、70、75、82、83、85 為抗病單株;3、6、13、17、20、28、31、42、43、46、49、52、58、59、60、62、63、64、69、71、76、80 為感病單株；4、5、8、11、14、15、19、22、23、25、27、29、30、32 ~36,38 ~41、45、47、51、53、54、56、57、61、66、72 ~74,77 ~79、81、84、86 為雜合類型
單株，M為DNA標(biāo)準(zhǔn)，純合抗性株僅有抗性基因片段，純合感性株僅有感性基因片段，雜合類型單株同時具有抗性基因片段和感性基因片段。
[0024]圖3是利用一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，對黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行黑斑病抗性檢測:A為與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.3所示，122bp)，B為與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段(SEQ ID N0.4所示，126bp) ;51、52、89~92、102、104、127 ~129、131、135 ~137、144、151 為抗病種質(zhì)資源；1 ~50,53 ~70、72 ~88、93 ~101、103,105 ~126、130、132 ~134、138 ~141、143、145 ~149、152 ~189 為感病種質(zhì)資源；71、142、150為雜合類型種質(zhì)資源。純合抗病種質(zhì)資源僅有抗性基因片段,純合感病種質(zhì)資源僅有感性基因片段，雜合類型種質(zhì)資源同時具有抗性基因片段和感性基因片段。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1 [0027]( I)提取被鑒定樣品黃瓜基因組DNA ；
[0028](2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增專用薄壁管中放入:所述黃瓜基因組DNA20ng、序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列25ng、序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列25ng、dNTP0.20mM、Mg2+L 5mM、I倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1.0單位，加無菌重蒸餾水至20 μ 1，將所述PCR擴(kuò)增專用薄壁管放入PCR儀中擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性180秒，94 V變性60秒，51V退火60秒，72 °C延伸120秒，35個循環(huán)，再72 °C延伸350秒，擴(kuò)增完成；
[0029](3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳分析:將步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離；在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，上樣于經(jīng)30分鐘預(yù)電泳的變性聚丙烯酰胺凝膠上，70W恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達(dá)凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相；
[0030](4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性。由于抗病單株、感病單株或中間類型單株經(jīng)擴(kuò)增以后產(chǎn)生不同分子量的DNA片段，在凝膠上分離時其在凝膠上的遷移速率不同，從而形成位置上存在差異的條帶，通過條帶在凝膠上的相對位置就可對黃瓜黑斑病材料的抗性進(jìn)行快速鑒定凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質(zhì)資源或?qū)S瓜進(jìn)行抗黑斑病分子標(biāo)記輔助育種。
[0031]實(shí)施例2
[0032]鑒定黃瓜種質(zhì)資源黑斑病抗性
[0033]根據(jù)實(shí)施例1的方法，對不同黃瓜種質(zhì)資源基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)122bp (SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列)的特異片段的材料，為抗黑斑病資源；凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)126bp (SEQ ID N0.4所述的核苷酸序列)的特異片段的材料， 為感黑斑病資源；凡同時擴(kuò)增出該兩個特異片段的材料，為不純合材料，見圖3?？购诎卟≠Y源，或者是抗黑斑病基因的攜帶者，可以用作進(jìn)一步抗病品種選育的材料和育種種質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1.用于鑒定黃瓜黑斑病抗性的引物序列，其特征是它由上游引物和下游引物組成，上游引物是序列表中SEQ ID Nol所述的核苷酸序列，下游引物是序列表中SEQ ID No2所述的核苷酸序列。
2.與黃瓜抗黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，其特征是SEQID N0.3所述的核苷酸序列。
3.與黃瓜感黑斑病基因緊密連鎖的基因片段，其特征是SEQID N0.4所述的核苷酸序列。
4.一種鑒定黃瓜黑斑病抗性的方法，其特征是包括如下步驟: (1)提取被鑒定樣品黃瓜基因組DNA； (2)以所述黃瓜基因組DNA為模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所述核苷酸序列為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)將步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察、照相； (4)依據(jù)各被鑒定樣品在凝膠上條帶的相對位置，鑒定黃瓜黑斑病的抗性:凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列的材料，為抗黑斑病資源；凡擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料以及同時具有SEQ ID N0.3所述的核苷酸序列和SEQ IDN0.4所述的核苷酸序列的材料，為感黑斑病資源；對黃瓜抗黑斑病種質(zhì)資源或?qū)S瓜進(jìn)行抗黑斑病分子標(biāo)記輔助育種。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555857SQ201310576852
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】王惠哲, 楊瑞環(huán), 鄧強(qiáng), 曹明明, 李淑菊 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司