水稻的分子標(biāo)記方法
【專利摘要】水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物?；谠耘嗟緝蓚€(gè)亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機(jī)制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的科學(xué)問題，對于水稻的遺傳育種中優(yōu)良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優(yōu)勢的利用等實(shí)際問題也具有重要的利用價(jià)值和研究意義。開發(fā)基于秈稻-粳稻差異的分子標(biāo)記是解決這些科學(xué)問題的有力工具之一。
【專利說明】水稻的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]水稻的分子標(biāo)記方法屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物，世界半數(shù)以上的人口以此為生。我國是秈稻和雜交稻的種植大國，水稻與小麥、玉米等禾本科作物在基因排列上具有同線性，目前已成為遺傳學(xué)和基因組研究的模式植物，因此進(jìn)行水稻分子標(biāo)記方法的研究，對提升我國農(nóng)作物育種水平和培育新品種具有重要意義，并將幫助全球解決食物問題。
[0003]水稻不僅是最主要的糧食作物之一，而且還是重要的模式植物之一，其相關(guān)的遺傳、發(fā)育、進(jìn)化及其育種等研究一直備受科學(xué)家重視，研究內(nèi)容涉及到水稻的基礎(chǔ)及其應(yīng)用研究的各個(gè)方面，基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記因其具有的獨(dú)特優(yōu)越性而成為解決這些科學(xué)問題的有力工具之一。
[0004]其優(yōu)越性體現(xiàn)在:①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無組織器官、發(fā)育時(shí)期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響數(shù)量多，理論上遍及整個(gè)基因組；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無需專門人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因緊密連鎖的標(biāo)記篩選創(chuàng)造了條件對目標(biāo)性狀表達(dá)無不良影響，與不良性狀無必然連鎖；⑤部分標(biāo)記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體成本低，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。對于特定探針或引物可引 進(jìn)或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成?；谶@些特點(diǎn)，分子標(biāo)記現(xiàn)已被廣泛用于水稻有關(guān)功能基因標(biāo)記、基因克隆、遺傳圖譜和物理圖譜的繪制、農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記輔助選擇、生物進(jìn)化、遺傳多樣性研究等許多方面研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]水稻是最主要的糧食作物之一，也是重要的單字葉模式植物。基于栽培稻兩個(gè)亞種秈稻-粳稻的起源方式、分化過程、形成機(jī)制、遺傳多樣性分析以及秈稻-粳稻滲入系的鑒定等方面的研究一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的科學(xué)問題，對于水稻的遺傳育種中優(yōu)良組合的選配、秈稻-粳稻雜種優(yōu)勢的利用等實(shí)際問題也具有重要的利用價(jià)值和研究意義。開發(fā)基于秈稻-粳稻差異的分子標(biāo)記是解決這些科學(xué)問題的有力工具之一。
[0006]
1、基于雜交的分子標(biāo)記
典型代表是DNA限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP),該技術(shù)是基于Southern雜交的分子標(biāo)記的方法,是第一代分子標(biāo)記。其基本原理是將不同個(gè)體基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，與用放射性同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的DNA分子探針(RFLP標(biāo)記)進(jìn)行分子雜交，通過放射性自顯影等技術(shù)來顯示酶切片段的大小，從而檢測不同遺傳位點(diǎn)的等位變異(多態(tài)性)。RFLP標(biāo)記呈共顯性，標(biāo)記準(zhǔn)確，不影響表型，數(shù)目也較多。但其需要的DNA量較大，分析程序復(fù)雜，技術(shù)難度大，需要同位素標(biāo)記探針費(fèi)時(shí)，成本較高。[0007]2、基于PCR的分子標(biāo)記
常見的包括RAPD (Random amplified polymorphic DNA),AFLP (Amplified fragmentlength polymorphism), SSR (simple sequence repeats,又稱 microsatellite)、SCAR(sequence-characterized amplified region)、STS(sequence-tagged site)、CAPS(cleaved amplified polymorphiic sequence)等。具體表現(xiàn)為:
(I)隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA)
以隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD),是由Williams和Welsh同時(shí)于1990年發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)用短的(通常為10堿基)隨機(jī)序列DNA作為引物，對所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)性。與其它技術(shù)相比，RAPD技術(shù)具有一些突出優(yōu)點(diǎn):①操作簡便，實(shí)驗(yàn)周期短，能在較短時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品不必事先了解目的基因和片段序列；③所需樣品量極少，一次擴(kuò)增僅需20-100 ng的模板DNA ;④引物具普遍適用性,商品化引物可應(yīng)用于不同生物的研究；⑤適應(yīng)于自動(dòng)化操作和分析。由于具有以上優(yōu)點(diǎn)，RAro標(biāo)記已被廣泛用于目的基因標(biāo)記與定位、研究近緣種屬間的遺傳進(jìn)化關(guān)系、構(gòu)建遺傳圖譜等研究中。但是RAPD技術(shù)存在兩個(gè)缺點(diǎn)，一是多數(shù)位點(diǎn)的標(biāo)記表現(xiàn)顯性，不能提供完整的信息，另一方面是穩(wěn)定性及重復(fù)性差。RAPD作為一種初步篩選的方法，一旦發(fā)現(xiàn)所需要的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，再用特異序列擴(kuò)增的方法將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。
[0008](2)限制性酶切與PCR擴(kuò)增相結(jié)合產(chǎn)生的分子 標(biāo)記。AFLP (amplified fragmentlength polymorphism)即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性,是一種選擇性地?cái)U(kuò)增限制性片段的方法，該法先設(shè)計(jì)針對某種限制性內(nèi)切酶的通用接頭以及可與接頭序列和限制性酶切位點(diǎn)的序列配對的專用引物，用上述內(nèi)切酶消化基因組DNA，將通用接頭與限制性片段兩端連接，再用專用引物擴(kuò)增，最后電泳顯示結(jié)果。顯然這種技術(shù)兼具RFLP和RAH)兩種方法的優(yōu)點(diǎn)，其接頭和引物適用于不同的生物類型，而且AFLP能提供比RFLP和RATO更多的特定基因的多態(tài)性信息。AFLP標(biāo)記的多態(tài)性強(qiáng)，利用放射性標(biāo)記在變性的聚丙烯酞胺凝膠上可檢測到100-150個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，非常適合繪制品種的DNA指紋圖譜及進(jìn)行分類研究。
[0009](3)特異引物PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記。微衛(wèi)星(microsatellites )或簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSRs)又稱微衛(wèi)星 DNA (Microsatellite DNA)、短串聯(lián)重復(fù)序列(Short seqence repeats, STR),是由少數(shù)核甘酸(一般1-6個(gè)bp)為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列，總長度為幾十到幾百個(gè)bp，隨機(jī)分布在整個(gè)水稻基因組的不同位置上。SSR標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，具有操作簡單、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、共顯性等特點(diǎn)。尤其是隨著國際水稻全基因組測序計(jì)劃的完成，該標(biāo)記又獲得了快速的發(fā)展。2002年，McCouch等開發(fā)出2240對新的水稻SSR分子標(biāo)記。2005年，國際水稻基因組測序計(jì)劃研究認(rèn)為，水稻基因組總共含有18828個(gè)SSR位點(diǎn)。該標(biāo)記被廣泛應(yīng)用在水稻的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL )的定位、基因圖位克隆和比較基因組學(xué)及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面的研究，是目前應(yīng)用在水稻上最多的一類標(biāo)記之一。
[0010](4)特異引物PCR擴(kuò)增與限制性酶切相結(jié)合產(chǎn)生的分子標(biāo)記。CAPS( cleavedamplified polymorphic sequences, CAPS)標(biāo)記，即酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列，是特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標(biāo)記。其基本原理是根據(jù)特定的DNA序列去設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，然后應(yīng)用這些引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；接著用專一性的限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。dCAPS( derivedcleaved amplified polymorphic sequences, dCAPS)是Neff 等在CAPS 基礎(chǔ)上發(fā)展的，是在CAPS標(biāo)記的基礎(chǔ)上通過在擴(kuò)增引物中引入錯(cuò)配堿基而引入新的限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)，經(jīng)過酶切電泳后產(chǎn)生和CAPS標(biāo)記類似的多態(tài)性。CAPS標(biāo)記可以由SCAR、STS、EST、SNP等多種標(biāo)記延伸而來，并可以應(yīng)用 Blast Digester (http: //bbc.botany, utoront0.ca /ntools /cg1-bin /ntools blast_digester.cgi)、SNP2CAPS (http: // pgrc.1pk -gatersleben.de / snp2 caps /)、dCAPS Finder 2.0 (http: // helix, wustl.edu /dcaps /dcaps.html)等多種軟件進(jìn)行開發(fā)。目前，CAPS標(biāo)記已被應(yīng)用在水稻基因定位與克隆、功能標(biāo)記的發(fā)展、分子標(biāo)記輔助選擇等方面。該標(biāo)記具共顯性遺傳，穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是檢測技術(shù)相對復(fù)雜，即先對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后再行多態(tài)性檢測。
[0011]3、基于DNA序列和芯片的分子標(biāo)記
主要包括表達(dá)序列標(biāo)記(expressed sequence tags, EST),多樣性序列芯片技術(shù)(Diversity A rrays Technology, DArT),單核苷酸多態(tài)序列(single nucleotidepolymorphism, SNP),插入缺失長度多態(tài)性(insertion deletion length polymorphism,InDel)等。
[0012](I)EST標(biāo)記。ES T是長約300_400bp的基因表達(dá)序列片段。EST技術(shù)是從來源于不同組織和器官的cDNA文庫中大規(guī)模隨機(jī)挑選cDNA克隆，對其5’或3’端進(jìn)行測序，所獲長約300-400bp的基因表達(dá)序列。EST序列的長度足以包含其所代表基因的必要信息，因此可以用EST特異性的標(biāo)記基因。該序列與基因數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比較，從而獲得對生物體生長、發(fā)育、代謝、繁殖、衰落死亡等一系列生理生化過程認(rèn)識的技術(shù)，它是以對DNA序列進(jìn)行測序?yàn)楹诵牡男滦头肿訕?biāo)記的代表之一。在全基因組測序尚未完成時(shí)，EST在鑒定基因、發(fā)現(xiàn)新基因、基因圖譜的構(gòu)建、利用EST進(jìn)行大規(guī)模分析基因表達(dá)水平等方面起著重要的作用。EST的數(shù)量截止到2010年12月13日，公共數(shù)據(jù)庫NCBI中釋放不同物種的EST數(shù)量已經(jīng)達(dá)到52，858，766條，其中水稻的EST數(shù)量有25，019，080條。
[0013]EST途徑的不足之處在于通過隨機(jī)測序有時(shí)難以獲得低豐度表達(dá)和那些在特殊環(huán)境條件脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因。要彌補(bǔ)這些不足，必須開展全基因組測序。通過分析基因組序列，獲得基因結(jié)構(gòu)的完整/[目息，如基因在染色體上的排列順序，基因間的間隔結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的分布等。
[0014](2) DArT標(biāo)記。DArT標(biāo)記是于2001年發(fā)明的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[17]，它是依賴與芯片雜交來辨別不同基因組之間多態(tài)性的方法。DArT標(biāo)記的特點(diǎn)是具有高通量低成本，一個(gè)陣列可同時(shí)檢測分布在基因組中的幾百個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)；多態(tài)性DArT標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和檢測是平行進(jìn)行，新的標(biāo)記發(fā)現(xiàn)和標(biāo)記評價(jià)是在同一芯片上進(jìn)行，無需發(fā)展進(jìn)一步的評價(jià)體系；在標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)和檢測中不需要預(yù)先知道DNA序列信息，這就使得該法可應(yīng)用于DNA序列信息有或無的所有的物種，對于親緣關(guān)系稀少的孤立種質(zhì)材料更具有適用性；基因組變異可包括特定區(qū)域的栽培品種，也可覆蓋該種內(nèi)包括野生親緣種的遺傳變異，由DArT所揭示的多樣性可不斷地在以往的基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)展，因此使用者可根據(jù)要求來確定DArT遺傳分析的范圍；該技術(shù)重復(fù)性穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)可靠，受染色體倍數(shù)性和基因組大小的影響很??；DArT標(biāo)記具有顯性和共顯性的特點(diǎn)，可克隆進(jìn)行序列分析而發(fā)展為新的標(biāo)記等等。
[0015](3) SNP分子標(biāo)記。SNP被稱為第三代DNA遺傳標(biāo)記。它是指由基因組水平上單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入或缺失等引起的DNA序列多態(tài)性。其廣泛出現(xiàn)在單拷貝DNA序列中，在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率，在DNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)都能找到SNP，并且一些SNP標(biāo)記是表型變異的直接原因。SNP數(shù)量豐富，遺傳穩(wěn)定性好，尤其是建立在DNA芯片技術(shù)上的大規(guī)模自動(dòng)化檢測，使其具有更加廣泛的應(yīng)用前景。2002年水稻秈、粳兩個(gè)亞種的基因組序列草圖繪制完成，這為SNP的研究提供了極大的便利。Shen等利用生物信息學(xué)方法，通過比較水稻品種日本晴和93-11的全基因組序列的差異，構(gòu)建了日本晴和93-11全基因組DNA序列多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含1703176個(gè)SNP和479406個(gè)InDel片段，平均每286個(gè)堿基就有一個(gè)SNP，每953個(gè)堿基就有一個(gè)InDel。
[0016]2005年8月又發(fā)表了水稻基因組序列全圖，至此已完成全長389Mb的水稻全基因組序列95%以上的測序工作，發(fā)表的水稻基因組序列全圖顯示，秈、粳稻間SNPs位點(diǎn)多達(dá)80127個(gè)，平均每154個(gè)堿基就存在一個(gè)SNP，其頻率是擬南芥兩個(gè)生態(tài)型Columbia和Landsberg之間SNP頻率的20倍。目前該標(biāo)記被用于水稻的遺傳圖譜的繪制、基因克隆、分子標(biāo)記輔助選擇等多個(gè)方面。
[0017]總的來說，目前SNP的研究重點(diǎn)還在于SNPs的發(fā)現(xiàn)，雖然在秈粳稻基因組序列中存在大量的SNPs，但這些SNPs只是基于代表兩個(gè)亞種的兩個(gè)具體的基因型獲得的，缺乏廣泛的代表性，這樣的SNP頻率常常會被高估。Jin等在亞種內(nèi)品種間SNPs數(shù)量可能比數(shù)據(jù)庫中的SNPs更加少得多，在實(shí)際遺傳育種中，我們可能只是針對個(gè)別目標(biāo)性狀的改良，利用的材料常常是親緣關(guān)系很近的育種材料，SNP頻率就會更加的低，發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的SNPs的可能性就更小。因此在實(shí)際應(yīng)用中要精確地評價(jià)水稻中SNP的頻率，就要增加實(shí)驗(yàn)材料的基因型數(shù)量，以獲取更多的DNA序列的數(shù)據(jù)作綜合比較。
[0018]目前制約SNPs應(yīng)用的另一個(gè)因素是SNP檢測技術(shù)還有待完善，雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了檢測技術(shù)的高度自動(dòng)化和 高效率，但實(shí)驗(yàn)成本高昂，大大限制了 SNP標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用。盡管SNP標(biāo)記可以轉(zhuǎn)化為PCR或CAPS標(biāo)記，但其工作量比其他分子標(biāo)記未能減少，不能完全發(fā)揮SNP標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)越性。因此我們還需要繼續(xù)提高SNP檢測技術(shù)的自動(dòng)化程度和檢測效率，降低檢測成本，同時(shí)大量發(fā)掘與水稻重要經(jīng)濟(jì)性狀或生理性狀相關(guān)聯(lián)的SNPs，使SNPs在水稻遺傳育種中發(fā)揮巨大作用。
[0019](4) Indel標(biāo)記。Indel標(biāo)記即插入缺失長度多態(tài)性。插入/缺失,指的是兩種親本在全基因組中的差異，相對另一個(gè)親本而言，其中一個(gè)親本的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入，根據(jù)基因組中插入/缺失位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一些擴(kuò)增這些插入/缺失位點(diǎn)的PCR引物，由此產(chǎn)生PCR產(chǎn)物長度大小的差異即是InDel標(biāo)記。同SNP標(biāo)記一樣，InDel標(biāo)記也是一類基于水稻基因組序列基礎(chǔ)上的新型分子標(biāo)記。隨著大規(guī)模測序技術(shù)的發(fā)展以及日本晴、93-11等水稻亞種與廣東矮4號等品種基因組序列的完成，大大地促進(jìn)了水稻InDel標(biāo)記的發(fā)展與應(yīng)用。
[0020]與SSR標(biāo)記相比，InDel標(biāo)記具有在基因組中分布密度高、擴(kuò)增帶型少、分離效果好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；較SNP標(biāo)記而言，InDel標(biāo)記具有檢測技術(shù)簡單、穩(wěn)定性高、經(jīng)濟(jì)而實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。跟其他分子標(biāo)記一樣，InDel標(biāo)記可被用于水稻相關(guān)基因的精細(xì)定位與作圖、基因克隆、分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面外，作為從水稻兩個(gè)亞種基因組序列開發(fā)的標(biāo)記還有以下幾個(gè)應(yīng)用優(yōu)勢:水稻秈稻-粳稻的鑒定與品種的合理布局；水稻秈-粳遺傳分化與雜種優(yōu)勢分子機(jī)制研究；育種群體結(jié)構(gòu)與秈稻-粳稻滲入系的鑒定分析。
【權(quán)利要求】
1.與SSR標(biāo)記相比，InDel標(biāo)記具有在基因組中分布密度高、擴(kuò)增帶型少、分離效果好、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；較SNP標(biāo)記而言，InDel標(biāo)記具有檢測技術(shù)簡單、穩(wěn)定性高、經(jīng)濟(jì)而實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，跟其他分子標(biāo)記一樣， InDel標(biāo)記可被用于水稻相關(guān)基因的精細(xì)定位與作圖、基因克隆、分子標(biāo)記輔助選擇育種等。
【文檔編號】C12N15/11GK103725675SQ201210388325
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月15日
【發(fā)明者】王黎明, 黨明青, 王紀(jì)年 申請人:王紀(jì)年