專利名稱：鵪鶉蛋魚腥味敏感基因及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體地涉及鵪鶉蛋魚腥味敏感基因及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
改革開放三十多年來，畜牧業(yè)依賴國(guó)家的支持鼓勵(lì)政策，取得了飛速的發(fā)展，為人民群眾提供了各種豐富的畜禽產(chǎn)品。伴隨著物質(zhì)生活的逐步改善，人民群眾不再只滿足于吃飽，從產(chǎn)品品質(zhì)方面對(duì)各種畜禽產(chǎn)品提出了更高的要求。我國(guó)鵪鶉總飼養(yǎng)量為2億只，其中蛋用型鵪鶉占四分之三。鵪鶉蛋作為一種常見禽蛋產(chǎn)品已經(jīng)走上了人們的餐桌。 鵪鶉蛋營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含各種人體必需營(yíng)養(yǎng)元素，品質(zhì)和風(fēng)味優(yōu)異，各種營(yíng)養(yǎng)成份種類比較全面。鵪鶉蛋含有較多的苯丙氨酸、亮氨酸等人體必需氨基酸，多種礦質(zhì)元素和維生素。鵪鶉蛋含有豐富的卵磷脂，是調(diào)理和滋補(bǔ)理想食品。鵪鶉蛋還具有明顯的藥用價(jià)值，“味甘，性溫平，無毒”，一直被作為滋補(bǔ)食品和藥膳的原料。作為禽蛋產(chǎn)品的一種，鵪鶉蛋以其豐富的營(yíng)養(yǎng)和口味深受人們喜愛。隨著鵪鶉生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和蛋產(chǎn)品產(chǎn)量的增加，人們對(duì)鵪鶉蛋的需求不再僅僅追求數(shù)量，而對(duì)蛋的品質(zhì)風(fēng)味也提出了越來越多的要求。但是，飼料中三甲胺及三甲胺前體物的存在使部分鵪鶉個(gè)體所產(chǎn)蛋中沉積大量三甲胺，誘發(fā)魚腥味蛋的產(chǎn)生，導(dǎo)致生產(chǎn)和加工很大經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)方法是直接通過測(cè)量蛋黃三甲胺含量的高低來判斷和剔除鵪鶉的有魚腥味，不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)而且效率相對(duì)低下，傳統(tǒng)選育方法很難剔除干凈。黃素單加氧酶3(Flavin Containing Monooxygenase3, FM03)主要存在于肝臟中，可以將攝入體內(nèi)的三甲胺氧化成沒有魚腥味的氧化三甲胺。當(dāng)FM03基因發(fā)生突變影響到酶的催化功能，而同時(shí)飼料中又含有較多三甲胺的前體物如膽堿等，就會(huì)導(dǎo)致FM03不能氧化機(jī)體攝入的三甲胺，從而導(dǎo)致三甲胺沉積到蛋黃中，產(chǎn)生魚腥味蛋。有研究發(fā)現(xiàn)，褐殼蛋雞和奶牛的FM03基因突變均可導(dǎo)致魚味綜合癥發(fā)生(Honkatukia，et al. , 2005;Lunden etal.，2002)。SNP的檢測(cè)方法目前已有很多成熟的技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)(PCR-SSCP)、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)(PCR-RFLP)、DNA測(cè)序、等位基因特異寡聚核苷酸雜交、DNA芯片等等。近年來測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得測(cè)序的代價(jià)越來越低，并且可以高通量快速進(jìn)行。相對(duì)而言，直接測(cè)序檢測(cè)鵪鶉蛋黃魚腥味敏感基因的方法，耗時(shí)短、準(zhǔn)確性高、花費(fèi)較低，具有很高的育種實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。目前，對(duì)于禽蛋產(chǎn)品魚腥味性狀的研究中，張龍超等發(fā)明了一種PCR-RFLP的方法，用于檢測(cè)雞蛋魚腥味基因突變，可以準(zhǔn)確快捷而簡(jiǎn)便的剔除雞群體中的魚腥味敏感基因，大大加快了雞蛋品質(zhì)風(fēng)味的選育進(jìn)展。但對(duì)于影響鵪鶉蛋三甲胺與魚腥味性狀的關(guān)鍵基因研究還未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鵪鶉黃素單加氧酶3基因。本發(fā)明另一目的是提供檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的SNP分子標(biāo)記、引物及試劑盒。本發(fā)明再一目的是提供一種檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的方法。本發(fā)明又一目的是提供上述基因編碼的蛋白。
鵪鶉的FM03基因，其cDNA全長(zhǎng)1888bp，含有1596bp的開放閱讀框，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，共編碼532個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。鵪鶉FM03基因的cDNA第992位堿基處的C/T堿基突變，導(dǎo)致編碼第319位谷氨酰胺(Q)的密碼子CAG轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止子TAG，命名為Q319X無義突變。該突變純合子TT基因型個(gè)體FM03蛋白翻譯的提前終止，編碼的蛋白序列從532個(gè)氨基酸縮短為319個(gè)，嚴(yán)重影響了 FM03酶的功能，從而使肝臟中的FM03不能氧化從飼料中攝取得到的三甲胺，而致使三甲胺大量沉積到蛋黃中。Q319X位點(diǎn)突變是導(dǎo)致鵪鶉蛋黃三甲胺大量沉積的遺傳決定因素。鵪鶉FM03基因的Q319X突變位點(diǎn)為T時(shí)表現(xiàn)出鵪鶉蛋魚腥味性狀，以此作為分子標(biāo)記用于檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味。本發(fā)明提供用于檢測(cè)鵪鶉FM03基因Q319X突變位點(diǎn)的引物，其核苷酸序列如SeqID NO:2和3所示。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含上述引物的試劑盒，所述試劑盒還包括Taq聚合酶、dNTPs、擴(kuò)增緩沖液中的一種或幾種。所述引物和試劑盒可用于鵪鶉蛋魚腥味檢測(cè)及鵪鶉分子育種。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的方法，是檢測(cè)鵪鶉FM03基因Q319X突變位點(diǎn)，確定FM03基因?yàn)镃C、CT或TT型；所述CC型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為純合C ;所述CT型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為雜合T/C ;所述TT型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為純合T。本發(fā)明方法包括提取鵪鶉基因組DNA，克隆FM03基因或包含鵪鶉FM03基因Q319X突變位點(diǎn)的部分片段，然后對(duì)該基因或所述部分片段進(jìn)行測(cè)序。上述部分片段是以鵪鶉基因組DNA為模板，以Seq ID NO: 2和3所示的核苷酸序列為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明為鵪鶉蛋魚腥味性狀分子標(biāo)記，加快鵪鶉蛋風(fēng)味改良提供了一種高效的分子遺傳標(biāo)記選擇方法。(2)本發(fā)明方法可準(zhǔn)確、高效地篩查出鵪鶉蛋魚腥味突變易感基因T，大大降低分子育種支出，并有效剔除生產(chǎn)中的鵪鶉蛋魚腥味問題，擴(kuò)大鵪鶉可選飼料原料范圍，降低飼養(yǎng)成本，提高鵪鶉養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。(3)本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，可在鵪鶉育種中發(fā)揮巨大作用。(4)本發(fā)明的試劑盒，用于快速檢測(cè)剔除攜帶鵪鶉蛋魚腥味性狀突變基因T的個(gè)體，為蛋鵪鶉的育種工作提供便利，在鵪鶉的育種中發(fā)揮巨大作用。


圖I為測(cè)序法檢測(cè)鵪鶉FM03基因Q319X突變位點(diǎn)基因型結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I鵪鶉FM03基因的分子克隆I.鵪鶉肝臟組織總RNA的制備采用Trizol —步法提取總RNA(I)準(zhǔn)備準(zhǔn)備Trizol、氯仿，異丙醇，75%乙醇和RNA溶解液DEPC水。
將I. 6ml Trizol提前加到2ml進(jìn)口離心管中，4°C存放1-2小時(shí)。(2)組織勻漿用研缽研磨組織樣至粉狀，然后轉(zhuǎn)移至裝有Trizol的離心管中。振蕩使組織樣盡可能溶于Trizol，至溶液澄清。室溫15-30°C放置10分鐘以上，以提高RNA得率。(3)分相在裝有裂解物的離心管中加入O. 32ml的氯仿，用力振蕩離心管上充分振蕩混勻15秒。4°C離心12000rmp，15分鐘。(4)沉淀將上清液轉(zhuǎn)移到已加入等體積的異丙醇(約O. 8ml)離心管中，輕輕顛倒離心管充分混勻，室溫放置10分鐘。4°C離心12000，12分鐘使得RNA沉淀在離心底。(5)清洗棄去上清，在含RNA沉淀的離心管中加入I毫升75%乙醇，振蕩清洗。4°C離心8000rmp，5分鐘。棄上清液，用移液槍小心吸棄殘留液。沉淀，干燥5分鐘。(6)溶解加入適量DEPC水使RNA沉淀溶解，65 °C促溶10_15min，溶解后存放于-70°C。Iml Trizol 提取的 RNA 可溶于 50-100 μ I DEPC 水中。(7)總RNA質(zhì)量檢驗(yàn)瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)0D260、0D280含量及比值。2.總RNA的純化(除去RNA中的DNA)(I)先在一個(gè)I. 5ml的離心管中加入一下成分
總 RNA (I ^ig/}.il)45·0μ1
DNase bufferΙΟ.ΟμΙ
DNase-IΙΟ.ΟμΙ
RNase1.0μ1
滅菌 ddH2.034μ1
TotalΙΟΟ.ΟμΙ(2) 37° C水浴I小時(shí)，每隔15分鐘混勻一次。(3)加入1/2體積的酚和1/2體積氯仿，混勻15分鐘。(4) 4。C, 13000rpm 離心 15 分鐘。(5)轉(zhuǎn)移水相到一新離心管中，加入等體積的氯仿，室溫混勻10分鐘。(6)4。C, 13000rpm 離心 15 分鐘。(7)轉(zhuǎn)移水相到一新離心管中，加入二倍體積的乙醇和1/10體積的3MNaAc(pH5. 2)混勻，-20 ° C沉淀2小時(shí)以上
(8) 4° C，13000rpm離心16分鐘，用75%的乙醇洗滌沉淀(9)將沉淀稍干燥后，溶于20-50 μ IDEPC水中，取出I μ I測(cè)定濃度和純度，剩余RNA保存于-80° C。3. 5' RACE 過程5' RACE 利用 Clontech 公司 SMARTer RACE cDNAAmplification Kit 擴(kuò)增基因5'端序列。5' RACE方法的基本原理是反轉(zhuǎn)錄PCR,反轉(zhuǎn)錄第一鏈用olig(dT)引發(fā)啟動(dòng)反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA第一鏈產(chǎn)物經(jīng)加尾反應(yīng)，再利用加上去的接頭與基因特異性引物進(jìn)行巢式一次和二次擴(kuò)增。具體步驟如下(I) cDNA第一鏈的合成先在一 O. 2ml滅菌的DEPC處理離心管中加入以下組分·olig (dT) (O. 5 μ g/ μ I) I μ I總RNA(I μ g/μ I)2. O μ I滅菌ddH2010. 0μ I將以上組分混勻，70°C水浴5分鐘變性RNA，冰浴速冷5分鐘，離心將溶液收集至管。按順序加入一下組分
5χ第一鏈 buffer4μ1
IOmMdNTPmix2.0 μ!
核酶抑制劑0.5μ1
MMLV-Taq Mix0.5μ1
滅菌 ddH2013μ1
Total20.0μ1將以上20 μ I混合物42° C反應(yīng)60分鐘，95° C反應(yīng)5分鐘以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。(2) cDNA第一鏈TdT加尾反應(yīng)取一 0. 2ml滅菌的DEPC處理離心管中加入以下組分
5xTDT buffer10μ1
0.1% BSA5μ IQmM dCTP2.5μ1
TdT ( 15U)Ιμ
第一鏈合成產(chǎn)物20μ1滅菌 ddH2011.5μ
Total50.0μ137 °C反應(yīng)30分鐘(3 )巢式PCR反應(yīng)第一輪PCR擴(kuò)增 用表中的基因特異性正向引物FM05rl (5_GAAGCGGGTGATGAGCAGCATGTC_3)與通用引物 5RACEP1 (5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3)擴(kuò)增加尾產(chǎn)物，O. 2ml 滅菌的DEPC處理的進(jìn)口 PCR管中依次加入以下組分
滅菌 ddH2035.0μ1
IOxTaq plus PCR Buffer5.0μ1
IOmM dNTP mix4·0μΙ
FM05rl 正向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1
5RACEP1 反向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1
Taq plus DNAPoIyrnerase ( 5 /μΙ)Ιμ
加尾產(chǎn)物Ι.ΟμΙ
Total50.0μ1將以上混合物放入已提前預(yù)熱的PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增95° C變性5分鐘；95° C變性40秒，60°C 30秒，72° C復(fù)性I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72° C延伸10分鐘，4° C保存。(4 )巢式PCR反應(yīng)第二輪PCR擴(kuò)增O. 2ml滅菌的DEPC處理的進(jìn)口 PCR管中依次加入以下組分
滅菌 CidH2O35.0μ1
IOxTaq plus PCR Buffer、 μ i OmM dNTP mix4,0μ1
FM05r2 正向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1
5RACEP2 反向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1
Taq plus DNAPolymerase ( 5υ/μ1)I ul
第一輪PCR產(chǎn)物Ι.ΟμΙ
Total50.0μ1FM05r2 正向弓丨物為(5-GGCCACGCGTCGACTAGT-3)，5RACEP2 反向引物為(5-CCACCAGCACCTTCTTCCCTCTG-3 ) ，將以上混合物放入已提前預(yù)熱的PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增95 ° C變性5分鐘；95 ° C變性40秒，60 V 30秒，72 ° C復(fù)性I分鐘，20個(gè)循環(huán)；72° C延伸10分鐘，4° C保存。4.3' RACE 過程米用利用Clontech 公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 進(jìn)行基因 3’端序列擴(kuò)增。其主要原理是先用試劑盒提供的含Poly (T)IS的接頭引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用基因特異性正向引物與接頭通用引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體操作如下(I) cDNA第一鏈的合成先在一 O. 2ml滅菌的DEPC處理進(jìn)口離心管中加入一下組
分
總 RNA (I μ^μ\)2.0μ1
3RACEPl(0.5^ig4il)Ι.ΟμΙ
滅菌 ddH20ΙΟ.ΟμΙ
Total13.0μ1將以上組分混合，70° C水浴10分鐘變性RNA，冰浴冷卻5分鐘，瞬間離心將溶液收集至管底。按順序加入以下組分
5χ第一鏈 buffer4μ1
IOniM dNTP mix2.0μ1
核酶抑制劑0.5μ1
MMLV-Taq Mix0.5μ1
滅菌 CldH2O13μ1
Total20.0μ1將以上20 μ I混合物42° C反應(yīng)60分鐘，95° C反應(yīng)5分鐘以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。(2 )巢式PCR反應(yīng)第一輪PCR擴(kuò)增
用表2-1 中的基因特異性正向引物 FM03rl (5-CCCTCTACAAATGCATTGTTCCTCCT-3)與通用引物 3RACEP2 (5-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3)擴(kuò)增 3RACEP1 引物反轉(zhuǎn)錄的 cDNA模板O. 2ml滅菌的DEPC處理的進(jìn)口 PCR管中依次加入以下組分
滅菌CldH2O35.0μ1
I OxTaq plus PCR Buffer5.0μ!
I OmM dNTP mix4.0μΙ
FM03rl 正向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1 3RACEP1 反向引物(ΙΟμΜ)2·0μ1
Taq plus DNA Polymerase ( SU/μΙ)Ιμ
cDNA第一鏈產(chǎn)物Ι.ΟμΙ
Total50.0μ1將以上混合物放入已提前預(yù)熱的PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增95° C變性5分鐘；95° C變性40秒，60°C 30秒，72° C復(fù)性I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72° C延伸10分鐘，
4° C保存。(3 )巢式PCR反應(yīng)第二輪PCR擴(kuò)增0. 2ml滅菌的DEPC處理的進(jìn)口 PCR管中依次加入以下組分
滅菌 ddH2035.0μΙ
IOxTaq plus PCR Buffer5.0μ1
IOmM dNTP mix4.0μ1
FM03r2 正向引物(ΙΟμΜ )2.0μ1
3RACEP2 反向引物(ΙΟμΜ)2.0μ1
Taq plus DNAPolymerase ( 5U/μ!)I μ
第一輪PCR產(chǎn)物Ι.ΟμΙ
Total50.0μ1FM03r2 正向引物為(5-CCGCTGGGCAGTCAAGGTGTTTC-3)，3RACEP2 反向引物為(5-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3 )，將以上混合物放入已提前預(yù)熱的PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增95° C變性5分鐘；95° C變性40秒，60° C 30秒，72° C復(fù)性I分鐘，20個(gè)循環(huán)；72° C延伸10分鐘，4° C保存。2. I. 3. 5克隆鵪鶉FM03cDNA全長(zhǎng)序列
根據(jù)RACE得到的5'序列區(qū)和3'序列區(qū)，從序列兩端設(shè)計(jì)引物按如下PCR反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增。
Pfu DNA Polymerase ( 5 U/μΙ)Ιμ
I Oxpfu Buffer^ ul
dNTP Mixture (各 2.5 mM)4μ1
模板Ιμ
FM03F (IOpM )2μ1``FM03R ( IOpM )2μ
滅菌 CidH2O36μ]
Total50μ1FM03F 為(5-CCCACTCTAAGCTCTGAAGCAAC-3)，F(xiàn)MO 3 R 為(5-GTACACAGAAGCTACTCGGTACG-3 )將以上混合物放入已提前預(yù)熱的PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增95 ° C變性5分鐘；95 ° C變性40秒，57 °C 30秒，72 ° C復(fù)性2分鐘，35個(gè)循環(huán)；72° C延伸10分鐘，4° C保存。5. PCR產(chǎn)物的切膠純化(I)待回收的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切下所需的片段，放于I. 5ml離心管中；(2)加入三倍體積的溶膠液，室溫下放置5分鐘或50°C保溫3分鐘，其間輕搖離心管數(shù)次使膠完全熔化；(3)加入10μ I玻璃奶，顛倒混勻，冰浴10分鐘，其間每2-3分鐘混勻一次，12000rpm離心30秒，吸棄上清；(4)加250 μ I漂洗液，用加樣器吹打漂洗液，輕柔地將玻璃奶懸浮混勻，12000rpm離心30秒，吸棄上清；(5)重復(fù)步驟4，吸取完漂洗液后再離心10分鐘，用Tip頭將最后一點(diǎn)漂洗液吸干凈，然后放置于37°C烘箱中干燥，直至沉淀呈白色；(6)加20 μ I洗脫緩沖液，混勻，60°C水浴5分鐘，12000rpm離心I分鐘，回收上清備用。6.連接反應(yīng)( I)連接反應(yīng)體系混勻下列組分，構(gòu)成總體積為10 μ I的連接反應(yīng)體系。一般應(yīng)使外源片段與載體的摩爾比為2 10 : I。ρGEM-T Easy載體購(gòu)自Promega。
T4 DNA連接酶2χ快速連接緩沖液5.0μ1
pGEM-T Easy 載體(50ng )I _0μ1PCR 產(chǎn)物2.0μ1
T4DNA 連接酶(3 Weiss 單位/μ )Ι.ΟμΙ
滅菌 CidH2OΙ.ΟμΙ
TotalΙΟ.ΟμΙ(2)移液器吹打連接反應(yīng)使之混勻后，14 16°C連接過夜。(3)取5μ I連接液轉(zhuǎn)化，其余于置-20°C凍存。7.轉(zhuǎn)化(I)取出凍存于_70°C的感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍。·
(2) 200μ I感受態(tài)細(xì)胞DH5a中加入5 μ I連接產(chǎn)物，冰浴30min。(3) 42°C水浴熱激90s，立即冰浴2min。(4)加 500 800μ I 液體 LB，37°C復(fù)活 30 50min。(5)鋪 ΙΟΟμ I 于含 X-gal (60 μ I/平板)的 Amp LB 平板。(6) 37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 16h。8.菌體PCR鑒定(I)挑取白色單菌落(一般2 10個(gè))，在另一塊含Amp的LB板劃線培養(yǎng)12 16h，同時(shí)挑一藍(lán)斑作對(duì)照。(2)菌體PCR反應(yīng)混勻下列組分，構(gòu)成總體積為10 μ I的反應(yīng)體系。用與第一次PCR擴(kuò)增相同的引物組合和PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。
Taq DNA 聚合轉(zhuǎn)(5 /μ])0.2μ
正向引物(2 μΜ)Ι.ΟμΙ 反向引物(2 μΜ )Ι.ΟμΙ
IOxPCR 緩沖液Ι.Ομ
Mg2+ ( 25 mM )0‘8μΙ
dNTP ( 250 μΜ )0.8μ
滅菌去離子水5.3μ1
TotalI Ομ (3)結(jié)果鑒定菌體PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，即可在凝膠成像系統(tǒng)中，依據(jù)擴(kuò)增片段的有無和大致長(zhǎng)度，檢測(cè)外源DNA片段是否插入質(zhì)粒中。9. PCR及克隆產(chǎn)物序列測(cè)定PCR產(chǎn)物或克隆菌液采用雙脫氧測(cè)序法，ΑΒΙ3730測(cè)序儀測(cè)序。10.測(cè)序結(jié)果分析測(cè)序結(jié)果用Chromas2. 23.DNAMAN5. 2. 2進(jìn)行分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,進(jìn)行序列拼接。實(shí)施例2DNA測(cè)序檢測(cè)方法的建立及多態(tài)位點(diǎn)確定
I、PCR 擴(kuò)增選擇神丹自別雌雄蛋用鵪鶉配套系父系和母系兩個(gè)純系鵪鶉為實(shí)驗(yàn)材料，取20 μ L鵪鶉抗凝全血，采用傳統(tǒng)酚仿抽提法提取血液總DNA，并用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。根據(jù)鵪鶉FM03基因的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，序列如下F primer (上游引物)5’ -GTGAAGGAATTCAGAGAAACA-3’R primer (下游引物)5’ -CTGAAACACCTTGACTGCC-3，以鵪鶉基因組DNA為模板，使用引物F primer和R primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用15 μ L反應(yīng)體系
基因組DNA (50ng)IyL ；10XPCR 擴(kuò)增緩沖液L5yL;dNTPs (4mmol/L)混合液 O. 8 μ L ;上游引物(10pmol/L)O. 3 μ L ；下游引物(10pmol/L)O. 3 μ L ；Taq DNA 聚合酶O. 3 μ L ;用ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至 15 μ L。PCR反應(yīng)條件為95°C變性5min ;循環(huán)程序?yàn)?5°C變性ls，62°C退火30s，72°C延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin02、DNA測(cè)序及序列分析將步驟I中的PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，送DNA測(cè)序公司雙向測(cè)序，得到279bp的DNA序列信息，測(cè)序結(jié)果為Seq ID No:5和6所示。Seq IDNo:5為CC基因型，Seq ID No:6為TT基因型。經(jīng)序列比對(duì)，在Q319X的C/T突變位點(diǎn)，正常型個(gè)體為CC基因型，易感型個(gè)體為TT基因型，雜合攜帶個(gè)體為CT基因型。實(shí)施例3檢測(cè)Q319X位點(diǎn)C/T突變?cè)诟赶岛湍赶等后w的分布根據(jù)實(shí)施例I的方法，對(duì)神丹自別雌雄蛋用鵪鶉配套系的父系和母系兩個(gè)純系群體檢測(cè)FM03基因Q319X位點(diǎn)C/T突變的分布情況，檢測(cè)結(jié)果如表I所示。表I FM03基因Q319X位點(diǎn)C/T突變?cè)诟赶岛湍赶等后w的分布
等位基因頻率基因型頻率
品種N
<CT CC CT TT-
父系鵪鶉88 0.69 0.31 0.44 0.49 0.07
母系鵪鶉106 0.83 0.17 0.70 0.27 0.03根據(jù)表I的結(jié)果可知，神丹自別雌雄蛋用鵪鶉配套系父系和母系群體中均檢測(cè)到了魚腥味敏感基因T及敏感基因型TT型個(gè)體，說明兩個(gè)群體鵪鶉飼喂添加4000mg/Kg的試驗(yàn)組飼料會(huì)都會(huì)有少數(shù)敏感基因型個(gè)體會(huì)產(chǎn)下高三甲胺含量的魚腥味蛋，需要利用分子育種手段剔除突變等位基因T。綜上所述，在Q319X無義突變位點(diǎn)，C為正?；?，其純合體基因型為CC ；T為魚腥味敏感基因，則其純合體基因型為TT ;雜合體基因型為CT。其中CC基因型和CT基因型鵪鶉在飼喂含有大量含量膽堿的飼料(4000mg/Kg)時(shí)，所產(chǎn)蛋黃三甲胺仍會(huì)維持在較低水平，但CT基因型仍攜帶有T易感基因；而TT基因型個(gè)體在飼喂含有大量膽堿的飼料(4000mg/Kg)，所產(chǎn)鵪鶉蛋都含有大量三甲胺的沉積，具有明顯魚腥味。通過本發(fā)明的檢測(cè)方法可發(fā)現(xiàn)攜帶有T隱性易感基因CT和TT型個(gè)體，并從群體中直接淘汰，將T易感基因從群體中剔除，使蛋的魚腥味性狀在群體中不再發(fā)生。實(shí)施例4鵪鶉蛋魚腥味敏感基因檢測(cè)試劑盒的制備本發(fā)明的試劑盒包括以下試劑(I) 2U/μ I Taq DNA 聚合酶；(2) 10XPCR 擴(kuò)增緩沖液；(3) 4mmol/L dNTPs ；(4)實(shí)施例I所用的弓丨物對(duì)； (5)ddH20試劑盒的規(guī)格為25次/盒，每盒中各組分的量為2U/μ I TaqDNA聚合酶I瓶(5(^1/瓶)，10父？0 擴(kuò)增緩沖液1瓶(20(^1/瓶)，4臟01/1 dNTPs I 瓶(200 μ I/瓶)，上下游引物各I瓶(50 μ I/瓶)和ddH20 I瓶(1000 μ I/瓶)。按上述劑量對(duì)試劑盒中的各組分進(jìn)行分裝，包裝后得到用于雞蛋溯源的試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種鵪鶉蛋魚腥味敏感基因FM03，其核苷酸序列如SEQ IDN0:1所示。
2.一種用于檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的SNP分子標(biāo)記，其為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)，所述Q319X突變位點(diǎn)為鵪鶉FM03基因的第992位堿基處的C/T堿基突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述Q319X突變位點(diǎn)為T時(shí)表現(xiàn)出鵪鶉蛋魚腥味。
4.用于檢測(cè)權(quán)利要求2或3所述Q319X突變位點(diǎn)的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物，其核苷酸序列如SeqID N0:2和3所示。
6.含有權(quán)利要求4或5所述引物的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液中的一種或幾種。
8.權(quán)利要求I所述基因、權(quán)利要求2或3所述SNP分子標(biāo)記、權(quán)利要求4或5所述引物或權(quán)利要求6或7所述試劑盒在檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味及鵪鶉分子育種中的應(yīng)用。
9.一種檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的方法，其特征在于，檢測(cè)鵪鶉FM03基因Q319X突變位點(diǎn)，確定FM03基因?yàn)镃C、CT或TT型；所述CC型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為純合C ;所述CT型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為雜合T/C ;所述TT型為FM03基因Q319X突變位點(diǎn)為純合T。
10.權(quán)利要求I所述基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SeqID N0:4所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及鵪鶉蛋魚腥味敏感基因及其作為分子標(biāo)記的應(yīng)用。鵪鶉蛋魚腥味敏感基因FMO3核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其Q319X突變位點(diǎn)為用于檢測(cè)鵪鶉蛋魚腥味的SNP分子標(biāo)記。本發(fā)明為鵪鶉蛋魚腥味性狀輔助分子標(biāo)記，加快鵪鶉蛋風(fēng)味改良提供了一種高效的分子遺傳標(biāo)記選擇方法。該方法大大降低分子育種支出，并有效剔除生產(chǎn)中的鵪鶉蛋魚腥味問題，擴(kuò)大鵪鶉可選飼料原料范圍，降低飼養(yǎng)成本，提高鵪鶉養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。該方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，可在鵪鶉育種中發(fā)揮巨大作用。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102899337SQ201210389140
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月15日
發(fā)明者楊寧, 鄭江霞, 墨鋒濤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)