專利名稱：一種菊花光周期敏感型基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，具體涉及菊花光周期敏感型基因FT同源基因(命 名為CmFT)，同時涉及CmFT基因在調節(jié)菊花光周期敏感性中的應用。
背景技術：
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)為菊禾斗(Asteraceae)菊屬多年生草 本花卉，是我國傳統(tǒng)名花，也是世界上重要的觀賞花卉之一，經長期的人工選育和栽培形成 了許多品種。菊花依據(jù)花期可分為夏菊(6-9月開花)、秋菊(10-11月開花)、寒菊(12月-翌 年1月開花)、四季菊(四季開花)等四個類型。目前栽培的菊花主要是秋菊，其它季節(jié)的 菊花品種相對較少，存在花期相對集中、花期短等問題，影響了菊花的周年生產和應用范圍 的擴大，依靠人工遮光、補光等措施調控花期易導致花卉品質下降，增加生產成本。人們通過常規(guī)育種方法選育日中性菊花品種，從而解決菊花周年生產等問題，但 仍存在品種單一、性狀遺傳不穩(wěn)定等問題。某些日中性菊花品種開花生理的研究對選育日 中性菊花品種具有一定的指導意義。通過分子育種方法結合常規(guī)育種手段定向選育日中性 菊花品種無疑更具普遍意義。轉入外源基因的菊花改變花期的研究表明通過分子育種培育 新品種的可行性，然而有關菊花日中性分子機理的研究仍未見報道。近年來，隨著一些植物光周期不敏感相關基因的定位、克隆和功能驗證，人們對日 中性的形成機理有了更深的認識，這無疑對菊花日中性的分子機制研究和新品種選育提供 了契機。為了滿足菊花適時、適地開花的要求，可以通過分離菊花光周期不敏感相關基因， 研究其分子調控機制，并在菊花中導入控制花期的關鍵基因，以達到改變花期的目的。光周期是白天與黑夜的周期循環(huán)，是調控開花的主要環(huán)境因子之一。光周期現(xiàn)象 (Photoperiodism)是生物體適應光周期變化而發(fā)生的各種生理反應現(xiàn)象。1920年，戈納 (Garner W. W.)與阿拉德(Allard H. A.)首先證實日照長度是影響一年生煙草開花的關鍵 因素，之后在莖的伸長、休眠、落葉等生理反應中觀察到光周期現(xiàn)象。許多植物日長控制開花時間的生理研究都支持外部同步模型，這表明日長響應的 分子基礎是外部光信號和內部晝夜生理節(jié)律的相互作用。在植物上主要通過兩類基因加以 分析擬南芥CONSTANS(CO)或水稻同源基因Heading datel (Hdl)，編碼B_box鋅指蛋白； 擬南芥FLOWERING LOCUS T(FT)或水稻同源基因Heading date 3a (Hd3a)，編碼小分子轉 錄輔酶。相關研究表明，受光周期調控的CO峰形及表達量的改變對FT表達閾值的變化起 關鍵性作用，此外其它一些蛋白如擬南芥PHYT0CHR0ME AND FLOWERING TIME 1、水稻Early heading date 1等也分別參與了植物光周期遺傳調控，且獨立于CO(Hdl)對FT(Hd3a)起作 用；植物光敏感性機制正是通過一系列分子調控過程最終通過FT影響植物光周期特性。在擬南芥中FT首次被克隆鑒定，被認為是一個轉錄輔助因子。自從1996年報道 CO在莖頂中積累開始，目前主要的關注點已在光周期信號下游的過程。一個主要進展是發(fā) 現(xiàn)FT的表達量不僅在長日照下很高，而且呈現(xiàn)生物循環(huán)節(jié)律，在24h循環(huán)周期的后半時達最高峰。在短日照下FT表達量微乎其微，但是從短日照轉移到長日照誘導成花的條件下依 賴CO的FT立即被誘導，再放回短日照下便引起FT表達量的下降。這些現(xiàn)象說明日長在FT 的積累中起重要作用。與FT相反，CO在長日照和短日照下均容易被檢測出來，CO表達量循環(huán)振蕩，但與 日長不相關。無論在長日照或短日照下，在夜間均有一峰值，但在長日照光照后半段有個次 峰。CO表達沒有引發(fā)FT的積累表明CO/FT分子機制可能是外部一致模型的核心。Yanovsky和Kay研究tocl突變體間接地支持CO/FT分子機制可能是外部一致模 型的核心。此外，Roden等進行了不同日照長度的處理，證實了把CO峰值置于光照下促進 野生型植物在短日照下開花。高表達量CO蛋白處于光照條件下FT才受誘導表明CO活性 是在轉錄后調控的。通過一系列實驗，GeorgeCoupland研究組闡明遠紅外和藍光(分別被 光敏色素A和隱花色素2所感應)通過抑制依賴激酶的CO降解來調控CO蛋白的穩(wěn)定性。 因此，Burming所指出生物節(jié)律產生的光感應開花調控因子確實存在，即CO蛋白。在夜間， CO可能通過SPA蛋白結合激酶，該激酶反過來與E3泛素連接酶COPl互相作用在菊花中分離和鑒定FT同源基因，并對其結構及功能進行分析，探討菊花中CO/ FT分子機理，有利于從分子水平上了解菊花光周期控制花發(fā)育的機制。然而，到目前為止， 還沒有有關菊花光周期敏感型基因的相關報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種菊花光周期敏感型基因，其為FT同源基因(命名為 CmFT)，屬于FT亞家族成員。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述光敏感基因CmFT在培育日中性菊花新品種中 的應用。本發(fā)明采用同源基因克隆法結合RACE技術，從菊花中分離了 FT同源基因CmFT，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，開放閱讀框為525bp，編碼174個氨基酸，該氨基酸序列如 序列表SEQ ID No. 2所示，其包含F(xiàn)T類蛋白保守基序和兩個關鍵性氨基酸殘基，進化樹分 析表明CmFT屬于FT亞家族成員。應當理解，本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明 蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有 同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術 人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發(fā)明的基因和蛋白質可以從地被菊中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成 的方法得到。可將本發(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明蛋白的重組表達 載體，進而可以通過諸如農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等轉基因方法，將所述表 達載體導入宿主，得到轉CmFT基因的轉化體。本發(fā)明通過對CmFT的克隆、鑒定及表達分析，表明CmFT與菊花光周期敏感性密切 相關，在光周期促進開花中發(fā)揮一定的作用。本發(fā)明采用基因超表達或反義技術轉化模式植物擬南芥和菊花，驗證CmFT的功能，結果表明，同野生型植株相比，花期均提前，在短日 照條件下可提前7d開花，在長日照條件下提前8d開花，擬南芥蓮座葉的葉片數(shù)相應地減 少。


圖1.CmFT基因的基因組結構圖。
圖2.不同雙子葉植物FT/TFL1蛋白系統(tǒng)進化樹。
圖3.植物正義表達載體PBI-CmFTf的構建。
圖4.植物反義表達載體PBI-CmFTr的構建。
圖5.擬南芥Kan抗性植株的篩選。
圖6.轉CmFT擬南芥花結構表型，其中，A中左盆為長日照處理30d時野生型擬南
芥，右盆植株為轉正義CmFT擬南芥；B為A圖的直立拍照圖；C、D、E為轉CmFT擬南芥在短 日照處理45d、50d、60d的花結構表型。圖7.菊花G418抗性植株的篩選。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1. CmFT基因的分離和鑒定方法1.材料選擇試驗材料葉片及花蕾混合物取自地被菊品種‘七月桃花’，于-80°C超低溫冰箱中 保存?zhèn)溆谩?.設計引物除RACE試驗中通用引物為試劑盒附帶以外(3’RACE通用引物序列如3’Full RACE Core Set Ver. 2. 0說明書、5，RACE通用引物序列如SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit
說明書)，其余各基因引物序列見下表。
3.總RNA、DNA的提取及電泳分析A.總RNA的提取(采用液氮研磨法)1)取500 μ L裂解液RLT，轉入1. 5mL離心管中，加入5 μ L β -巰基乙醇至終濃度 為1 %，再加入50 μ L PLANTaid混勻備用。2)液氮中研磨適量植物組織(葉片及花蕾混合物)成細粉后，取約為50mg細粉轉 入上述裝有裂解液的離心管，立即用手劇烈振蕩20s，充分裂解，再用電動振蕩機勻漿30s， 以剪切DNA，降低粘稠度和提高產量。3)將裂解物室溫下13，000r/m離心Smin (溫度條件下同)，沉淀不能裂解的碎片 和結合有多糖多酚的PLANTaid，將所有裂解物上清轉到一個新離心管(避免接觸沉淀物)， 加入0. 5體積的無水乙醇，立即吹打混勻，不要離心。4)將混合物加入一個吸附柱RA中，13，000r/m離心60s，去掉廢液。5)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m離心30 60s，棄廢液， 將吸附柱放回收集管中。6)取 61 uL RNase free ddH20,依次力口 入 8ul IOXReaction BufferU ulRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor^10 ul RNase-Free DNaseI 于RNasefree 離心管中，輕柔混勻配制成DNase I工作液，向吸附柱RA中央加入80 μ L的DNase I工作 液，室溫放置15min。7)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m離心60s，棄廢液，將吸附
柱放回收集管中。8)加0. 5mL漂洗液RW(請先檢查是否已加入乙醇)，12，000r/m離心30s，棄廢液， 加入0. 5mL漂洗液RW，重復一遍。9)將吸附柱RA放回空收集管中，13，000r/m離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗 液中殘留乙醇抑制下游反應。10)取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預期RNA產量在吸附膜 的中間部位加30 50 μ L RNase free ddH20(事先在65 70°C水浴中加熱效果更好)， 室溫放置2min，12，000r/m離心Imin收集總RNA。B.總DNA的提取
1)取新鮮葉片幼嫩組織IOOmg于研缽中，加入液氮充分研磨，加入400 μ L緩沖液 LPl和6μ L RNase A(10mg/mL)混合液，漩渦振蕩lmin，室溫放置lOmin，加入130 μ L緩沖 液LP2，充分混勻，漩渦振蕩lmin。2)常溫下12，OOOr/m離心5min(溫度條件下同)，將上清移至新離心管中。3)加入1. 5體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中，12，000r/m離心30s， 去掉廢液，吸附柱放回收集管中。5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW(已加入無水乙醇)，12，000r/m離心30s，棄
廢液，將吸附柱放回收集管中。6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30s，棄廢液。7)將吸附柱放回收集管中，12，000r/m離心2min，棄廢液，將吸附柱置于室溫下 lOmin，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。8)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加80 μ L 洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2 5min，12，000r/m離心2min，收集溶解物。C.電泳分析取5 μ L總RNA或總DNA放置于含Gel rad染料的1. 0%瓊脂糖凝膠點樣孔上，在 電泳緩沖液為ι χ TAE，電壓為5V/cm條件下電泳30min，后在凝膠成像儀上觀察樣品的完整 性、電泳條帶的清晰度，并進行拍照。4.總RNA的逆轉錄反應1)在冰浴的 PCR管中依次加入 Iyg 總 RNA、ly L olig(dT) 18 primer (0. 5 μ g/ μ L)、RNase-free ddH20 加至 12 μ L,混勻后離心；2) 65°C溫浴5min，冰上冷卻；3)依次加入 4 μ L5 X Reaction BufferU μ L RiboLock RNase Inhibitor (20U/ μ L)>2μ L dNTP Mix(IOmM)，1 μ L RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase(200U/ μ L)，混勻后離心；4) 42°C溫浴60min，而后70°C溫浴5min，冰上冷卻，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. CmFT基因全長的克隆A. CmFT基因保守區(qū)序列的獲得根據(jù)設計好的引物列表中FT同源基因的序列設 計引物FT-F和FT-R，以已經合成的cDNA為模板進行PCR擴增；B. CmFT基因 3，端 RACE序列的獲得使用 Takara 3'-Full RACE Core SetVer. 2. 0 試劑盒擴增CmFT基因3’端序列，其中CmFT基因3’端的擴增引物為引物設計列表中的一 對正向引物CmFT3' -Fl和CmFT3' _F2，按照試劑盒使用說明書分別進行3’ RACE巢式擴 增；C. CmFT 基因 5，端 RACE 序列的獲得采用 SMART RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)擴增CmFT基因5’端序列，其中CmFT基因5’端的擴增引物為引物設計列表 中的一對反向引物CmFT5 ‘ -Rl和CmFT5 ‘ -R2，進行5，RACE擴增；D. CmFT基因全長的獲得與序列分析根據(jù)CmFT基因保守區(qū)、3’端和5’端RACE序 列拼接結果設計一對跨越ORF框的特異引物CmFT-F和CmFT-R，以已經合成的cDNA為模板 進行PCR擴增，回收特異片段，并進行T-A克隆與測序。
PCR反應體系
__體積W
5 χ Green Buffer5.0
MgCl2(25 mM)2.0
Taq(5U/pL) Total
0.15 252) PCR擴增程序如下PCR反應條件 6. CmFT基因組內含子的擴增根據(jù)已報道的FT同源基因外顯子及內含子特征，設計跨越可能存在的三個內含 子區(qū)域的引物，分別為 CmFT-Fl 與 CmFT-Rl、CmFT-F2 與 CmFT_R2、CmFT_F3 與 CmFT_R3，進行 CmFT基因內含子的擴增。7.回收PCR產物特異片段，并進行T-A克隆與測序A. PCR產物的回收采用Tiangen離心柱型普通凝膠回收試劑盒，按照產品說明書方法略加修改，室 溫條件下操作，具體步驟如下1)離心柱預平衡向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L平衡液 BL，12000r/m離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入無菌離心管中，稱取重量。3)向膠塊加入3倍提交溶膠液PN:當回收的目的片段< 150bp時使用6倍體積溶 膠液PN(如凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ L，依次類推)。50°C水浴放置lOmin，其間 不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶膠塊，可再補加一些溶膠 液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解，室溫下冷卻。
4)將上一步所得溶液加入一個預平衡吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000r/m離 心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。5)向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW(已加入無水乙醇)，12000r/m離心30s， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中，重復漂洗一次。注如果回收的DNA是 用于平末端連接實驗或直接測序，在加入PW時選擇靜置5min后再離心。6)將吸附柱CA2放回收集管中，12000r/m離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱 CA2置于室溫放置5 lOmin，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。7)將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩 沖液EB，室溫放置2 5min，12000r/m離心2min收集DNA溶液。B. PCR產物的克隆與鑒定1)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備a)-80°C保存的Escherichia coli T0P10接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16 20h。b)挑取固體培養(yǎng)基平板上新活化的單菌落接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振 蕩培養(yǎng)10 12h。c)取ImL新鮮菌液轉接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2. 5 3. 0h，使 OD6tltl 在 0.6 0.9。d)將新鮮培養(yǎng)液轉入預冷的50mL離心管中，置冰上20min，4°C，5000r/m離心 IOmin0e)棄上清，加預冷的0. IM CaCl220mL，輕輕吹打，冰上放置30min，4°C下5000r/m 離心IOmin0f)棄上清，加入2. 5mL預冷的含20 25%甘油的0. IM CaCl2溶液，輕輕吹打混 勻，按每管100 μ L分裝，-80°c保存?zhèn)溆谩?) PCR產物與T載體的連接與轉化a)在冰浴的PCR管中配制下列反應溶液，總體積為10. 0 μ L，混勻，16°C連接反應 過夜。 取5μ L加入至50μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受態(tài)細胞，冰中靜置30min。b)42°C溫浴90s，取出立即置于冰中靜置3min。c)加入400yL 37°C預熱的無抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C，150r/m振蕩培養(yǎng)45min。d)取 100 μ L 菌液加入預先涂有 16 μ L 的 5% IPTG、40 μ L 的 2% X-gal 的 LBApr 固 體瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)13h或過夜，形成藍白斑單菌落。3)重組子篩選及插入片段的菌液PCR檢測挑取白斑單菌落，接菌于LB-液體培養(yǎng)基中，37°C，150r/m，振蕩培養(yǎng)8h或過夜。 菌液PCR反應液體系及反應條件同以cDNA或DNA為模板的PCR反應液體系及反應條件相 同。8. CmFT基因生物信息學分析分析CmFT基因全長序列所翻譯的氨基酸序列，并與擬南芥FT/TFL1家族和部分雙 子葉植物的同源序列進行比對。使用MEGA 4.0軟件按鄰接法構建雙子葉植物FT類似蛋白 系統(tǒng)進化樹。實驗結果1.菊花CmFT基因cDNA全長的獲得本發(fā)明根據(jù)GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫和 EST 庫(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ Genbank/)中檢索FT同源基因序列，用在線Blast軟件分析它們的同源性。依據(jù)FT同源 基因的保守區(qū)域，通過Oligo 6、Primer Premier 5軟件分別設計一對引物FT-F和FT-R， 預計擴增出FT cDNA保守區(qū)片段的大小為180bp與900bp左右。將PCR產物回收、純化后 進行T-A克隆，菌液PCR檢測后進行測序，獲得了大小分別為183bp和890bp的保守區(qū)序 列。根據(jù)已知FT同源基因保守區(qū)序列分別設計了正向特異引物CmFT3' -Fl和巢式引物 CmFT3 ‘ -F2，分別與 Takara 3，-Full RACE Core Set Ver. 2· 0 試劑盒接頭引物 3，RACE Outer Primer,3' RACE Inner Primer進行巢式PCR擴增，分別獲得了菊花FT同源基因3’ 端序列大小為386bp和307bp。根據(jù)已知FT同源基因保守區(qū)序列分別設計了反向特異引物 CmFT5 ‘ -Rl 和巢式引物CmFT5' -R2，分別與 Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒接頭引物UPM、NUP進行PCR擴增，對特異產物進行T-A克隆并測序，獲得了目的 大小分別為370bp和403bp的5，端序列。根據(jù)所獲得的菊花FT同源基因保守區(qū)、3，RACE 和5，RACE序列拼接結果設計一對特異弓I物CmFT-F和CmFT-R，進行PCR擴增，對特異條帶進 行回收純化、T-A克隆后進行測序，獲得了大小為623bp的全長序列(其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示)，進一步驗證了 3’與5’端擴增序列同屬一個基因來源(命名為CmFT)。2.菊花FT基因結構分析根據(jù)已報道的FT同源基因外顯子及內含子特征，分別在所獲得的菊花FTcDNA全 長序列內設計三對引物，以菊花基因組DNA為模板，進行PCR擴增。為了對擴增產物的序列 進行拼接，三對引物跨過的cDNA序列均有部分重疊區(qū)域。三對引物擴增出三條長度分別為 310bp、1600bp、700bp左右的條帶。根據(jù)得到的序列與已知cDNA序列進行拼接顯示菊花 FT基因組轉錄區(qū)全長為2812bp，由3個內含子和4個外顯子構成。內含子一長為116bp，內 含子二長為1545bp，內含子三長為626bp，剪切位點符合“GT-AG”法則；3. CmFT生物信息學分析根據(jù)所獲得CmFT全長序列的測序結果，通過DNAman軟件分析表明該基因包含一 個開放閱讀框525bp，編碼174個氨基酸和一個終止子。BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi)比對分析表明，該基因與楊屬(Populus)、葡萄(Vitis vinifera)等大多數(shù)雙子葉植物FT同源基因的同源性可達75%以上。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)CmFT中 包含區(qū)分FT和TFLl蛋白亞家族的關鍵氨基酸殘基酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)和14個保守 氨基酸基序(LGRQTVYAPGffRQN)和LYN/IYN三聯(lián)體蛋白序列(Ahn et al.，2006)。實施例2. CmFT因的遺傳轉化利用植物表達載體pBI121為基本骨架，構建了 CmFT正反義表達載體，分別命名 為pBI-CmFTf和pBI-CmFTr。正義表達載體pBI-CmFTf在目的基因兩端引入特異性酶切位 點Xba I與Sma I，反義表達載體pBI_CmFTr在目的基因兩端引入反向酶切位點Sma I與 Xba I，通過RT-PCR對目的基因CmFT進行高保真擴增，連接到pGM_T中間載體，分別雙酶切 PBI121和中間載體，回收載體大片段和目的片段，然后進行定向粘端_平末端的連接及酶 切鑒定。1.目的片段的擴增根據(jù)CmFT基因序列，設計合成跨越CmFT ORF的正義和反義兩對分別含Xba I與 Sma I酶切位點的引物。正義引物對跨度622個核苷酸，反義引物對跨度624個核苷酸。引 物序列如下正義引物對primer1 :5' -CGTCTAGAGCCCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 2:5' ~AACCCGGGTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘反義引物對primer3 :5' -TTCCCGGGTCTCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 4:5' ~ATTCTAGACCTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘粗體劃線部分表示在引物5’端引入酶切位點。1)反應體系如下PCR反應體系

2) PCR擴增程序如下PCR反應條件 2. PCR回收產物與pGM-T的連接與轉化a) PCR離心管中配制反應溶液(表5_1)，混勻離心，16°C連接反應過夜。b)取 5 μ L 連接產物 pGM-CmFTf 或 pGM-CmFTr 加至 50 μ L Ε. coliTOPIO 感受態(tài)細 胞中，冰中靜置30min。c)42°C溫浴90s，取出立即置于冰中靜置3min。d)加入400 μ L無抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C，150r/m振蕩培養(yǎng)45min。 e)取 100 μ L 菌液加入預先涂有 16 μ L 5% IPTG、40 uL 2% X-gal 的 LBApr 固體瓊 脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h或過夜，形成藍白斑單菌落。3.質粒 DNA 的提取(TIAN prep Mini 試劑盒)a)柱平衡步驟向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L的平衡液 BL，12，000r/m離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。b)取1 5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12，OOOr/ m離心lmin，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管 中)。c)向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ L溶液Pl (請先檢查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。注意如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。d)向離心管中加入250 μ L溶液Ρ2，溫和地上下翻轉6_8次使菌體充分裂解。注 意溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質粒中混有基因組DNA片 斷。此時菌液應變得清亮粘稠，所用時間不應超過5min，以免質粒受到破壞。如果未變得清 亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。e)向離心管中加入350 μ L溶液P3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時 將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12，000r/m離心lOmin，此時在離心管底部形成沉淀。注意P3加入 后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。f)將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管 中)，注意盡量不要吸出沉淀。12，OOOr/m離心30 60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。g)向吸附柱CP3中加入50(^1^去蛋白液卩0，12，00017/111離心30 608，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。h)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30 60s，倒掉收集管
中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。i)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30 60s，倒掉收集管
中的廢液。j)將吸附柱CP3放入收集管中，12，000r/m離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂
洗液去除。k)將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50 100 μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12，000r/m離心Imin將質粒溶液收集到離心管中。4.質粒的酶切提取質粒DNA 并用 Sma I 和 Xba I 分別單酶切 pGM-CmFTf、pGM-CmFTr 和 pBI121 質粒DNA。取200 μ LPCR離心管，依次加入以下試劑 25°C條件下先用Sma I酶切3 4h，然后在原體系中加Xba I于37°C下繼續(xù)酶切 3 4h。5.酶切產物的回收及檢測6.酶切產物的連接與轉化a)在PCR離心管中配制下列反應溶液，混勻離心，在22°C連接反應2h，繼而在4°C 連接反應48h。
質粒DNA IOx NEB Buffer 4 Sma I 或 Xba I
BSA CldH2O (雙蒸水) Total
20 5 2
0.5 22.5 50
組分
體積OiL)
目的片段 IOx Ligation Buffer pBI121酶切回收產物 T4 DNA Ligase(3U L) Totalb)取_80°C保存的50 μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受態(tài)細胞，冰上融化。c)加入5μ L連接產物，輕輕旋轉混勻，冰浴30min。d)42°C熱擊 90s，迅速冰浴 3min。
e)加入400 μ 1不含抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。f)取150 200 μ 1培養(yǎng)液涂布于固體LB培養(yǎng)基上(含100 μ g/mL Kan)，37°C培 養(yǎng)16 24h。7.重組質粒的篩選與鑒定無菌條件下，隨機挑取含100 μ g/mL Kan的LB平板上的單菌落，接種于IOmL含 100 μ g/mL Kan的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)10 12h。通過PCR初步確定為陽性克 隆，再繼續(xù)做酶切鑒定，并把含陽性克隆的菌液加甘油(終濃度25%)于-80°C保存?zhèn)溆?。根?jù)正義引物對(primer 1和primer 2)，反義引物對(primer 3和primer 4)分 別對正義表達載體ρΒΙ-CmFTf和反義表達載體pBI-CmFTr進行PCR鑒定a) PCR反應體系 注*視不同引物略有改動。8.重組植物表達載體導入受體農桿菌A.農桿菌感受態(tài)的制備1)從平板中挑取農桿菌LBA4404單菌落接種于含100 μ g/mL利福平的IOmL LB液 體培養(yǎng)基中，28°C，200r/m震蕩培養(yǎng)約20h。2)把上述培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物按1 100轉接入液體LB培養(yǎng)基中，28°C，200r/m繼 續(xù)震蕩培養(yǎng)約4 6h，使農桿菌OD6tltl值約為0. 3 0. 5。3)將菌液倒入預冷的無菌離心管中，冰浴20 30min，4°C，5000r/m離心lOmin，
棄上清。4)加入 20mL 預冷的 0. IM CaCl2 和 0. 05M MgSO4 液，懸浮菌體，冰浴 30min。4°C，
145000r/m離心lOmin，棄上清。5)加入預冷的ImL含20 25%甘油的0. IM CaCl2和0. 05M MgSO4溶液，懸浮菌 體。按每管150 μ 1分裝于離心管中，液氮速凍1 2min，于-80°c保存?zhèn)溆?。B.液氮凍融法轉化農桿菌取_70°C保存的農桿菌LBA4404感受態(tài)細胞置于冰上融化，分別加pBI-CmFTf、 pBI-CmFTr質粒DNA5 μ 1于感受態(tài)細胞中，旋轉混勻，冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C 熱擊5min，迅速放置冰上2min，然后加入800 1000 μ 1液體LB培養(yǎng)基(不含抗生素)， 280C 140 160r/m振蕩培養(yǎng)4 5h使農桿菌復蘇。取300 μ 1培養(yǎng)液均勻涂布于含IOOyg/ mL利福平和100 μ g/mL Kan的平板上，待菌液被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)2d 左右ο9.陽性克隆的篩選和鑒定當單菌落長出后，隨機挑取單菌落接種于含100 μ g/mL利福平和100 μ g/mLKan的 液體LB培養(yǎng)基中，于28°C，200r/m振蕩培養(yǎng)1 2d，做PCR和酶切鑒定。實施例3.對光敏感基因CmFT的應用1. CmFT導入擬南芥進行功能驗證采用哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(A. thaliana ecotype Columbia)作為轉化群體，栽 植于泥炭與蛭石(體積比為1 1)的混合生長介質中，置于培養(yǎng)溫度為22 24°C，濕度 為60 70%，光照周期為16h/8h (光/暗)，光照強度為30001UX的光照培養(yǎng)箱中。把已 構建好的植物表達載體pBI-CmFTf的農桿菌株LBA4404采用花器浸泡法轉化模式植物擬南 芥，篩選抗性植株，并進行分子鑒定和表型分析。1)分別以擬南芥總DNA、陰性對照野生型擬南芥總DNA、陽性對照質粒DNA為模板， 在 CmFT 和 GUS 內部設計一對特異引物 CmFT-⑶Sl CAGCGACAACAGGAGCACAG 和 CmFT-⑶S2 ACCGCATCGAAACGCAGCAC 進行 PCR 擴增反應。按 Promega GoTaq Flexi DNAPolymerase 使用 說明，建立反應體系，進行電泳分析，結果顯示陰性對照無擴增條帶，陽性對照質粒能擴增 出605bp的條帶，在所檢測的14個抗性植株中，有12株能擴增出與陽性對照大小相符的條 帶，為PCR陽性植株，但有2株存在假陽性，初步表明CmFT已經轉入擬南芥基因組中，獲得 了轉基因植株；2)將轉基因子代Tl和對照野生型擬南芥種子播種于泥炭與蛭石(體積比為 1 1)的混合生長介質中，于長日照16h/8h(光/暗)和短日照8h/16h(光/暗)條件下 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22 24°C，濕度為60 70%，光照強度為30001ux。通過觀察和比較發(fā) 現(xiàn)，無論在長日照(LD)或短日照(SD)條件下，擬南芥轉化植株Tl代種子播種苗的花期與 野生型擬南芥相比，其花期均提前，在短日照條件下可提前7d開花，在長日照條件下提前 8d開花，擬南芥蓮座葉的葉片數(shù)相應地減少，在SD和LD下轉化植株均少于野生型擬南芥， 然而，轉CmFT擬南芥花序及花結構表型與野生型擬南芥未觀察到有明顯變化。2. CmFT轉化菊花的應用選取地被菊品種‘玉人面’和‘美矮粉’(種植于北京林業(yè)大學胖龍溫室)，取腳芽 嫩枝上部莖段，用自來水沖洗10 15min，75%乙醇消毒30s，0. 1 %升汞消毒6min，無菌水 洗滌3 4次，接種于MS培養(yǎng)基上誘導莖段腋芽萌發(fā)，20d后接種無菌莖段于生根培養(yǎng)基獲 得無菌苗作為轉化群體。建立了短日照菊品種‘美矮粉’的高效再生體系及選擇壓臨界濃度，利用已構建好的正反義表達載體pBI121-CmFTf和pBI121_CmFTr通過農桿菌介導法轉 化菊花植株，利用抗生素篩選抗性植株并進行分子的初步鑒定。結果分別獲得了 8和10株 轉基因植物，與野生型相比，過表達轉基因植株的開花期顯著提前，而抑制表達轉基因植株 的開花期顯著延遲。
權利要求
菊花光周期敏感蛋白CmFT，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權利要求1所述蛋白的菊花光周期敏感基因CmFT。
3.如權利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.權利要求2或3所述基因在菊花品種選育中的應用。
7.權利要求2或3所述基因在調節(jié)擬南芥或菊花開花周期中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及菊花光周期敏感型基因CmFT，同時涉及CmFT基因在菊花光周期敏感性中的應用。本發(fā)明采用同源基因克隆法結合RACE技術，從菊花中分離了FT同源基因CmFT，該基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，CmFT屬于FT亞家族成員。CmFT與菊花光敏感性相關，通過遺傳轉化，將基因轉入模式植物擬南芥和普通菊花品種，結果表明，該基因能夠調節(jié)菊花的光周期，促進開花。
文檔編號C12N5/10GK101921322SQ201010255730
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月18日 優(yōu)先權日2010年8月18日
發(fā)明者張啟翔, 潘才博, 石少川, 蔡明 , 高亦珂 申請人:北京林業(yè)大學