專利名稱：植物的光周期敏感性基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與植物的光周期敏感性有關(guān)的基因，以及用這些基因改變植物的光周期敏感性的方法。改變植物的光周期敏感性的方法對(duì)植物品種改良十分有用。
背景技術(shù)：
一般情況下，水稻的抽穗(開(kāi)花)在短晝(short-day)時(shí)提前而長(zhǎng)晝(long-day)時(shí)延遲。在已知的栽培品種中，通常是那些來(lái)自九州島和日本大陸南部的品種具有較強(qiáng)的光周期敏感性，而來(lái)自Tohoku區(qū)或Hokkaido的品種完全喪失了這種敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生長(zhǎng)期后有特征性的開(kāi)花，該植物的抽穗期不隨光周期的改變而變化。水稻植物對(duì)栽培地點(diǎn)和時(shí)間的適應(yīng)性根據(jù)該植物中光周期敏感性的存在而徹底不同。因此，改變水稻的光周期敏感性對(duì)于水稻品種改良十分重要。
在常規(guī)品種改良項(xiàng)目中，水稻抽穗期通過(guò)涉及以下方面的方法來(lái)改變(1)通過(guò)雜交選擇早熟品種或晚熟品種；和(2)通過(guò)輻射和化學(xué)試劑進(jìn)行誘變；等。但是，這類(lèi)品種改良項(xiàng)目的成功需要較長(zhǎng)時(shí)間，并存在其它問(wèn)題，如不能預(yù)計(jì)后代中突變的程度或方向。
“光周期敏感性基因”是在水稻遺傳學(xué)領(lǐng)域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名稱。已發(fā)現(xiàn)多個(gè)光周期敏感性基因的存在在突變體和栽培品種中是固有的，還提示光周期敏感性基因存在于，例如，Se1基因座(6號(hào)染色體；Yokoo和Fujimaki(1971)Japan.J.Breed.2135-39)，E1基因座(7號(hào)染色體；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51115-128；Okumoto，Y.et al.(1992)Jpn.J.Breed.42415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3號(hào)染色體？；Okumotoet al.Japanese Society of Breeding，9lst lecture，Japanese Journal of Breeding47(Suppl.1)31)；和其它類(lèi)似基因座(Yamagata et al.(1986)In Rice genetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。
分離水稻的光周期敏感性基因使得能通過(guò)轉(zhuǎn)化方法將這些基因?qū)肴我馄贩N，從而改變這些品種的光周期敏感性，并最終能調(diào)節(jié)水稻的抽穗期。因此，用這些基因進(jìn)行品種改良是一種相對(duì)于傳統(tǒng)方法而言特別有效并且簡(jiǎn)單可靠的方法。
但至今未見(jiàn)關(guān)于水稻光周期敏感性基因的分離的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本領(lǐng)域的上述需要導(dǎo)致本發(fā)明，本發(fā)明的目的是提供新的植物光周期敏感性基因，尤其是來(lái)自水稻的基因。本發(fā)明另一目的是用這些基因改變植物的光周期敏感性，從而改變植物的開(kāi)花時(shí)間。本發(fā)明的另一目的是提供評(píng)價(jià)植物的光周期敏感性的方法。
本發(fā)明人關(guān)注于需要通過(guò)簡(jiǎn)單方法改變其抽穗期的那些水稻，并進(jìn)行了深入研究以分離與水稻光周期敏感性基因相關(guān)的基因。
從Nipponbare和Kasalath雜交的后代中鑒定出了一種定量特征基因座Hd1，它位于6號(hào)染色體上。此外，用近似純合系對(duì)具有Nipponbare遺傳背景的Hd1區(qū)(Kasalath的等位基因)進(jìn)行了分析(Yamamoto et al.(1996)Abstract for Plant Genome IV.p124)，揭示Hd1基因座與光周期敏感性相關(guān)(Lin et al.(1999)Abstract for Plant Genome VII，p160；Yano et al.Breedingscience.Supplement，47(2)，p224)。此外，考慮到染色體上的位置，有觀點(diǎn)認(rèn)為Hd1可能與以前報(bào)道的光周期敏感性基因座Se1位于相同的基因座上；但迄今沒(méi)有直接證據(jù)。
本發(fā)明人首先對(duì)Hd1基因區(qū)進(jìn)行連鎖分析并與酵母人工染色體(YAC)克隆進(jìn)行對(duì)比排列，以便分離出光周期敏感性基因Hd1(盡管已證實(shí)它的存在，但從未被鑒定過(guò))。
具體地，本發(fā)明人對(duì)一個(gè)大的、隔離的群體進(jìn)行了連鎖分析，這種分析是分離Hd1基因所必需的。連鎖分析用集中取樣法進(jìn)行。還利用與在水稻基因組研究項(xiàng)目(Rice Genome Research Program，RGP)中構(gòu)建的YAC克隆進(jìn)行對(duì)比排列來(lái)確定Hd1基因座周?chē)腨AC克隆。此外，還分離到所測(cè)定的YAC克隆Y4836的末端DNA片段，并作為RFLP標(biāo)志進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YAC克隆Y4836包含Hd1基因區(qū)(


圖1)。
然后，本發(fā)明人利用P1衍生的人工染色體(PAC)克隆對(duì)Hd1基因區(qū)進(jìn)行對(duì)比排列，以便限定Hd1基因的候選區(qū)。更具體地，使用通過(guò)上述分析發(fā)現(xiàn)的Hd1基因區(qū)周?chē)腄NA標(biāo)志從Nipponbare基因組文庫(kù)中選出2個(gè)PAC克隆，據(jù)認(rèn)為它們包含這些核苷酸序列。此外，通過(guò)PCR對(duì)選出的PAC克隆進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)克隆P0038C5包含對(duì)應(yīng)于S20418和Y4836R的核苷酸序列，它完全覆蓋了Hd1座位(
圖1)。
本發(fā)明人通過(guò)分析PAC克隆P0038C5的核苷酸序列，成功地將可能存在Hd1候選基因的區(qū)域定位在一個(gè)約12kb的區(qū)域。針對(duì)該候選區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行了基因預(yù)測(cè)分析和同源性搜索。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個(gè)與過(guò)氧化物酶S25391以及擬南芥(Arabidopsis)CO高度相似的區(qū)域，其中所述S25391是作為水稻EST而獲得的，所述擬南芥CO能促進(jìn)在長(zhǎng)晝條件下開(kāi)花(其被認(rèn)為是具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因)。
對(duì)預(yù)測(cè)的具有鋅指結(jié)構(gòu)域的基因是否就是Hd1基因的候選者進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在Kasalath的該候選基因區(qū)(ORF)內(nèi)11個(gè)位點(diǎn)有突變(核苷酸插入、缺失和取代)(圖2)。此外，還對(duì)se1突變系HS66和HS110及其親本品種Ginbozu的候選基因區(qū)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ginbozu的含有Se1基因的核苷酸序列與Nipponbare的相應(yīng)序列相比，除了多一個(gè)額外的36-bp序列和一個(gè)核苷酸取代，其它完全相同。與Ginbozu的核苷酸序列相比，突變品種HS66和HS110中有突變(圖2)。根據(jù)這些結(jié)果，可將具有鋅指結(jié)構(gòu)的候選基因判定為Hd1基因的潛在候選者。
而且，Hd1候選基因的表達(dá)分析表明，在一個(gè)Hd1基因區(qū)已經(jīng)被Kasalath的染色體片段取代的近似純合系(NIL(Hd1))中，表達(dá)水平顯著低于在Nipponbare中的。在Ginbozu中檢測(cè)到類(lèi)似于在Nipponbare中的轉(zhuǎn)錄水平。另一方面，在突變株HS66和HS110中發(fā)現(xiàn)了大小不同于Ginbozu中的轉(zhuǎn)錄子。考慮到轉(zhuǎn)錄與稻田中到抽穗所需的天數(shù)之間的關(guān)系，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)正常轉(zhuǎn)錄的情況中(在Nipponbare和Ginbozu中)到抽穗所需的天數(shù)增加，而在檢測(cè)到異常轉(zhuǎn)錄的情況中，到抽穗所需的天數(shù)減少(表1)。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明人得出結(jié)論所述候選基因區(qū)確實(shí)是Hd1基因，而Se1基因座與Hd1基因座是相同的。
為了證實(shí)Hd1候選基因具有賦予水稻植物以光周期敏感性的功能，通過(guò)用Kasalath的光周期敏感性基因取代Nipponbare的相應(yīng)區(qū)，而將一個(gè)攜有該基因的基因組區(qū)導(dǎo)入缺乏光周期敏感性的品種中。結(jié)果在整合了所述候選基因的植株中，抽穗在短晝條件下提前。由于一般情況下，抽穗在短晝條件下提前是由于光周期敏感性高，因此認(rèn)為Hd1候選基因具有提高光周期敏感性的功能。
換而言之，本發(fā)明人成功分離出一種與植物的光周期敏感性相關(guān)的基因。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用該基因可改變植物的光周期敏感性，和評(píng)價(jià)植物的光周期敏感性，因此完成本發(fā)明。
更具體地，本發(fā)明提供(1).一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA選自(a)編碼含有SEQ ID NO1或3所示氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO1或3所示氨基酸序列，但其中一或多個(gè)氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；(c)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO2或4所示核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
(2).如(1)所述的DNA，其中該DNA來(lái)自水稻。
(3).一種DNA，其編碼與(1)或(2)所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA。
(4).一種DNA，其編碼具有特異性消化(1)或(2)所述DNA之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
(5).一種DNA，其編碼能通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)而利用共抑制效應(yīng)來(lái)抑制(1)或(2)所述DNA的表達(dá)的RNA。
(6).如(1)或(2)所述DNA，其中該DNA用于提高植物的光周期敏感性。
(7).如(3)-(5)中任一項(xiàng)所述的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。
(8).一種載體，其含有如(1)-(5)中任一項(xiàng)所述的DNA。
(9).一種植物細(xì)胞，其被如(8)所述的載體轉(zhuǎn)化。
(10).一種植物轉(zhuǎn)化體，其含有如(9)所述的植物細(xì)胞。
(11).如(10)所述的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
(12).一種植物轉(zhuǎn)化體，它是(10)或(11)所述植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
(13).如(10)-(12)中任一項(xiàng)所述的植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
(14).一種產(chǎn)生如(10)或(11)所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，它包括以下步驟(a)將(1)或(2)所述的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，和(b)從該植物細(xì)胞再生植物。
(15).一種提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在該植物體中表達(dá)如(1)或(2)所述DNA的步驟。
(16).如(15)所述的方法，其中依賴于光周期的植物開(kāi)花時(shí)間通過(guò)提高該植物的光周期敏感性而延遲。
(17).一種降低植物的光周期敏感性的方法，該方法包括抑制該植物體的細(xì)胞中如(1)或(2)所述DNA表達(dá)的步驟，其中所述DNA為該植物細(xì)胞的內(nèi)源性DNA。
(18).如(17)所述的方法，其中如(3)-(5)中任一項(xiàng)所述DNA是在該植物體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
(19).如(17)或(18)所述的方法，其中依賴于光周期的該植物的開(kāi)花時(shí)間通過(guò)降低該植物的光周期敏感性而提前。
(20).如(15)-(19)中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物是水稻。
(21).一種評(píng)價(jià)植物的光周期敏感性的方法，它包括檢測(cè)該植物中如(1)所述的DNA存在與否的步驟。
(22).如(21)所述的方法，其中所述植物是水稻。
(23).一種宿主細(xì)胞，其中已插入了攜有(1)或(2)所述DNA的載體。
(24).由(1)或(2)所述的DNA編碼的蛋白。
(25).一種產(chǎn)生(24)所述蛋白的方法，它包括以下步驟培養(yǎng)(23)所述宿主細(xì)胞；使該宿主細(xì)胞表達(dá)該DNA所編碼的重組蛋白；并從該宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收該重組蛋白。
(26)與(24)所述蛋白結(jié)合的抗體。
(27).一種DNA，其中至少15個(gè)核苷酸與由SEQ ID NO2或4所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。
本發(fā)明提供了編碼來(lái)自水稻的Hd1蛋白的DNA。Nipponbare的Hd1基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO2或4。由該DNA編碼的蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO1。此外，Ginbozu的Hd1基因組DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO4，由該DNA編碼的蛋白的氨基酸序列示于SEQ IDNO3。
Hd1是用Nipponbare和Kasalath的雜交后代檢測(cè)出的定量特征基因座(quantitative trait loci，QTL)之一，已知它位于6號(hào)染色體上。根據(jù)利用Hd1區(qū)有Nipponbare遺傳背景的一個(gè)近似純合系進(jìn)行的試驗(yàn)還得知，Hd1基因座是光周期敏感性基因座。Hd1基因在短晝條件下能減少?gòu)牟シN到抽穗所需時(shí)間(到抽穗所需的天數(shù))，而在長(zhǎng)晝條件下能增加到達(dá)抽穗所需的天數(shù)。即，Nipponbare的Hd1基因能提高水稻的光周期敏感性，從而使該植物在自然田間(在近似于長(zhǎng)晝的條件下)栽培時(shí)，推遲成熟期。已知Hd1基因是一種與植物的光周期敏感性有關(guān)的基因，它位于6號(hào)染色體上某一位置。但迄今仍未鑒定或分離到Hd1基因。本發(fā)明人通過(guò)復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，最終鑒定出了該基因所處的染色體區(qū)，并首次成功地將該基因作為單個(gè)基因而分離出。
目前在日本，水稻品種改良的一個(gè)重要目標(biāo)是控制水稻的抽穗期。在寒冷地區(qū)逃避由于秋季低溫的早早到來(lái)而引起的低溫?fù)p害是十分重要的。另一方面，在西南部溫暖地區(qū)的大規(guī)模水稻種植區(qū)，為了減少收獲過(guò)于集中而帶來(lái)的繁重勞動(dòng)，也需要提前或延遲抽穗期。
植物的抽穗期(花期)可通過(guò)用編碼Hd1蛋白(它能提高植物的光周期敏感性)的DNA轉(zhuǎn)化植物而延遲?；蛘撸梅戳x方法或核酶方法來(lái)控制所述DNA的表達(dá)，也能降低光周期敏感性和使植物的花期提前。具體地，植物的花期可通過(guò)將編碼Hd1蛋白的DNA以重組方式導(dǎo)入缺乏該DNA的植物中，和通過(guò)用反義、核酶等控制該DNA在具有該DNA的品種中的表達(dá)而多樣化。因此可培育新的品種。
本發(fā)明編碼Hd1蛋白的DNA包括基因組DNA、cDNA和化學(xué)合成的DNA?；蚪MDNA和cDNA可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來(lái)制備。更具體地，基因組DNA可以如下制備(1)從具有光周期敏感性基因的水稻品種(如Nipponbare或Ginbozu)中提取基因組DNA；(2)構(gòu)建基因組文庫(kù)(利用載體，如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC、PAC等)；(3)將該文庫(kù)鋪板；和(4)利用根據(jù)編碼本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO2或4)制備的探針進(jìn)行菌落雜交或空斑雜交?；蛘撸衫锰禺愋葬槍?duì)編碼本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO2或4)的引物經(jīng)PCR來(lái)制備基因組DNA。另一方面，cDNA可如下制備(1)根據(jù)從具有光周期敏感性基因的水稻品種(如Nipponbare或Ginbozu)提取的mRNA合成cDNA；(2)通過(guò)將該合成的cDNA插入載體，如λZAP來(lái)制備cDNA文庫(kù)；(3)將該cDNA文庫(kù)鋪板；和(4)如上所述進(jìn)行菌落雜交或空斑雜交?；蛘撸琧DNA也可通過(guò)PCR來(lái)制備。
本發(fā)明包括能編碼與SEQ ID NO1或3所示Hd1蛋白功能等價(jià)的蛋白(Nipponbare或Ginbozu)的DNA。本文中術(shù)語(yǔ)“與Hd1蛋白功能等價(jià)”指目標(biāo)蛋白具有提高植物的光周期敏感性的功能。這類(lèi)DNA優(yōu)選來(lái)自單子葉植物，更優(yōu)選來(lái)自禾本科(Gramineae)，最優(yōu)選來(lái)自水稻。
這類(lèi)DNA的實(shí)例包括編碼含有SEQ ID NO1或3所示氨基酸序列但其中一或多個(gè)氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的突變體、衍生物、等位基因變體、變體或同系物的那些DNA。
制備能編碼含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知氨基酸改變的蛋白的DNA的方法包括定點(diǎn)誘變(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directed constructionof mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154350-367，1987)。蛋白的氨基酸序列也可由于核苷酸序列的突變而自然突變。編碼具有天然Hd1蛋白的氨基酸序列但其中一或多個(gè)氨基酸已被取代、缺失、和/或添加的蛋白的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中，只要它們編碼與天然Hd1蛋白(SEQ ID NO1或3)功能等價(jià)的蛋白。此外，不引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列改變的那些核苷酸序列突變體(簡(jiǎn)并突變體)也包括在本發(fā)明的DNA中。
對(duì)一種DNA是否編碼能提高植物光周期敏感性的蛋白可如下進(jìn)行評(píng)估最普通的方法包括用所述DNA轉(zhuǎn)化植物和將該植物培養(yǎng)在能改變光照時(shí)間長(zhǎng)短的培養(yǎng)箱中。更具體地，使植物在短晝(通常9-10小時(shí))或長(zhǎng)晝(14-16小時(shí))的條件下培養(yǎng)，比較在這些不同條件下生長(zhǎng)的植物從播種到開(kāi)花(如果是水稻，從播種到抽穗)所需的天數(shù)。在長(zhǎng)晝和短晝條件下達(dá)到抽穗所需天數(shù)沒(méi)有不同的那些植物被確定為缺乏光周期敏感性。在所述兩種條件下達(dá)到抽穗所需天數(shù)有差異的那些植物被確定為具有光周期敏感性，而這種差異被視為該植物的光周期敏感程度。如果不能提供培養(yǎng)箱，可通過(guò)將植物在田間和在溫室中以自然光照時(shí)間栽培而評(píng)估。具體地，將植物每20天播種一次，恒溫自然光照培養(yǎng)，測(cè)定每種植物開(kāi)花所需天數(shù)。一般情況下，具有較強(qiáng)光周期敏感性的水稻品種如果是在8月份-2月份期間播種則抽穗提前，如果在4月份-7月份期間播種則抽穗會(huì)延遲。另一方面，光周期敏感性較弱的水稻品種達(dá)到抽穗期所需時(shí)間不受播種季節(jié)的影響，也不因光照時(shí)間的長(zhǎng)短而發(fā)生大的改變。
編碼與SEQ ID NO1或3所示Hd1蛋白功能等價(jià)的蛋白的DNA可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，這些方法包括雜交技術(shù)(Southern，E.M.Journal ofMolecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是說(shuō)，用Hd1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2或4)或其部分作為探針，用能與Hd1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2或4)特異性雜交的寡核苷酸作為引物，分離出與水稻和其它植物的Hd1基因高度同源的DNA是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這類(lèi)能編碼Hd1蛋白的功能等價(jià)蛋白的DNA可通過(guò)雜交技術(shù)或PCR技術(shù)獲得，它們都包括在本發(fā)明的DNA中。
用于分離這類(lèi)DNA的雜交反應(yīng)優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。本發(fā)明的嚴(yán)謹(jǐn)條件包括如下條件6M尿素，0.4％SDS，和0.5xSSC；和那些產(chǎn)生類(lèi)似嚴(yán)謹(jǐn)度的條件。能在較高嚴(yán)謹(jǐn)條件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1xSSC下雜交的DNA具有更高的同源性。在這類(lèi)條件下分離的DNA預(yù)計(jì)能編碼與Hd1蛋白(SEQ ID NO1或3)具有較高氨基酸水平同源性的蛋白。本文中高同源性是指同一性至少50％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％(如至少95％)。一種氨基酸序列或核苷酸序列與另一種序列的同源性程度可按照Karlin和Altschl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877，1993)所述BLAST算法來(lái)確定。BLASTN和BLASTX等程序都是根據(jù)該算法開(kāi)發(fā)的(Altschul etal.J.Mol.Biol.215403-410，1990)。為了根據(jù)基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，將參數(shù)設(shè)置為，例如score＝100和word length＝12。另一方面，用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，所用參數(shù)包括score＝50和word length＝3。當(dāng)使用BLAST和空隙化BLAST程序時(shí)，使用每種程序的默認(rèn)參數(shù)。這類(lèi)分析的特定技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本發(fā)明的DNA可用于制備重組蛋白，產(chǎn)生已改變其光周期敏感性的植物轉(zhuǎn)化體等等。
重組蛋白常如下制備將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，使這些細(xì)胞表達(dá)所述重組蛋白，和純化所表達(dá)的蛋白。重組蛋白可表達(dá)為與便于純化的其它蛋白融合的蛋白，如與大腸桿菌(Escherichia coli)麥芽糖結(jié)合蛋白(New England Biolabs，USA，載體pMAL系列)融合的蛋白，與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)(AmershamPharmacia Biotech，vector pGEX series)融合的蛋白，或帶有組氨酸標(biāo)記(Novagen，pET系列)的融合蛋白。對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有限制，只要該細(xì)胞適于表達(dá)所述重組蛋白。除了上述大腸桿菌以外，可以使用酵母或各種動(dòng)物、植物、或昆蟲(chóng)細(xì)胞。可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，可用利用了鈣離子的轉(zhuǎn)化方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.53158-162，(1970)；Hanahan，D.，J.Mol.Biol.166557-580，(1983))將載體導(dǎo)入大腸桿菌。表達(dá)在宿主細(xì)胞中的重組蛋白可用已知方法從所述宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中純化和回收。當(dāng)重組蛋白表達(dá)為與麥芽糖結(jié)合蛋白或其它配對(duì)物融合的蛋白時(shí)，該重組蛋白可通過(guò)親和層析方便地純化。
所得蛋白可用于制備能結(jié)合該蛋白的抗體。例如，可用本發(fā)明的純化蛋白或其一部分免疫動(dòng)物，如兔等，一段時(shí)間后收集血液并去除血凝塊，從而制備多克隆抗體。將骨髓瘤細(xì)胞與用上述蛋白或其一部分免疫的動(dòng)物的抗體生成細(xì)胞融合，分離能表達(dá)所需抗體的單克隆細(xì)胞(雜交瘤)，從所述細(xì)胞回收抗體，可獲得單克隆抗體。所得抗體可用于純化或檢測(cè)本發(fā)明的蛋白。相應(yīng)地，本發(fā)明包括能結(jié)合本發(fā)明蛋白的抗體。
提高了光周期敏感性的植物轉(zhuǎn)化體可用本發(fā)明的DNA來(lái)產(chǎn)生。更具體地，可將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適當(dāng)載體；將該載體導(dǎo)入植物細(xì)胞；然后使所得已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。由本發(fā)明人分離的光周期敏感性基因Hd1能提高水稻的光周期敏感性并延遲水稻的抽穗期。因此，可通過(guò)用該基因轉(zhuǎn)化各種品種并使它們表達(dá)來(lái)控制各種品種的抽穗期。轉(zhuǎn)化所需時(shí)間相對(duì)于常規(guī)通過(guò)雜交進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)移而言大大縮短。此外，轉(zhuǎn)化不伴有其它特征改變，這一事實(shí)也是有利的。本文中新鑒定并分離了控制水稻抽穗期的基因，而對(duì)水稻抽穗期的控制由于本發(fā)明而首次變?yōu)榭赡堋?br> 另一方面，降低了光周期敏感性的植物轉(zhuǎn)化體可利用能抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達(dá)的DNA來(lái)產(chǎn)生將該DNA插入適當(dāng)載體，將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，然后使所得已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生。術(shù)語(yǔ)“抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達(dá)”包括抑制基因轉(zhuǎn)錄以及抑制蛋白的翻譯。它不僅包括徹底使DNA表達(dá)能力喪失，還包括降低表達(dá)水平。
植物中特定內(nèi)源基因的表達(dá)可通過(guò)領(lǐng)域內(nèi)常用的、利用了反義技術(shù)的方法來(lái)抑制。Ecker等人首次通過(guò)瞬時(shí)基因表達(dá)法證實(shí)了經(jīng)電穿孔導(dǎo)入植物細(xì)胞的反義RNA的反義效應(yīng)(J.R.Ecker和R.W.Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372(1986))。此后，有報(bào)道在煙草和矮牽牛中通過(guò)表達(dá)反義RNA減少了靶基因的表達(dá)(A.R.van der Krol et al.，(1988)Nature 333866)。如今反義技術(shù)已作為抑制植物中靶基因表達(dá)的一種成熟手段。
反義核酸抑制靶基因表達(dá)需要多種因素，包括通過(guò)形成三鏈而抑制轉(zhuǎn)錄起始；通過(guò)在RNA酶形成局部開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)處形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過(guò)與被合成的RNA形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過(guò)在內(nèi)含子與外顯子連接處形成雜合體而抑制剪接；通過(guò)在剪接體形成位點(diǎn)形成雜合體而抑制剪接；通過(guò)與mRNA形成雜合體而抑制mRNA從核到細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位；通過(guò)在加帽位點(diǎn)或poly A添加位點(diǎn)形成雜合體而抑制剪接；通過(guò)在翻譯起始因子結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制翻譯的起始；通過(guò)在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制翻譯；通過(guò)在已翻譯區(qū)或在mRNA的多體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合體而抑制肽鏈延伸；通過(guò)在核酸與蛋白相互作用的位點(diǎn)形成雜合體而抑制基因表達(dá)。這些因素通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯而抑制靶基因的表達(dá)(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(New BiochemistryExperimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei ToHatsugen(Replication and Expression of genes)”，Nihon Seikagakukai Hen(TheJapanese Biochemical Society)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本發(fā)明的反義序列可通過(guò)上述任何機(jī)制抑制靶基因的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果將反義序列設(shè)計(jì)成與所述基因的mRNA5’端附近的非翻譯區(qū)互補(bǔ)，它就能有效抑制基因翻譯。也有可能使用與編碼區(qū)或非翻譯區(qū)在3’側(cè)互補(bǔ)的序列。因此，本發(fā)明中使用的反義DNA包括具有針對(duì)所述基因非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。將所用的反義DNA連接在適當(dāng)啟動(dòng)子下游，并優(yōu)選將含有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列連接在3’側(cè)。將如此制備的DNA通過(guò)已知方法轉(zhuǎn)染至目標(biāo)植物中。優(yōu)選反義DNA的序列是互補(bǔ)于轉(zhuǎn)化植物的內(nèi)源基因的序列或其一部分，但它不需要完全互補(bǔ)，只要它能有效抑制基因表達(dá)。所轉(zhuǎn)錄的RNA優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％互補(bǔ)于靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。為了用反義序列有效抑制靶基因的表達(dá)，該反義DNA應(yīng)至少含有15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。所用反義DNA通常短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb。
編碼核酶的DNA也可用于抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶有很多種，它們具有不同的活性。對(duì)核酶作為RNA裂解酶的研究使得能設(shè)計(jì)出以位點(diǎn)特異性方式裂解RNA的核酶。一部分I組內(nèi)含子型核酶或包含在RNA酶P中的M1RNA由至少400個(gè)核苷酸組成，而其它屬于錘頭型或發(fā)卡型的核酶具有約40個(gè)核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域(MakotoKoizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，和Enzyme)，352191(1990))。
錘頭型核酶的自我裂解區(qū)在序列G13U14C15中C15的3’側(cè)裂解。U14與第9位的A之間形成核苷酸對(duì)被認(rèn)為對(duì)核酶活性是十分重要的。此外，已知當(dāng)?shù)?5位的核苷酸是A或U而不是C時(shí)也發(fā)生裂解(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.228225(1988))。如果將核酶的底物結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)成與靶位點(diǎn)的鄰近RNA序列互補(bǔ)，則能產(chǎn)生限制酶樣RNA裂解性核酶，它識(shí)別靶RNA中的序列UC、UU、或UA(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.239285(1988)；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，和Enzyme)，352191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.177059(1989))。例如，在Hd1基因(SEQ ID NO2或4)的編碼區(qū)中有多個(gè)可作為核酶作用目標(biāo)的位點(diǎn)。
發(fā)卡型核酶也可用于本發(fā)明。發(fā)卡型核酶可在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA負(fù)鏈中找到(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。該核酶也能以靶特異性方式裂解RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751(1992)；Yo Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemisty和Biology)30112(1992))。
設(shè)計(jì)用于裂解目標(biāo)的核酶可與啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子融合，并與轉(zhuǎn)錄終止序列融合，使它能在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。但如果在所轉(zhuǎn)錄的RNA的5’或3’端添加了額外的序列，核酶的活性可能丟失。在這種情況下，可另外安排一個(gè)能清理接縫(trimming)的核酶，它能在核酶部分的5’或3’側(cè)順式清理接縫，從而從含有該核酶的轉(zhuǎn)錄RNA上準(zhǔn)確切出核酶部分(K.Tairaet al.，Protein Eng.3733(1990)；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823(1989)；C.A.Grosshands和R.T.Cech，Nucleic AcidsRes.193875(1991)；K.Taira et al.Nucleic Acid Res.195125(1991))。通過(guò)隨機(jī)排列靶基因內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)可以裂解這些結(jié)構(gòu)單位并獲得更大效應(yīng)(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。通過(guò)利用這類(lèi)核酶，有可能特異性裂解本發(fā)明靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達(dá)。
內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過(guò)用具有與該靶基因序列相同或相似序列的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化而進(jìn)行共抑制。“共抑制”是指將具有與內(nèi)源靶基因序列相同或相似序列的基因通過(guò)轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入植物后，該導(dǎo)入基因和內(nèi)源靶基因的表達(dá)都受到抑制的現(xiàn)象。共抑制的詳細(xì)機(jī)制目前尚不明了，但它常見(jiàn)于植物(Curr.Biol.7R793(1997)，Curr.Biol.6810(1996))。例如，如果想獲得Hd1基因已被共抑制的植物體，可以用設(shè)計(jì)成能表達(dá)Hd1基因或具有相似序列的DNA的載體DNA來(lái)轉(zhuǎn)化該植物，在所得植物群體中選出具有Hd1突變體特性的植物，即光周期敏感性已降低的植物。用于共抑制的基因不必與靶基因完全相同，但應(yīng)有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％(如至少95％)的序列同一性。序列同一性可通過(guò)上述方法確定。
此外，本發(fā)明內(nèi)源基因的表達(dá)也可通過(guò)用具有該靶基因的顯性陰性表型(dominant negative phenotype)的基因轉(zhuǎn)化該植物來(lái)抑制。具有該靶基因的顯性陰性表型的基因是指，表達(dá)后能消除或降低該植物固有的野生型內(nèi)源基因活性的那些基因。
對(duì)用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體沒(méi)有限制，只要該載體能在植物細(xì)胞中表達(dá)所插入的基因。例如，可以使用含有用于植物細(xì)胞中組成型基因表達(dá)的啟動(dòng)子(如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)和受外源刺激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的載體。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞”在本文中包括各種形式的植物細(xì)胞，如培養(yǎng)細(xì)胞懸液，原生質(zhì)體，葉切片，和愈傷組織。
可通過(guò)已知方法將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，如聚乙二醇法，電穿孔，農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，和粒子轟擊。可根據(jù)植物細(xì)胞的類(lèi)型用已知方法從已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，水稻植物的轉(zhuǎn)化和再生方法包括(1)用聚乙二醇將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于indica水稻品種)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于japonica水稻品種)(Toki et al(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通過(guò)粒子轟擊將基因直接導(dǎo)入細(xì)胞并再生植物體(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；(4)利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因并再生植物體(Hiei et al.(1994)Plant J.6271-282)；等等。這些都是領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)有方法，都廣泛用于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域。這些方法適用于本發(fā)明。
一旦獲得了一種轉(zhuǎn)化植物，其中已將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入了基因組，就有可能通過(guò)有性或無(wú)性繁殖從該植物體獲得后代?；蛘?，可從該植物及其后代或克隆獲得繁殖材料(如種子、果實(shí)、穗、塊莖、塊根、株、愈傷組織、原生質(zhì)體等)來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)植物。用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，包含這些細(xì)胞的植物體，該植物的后代和克隆，以及從該植物獲得的繁殖材料、其后代或克隆，它們都包括在本發(fā)明中。
如上述制備的改變了光周期敏感性的植物的花期不同于野生型植物。例如，用編碼Hd1蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的植物提高了光周期敏感性，而且在田間生長(zhǎng)調(diào)節(jié)下該植物的花期延遲了。另一方面，由于導(dǎo)入反義DNA使得編碼Hd1蛋白的DNA的表達(dá)受到抑制的那些植物降低了光周期敏感性，且該植物的花期提前。因此，植物開(kāi)花所需時(shí)間可通過(guò)控制Hd1基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，可以嚴(yán)密控制水稻，這種極具價(jià)值的作物的抽穗期，這對(duì)于培育能適應(yīng)特定環(huán)境的水稻品種非常有利。
此外，本發(fā)明提供了評(píng)估植物的光周期敏感性的方法。本發(fā)明人研究了Hd1基因的轉(zhuǎn)錄與田間栽培時(shí)到達(dá)抽穗所需的天數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)檢測(cè)到正常轉(zhuǎn)錄時(shí)(在Nipponbare和Ginbozu中)，到達(dá)抽穗所需的天數(shù)增多，而在觀察到異常轉(zhuǎn)錄子的情況下天數(shù)減少(實(shí)施例5)。這些結(jié)果表明，功能性Hd1蛋白的表達(dá)是決定植物對(duì)光周期的敏感程度的一個(gè)因素。本發(fā)明評(píng)估植物的光周期敏感性的方法是基于這一發(fā)現(xiàn)，其特征在于檢測(cè)植物是否攜有編碼功能性Hd1蛋白的DNA的步驟。
植物是否攜有編碼功能性Hd1蛋白的DNA，可通過(guò)檢測(cè)多態(tài)性，即與基因組DNA中的Hd1相對(duì)應(yīng)的區(qū)域的結(jié)構(gòu)差異來(lái)評(píng)價(jià)。
用本發(fā)明的方法評(píng)估植物的光周期敏感性對(duì)于，如通過(guò)雜交來(lái)改良植物品種十分有效。即，當(dāng)不希望導(dǎo)入光周期敏感性特征時(shí)，可通過(guò)本發(fā)明避免與具有光周期敏感性的植物雜交。相反，當(dāng)希望導(dǎo)入光周期敏感性特征時(shí)，通過(guò)本發(fā)明就能與具有光周期敏感性的植物進(jìn)行雜交。此外，本發(fā)明的方法還可用于從雜交的后代植物群體中篩選植物。在基因序列中確定植物的光周期敏感性比根據(jù)植物的表型來(lái)進(jìn)行確定更簡(jiǎn)單可靠。因此，本發(fā)明評(píng)估光周期敏感性的方法對(duì)植物品種改良方法的進(jìn)步作出了很大貢獻(xiàn)。
而且，本發(fā)明提供了一種DNA，它有至少15個(gè)核苷酸與本發(fā)明中由核苷酸序列SEQ ID NO2或4或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。本文中將“互補(bǔ)鏈”定義為由A∶T和G∶C堿基對(duì)構(gòu)成的雙鏈DNA中相對(duì)于一條鏈的另一條鏈。“互補(bǔ)”不僅指在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域內(nèi)互補(bǔ)配對(duì)的那些，還指在所述區(qū)域內(nèi)具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％同源性的那些。所述DNA可作為有效檢測(cè)或分離本發(fā)明DNA的探針，或作為擴(kuò)增本發(fā)明DNA的探針。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示Hd1基因區(qū)的詳細(xì)連鎖圖譜，以及YAC和基因組克隆的排列。
A顯示用1,505個(gè)植株產(chǎn)生的連鎖圖譜。
B顯示酵母人工染色體(YAC)克隆的排列。
C顯示P1衍生的人工染色體(PAC)克隆的的排列。
D顯示Hd1基因的候選區(qū)，預(yù)測(cè)的Hd1基因，及其同源性搜索結(jié)果。
圖2顯示Hd1候選基因區(qū)的核苷酸序列對(duì)比。Nipponbare和Ginbozu都具有功能性Hd1基因，而Kasalath的Hd1基因功能減弱或缺失。HS66和HS110是在γ射線輻射下誘導(dǎo)Se1基因座的光周期敏感性喪失的突變系。被直角線包圍的區(qū)域是通過(guò)基因預(yù)測(cè)假定為外顯子的區(qū)域。所測(cè)定的突變位點(diǎn)上方的數(shù)字表示插入或缺失的核苷酸的數(shù)目。
圖3顯示了用于通過(guò)轉(zhuǎn)化進(jìn)行互補(bǔ)分析的載體。
圖4顯示，在一群已導(dǎo)入了含有Hd1候選基因區(qū)的7.1-kb基因組DNA片段的轉(zhuǎn)化植株中，抽穗所需時(shí)間的改變。
圖5顯示，在一群已導(dǎo)入了含Hd1候選基因區(qū)的7.1-kb基因組DNA片段的轉(zhuǎn)化植株的自花授粉后代(T1)中，抽穗所需時(shí)間的改變。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明參照以下實(shí)施例舉例說(shuō)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。
通過(guò)高精度連鎖分析以及酵母人工染色體(YAC)克隆對(duì)Hd1基因進(jìn)行的排列用大規(guī)模分離群體對(duì)Hd1區(qū)進(jìn)行高精度連鎖分析，這是根據(jù)該分析的圖譜進(jìn)行克隆所必需的。連鎖分析所用的群體為Nipponbare和Kasalath的回交后代BC3F3代，其中的Hd1區(qū)已分離。連鎖分析用集中取樣法進(jìn)行。即，使約8,000個(gè)Hd1區(qū)分離的BC3F3植株在稻田中生長(zhǎng)，研究它們的抽穗期，選出1,505個(gè)早熟植株，推定它們?cè)贖d1基因座上是Kasalath等位基因純合子。從其中5個(gè)植株收集葉片，提取DNA，選出攜有在Hd1區(qū)發(fā)生了重組的染色體的植株。在篩選重組個(gè)體時(shí)使用的RFLP標(biāo)志是R1679和P130。結(jié)果在R1679和Hd1之間以及Hd1和P130之間分別選出9個(gè)和2個(gè)重組植株(
圖1)。
用被認(rèn)為位于Hd1周?chē)腄NA標(biāo)志進(jìn)行的另一項(xiàng)高精度連鎖分析顯示，Hd1基因座位于RFLP標(biāo)志S20481和P130之間，但在S2539和Hd1之間位發(fā)現(xiàn)重組(
圖1)。分別在S20481和Hd1之間以及Hd1和P130之間發(fā)現(xiàn)1個(gè)和2個(gè)可用于限定Hd1基因的基因組候選區(qū)的重組植株。
根據(jù)在水稻基因組研究中制備的YAC克隆的排列圖譜，鑒定出在鄰近Hd1基因座含有DNA標(biāo)志C235，S20481，和S2539的核苷酸序列的YAC克隆。此外，當(dāng)用盒(cassette)法分離上述鑒定的YAC克隆Y4836的末端DNA片段，并經(jīng)分析確定為RFLP標(biāo)志時(shí)，該末端DNA克隆Y4836R與RELP標(biāo)志P130共分離，說(shuō)明YAC克隆Y4836R包含Hd1基因座(
圖1)。
用P1-衍生的人工染色體(PAC)克隆排列Hd1基因區(qū)使用衍生自鄰近Hd1基因座的RFLP標(biāo)志S20481(0.74-kb擴(kuò)增基因組片段)和S2539(1.9-kb擴(kuò)增基因組片段)的一組STS(序列標(biāo)記位點(diǎn))引物，篩選在水稻基因組研究項(xiàng)目(RGP)中制備的Nipponbare基因組的PAC克隆文庫(kù)(插入子長(zhǎng)度平均為112kb，18432個(gè)克??；對(duì)應(yīng)于水稻基因組大小的約4.5倍)。用“5’-GGA CTG GGT GAA GAA GAT-3’(SEQ ID NO5)”和“5’-CCTTGT CCT CTC CTC TTG-3’(SEQ ID NO6)”產(chǎn)生S20481的STS引物，用“5’-GTA GAG TGA TGA CAA AAT GAC AA-3’(SEQ ID NO7)”和“5’-GGACTG AGA TGG AAT GTG CT-3’(SEQ ID NO8)”產(chǎn)生S2539的STS引物。結(jié)果選出兩個(gè)克隆P0676F10和P0038C5。此外，經(jīng)PCR檢查這些PAC克隆是否帶有對(duì)應(yīng)于RFLP標(biāo)志Y4836R和P130的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAC克隆P0038C5具有對(duì)應(yīng)于Y4836R的核苷酸序列，完全覆蓋Hd1基因座(
圖1)。
通過(guò)分析核苷酸序列來(lái)確定候選基因?qū)ν茰y(cè)攜有Hd1基因的PAC克隆P0038C5進(jìn)行核苷酸序列分析。為了分析核苷酸序列，對(duì)P0038C5的DNA插入子(包括載體)進(jìn)行超聲處理，來(lái)制備含有平均2.5kb和5kb的片段的插入子亞克隆。從該亞文庫(kù)隨機(jī)選取2,000個(gè)克隆進(jìn)行核苷酸序列分析，用Phred/Phrap軟件進(jìn)行裝配。根據(jù)由連鎖分析顯示的候選基因組區(qū)中核苷酸序列的信息，產(chǎn)生新的CAPS(裂解擴(kuò)增多態(tài)性序列)標(biāo)志，以此來(lái)限定該候選區(qū)。用以下CAPS標(biāo)志作為引物共分離Hd1基因1b(限制酶SspI)“5’-AAG CAA GCA GAA AGT AAA GAG-3’(SEQ ID NO9)”和“5’-GAA ACA ATA GTA GAC CGA GCA-3’(SEQ ID NO10)”；1c(限制酶HindIII)“5’-GAC CCA TCC GCC GCC TAC TCT-3’(SEQ IDNO11)”和“5’-GCA GGT CGT GAA ACA ATC GGT-3’(SEQ ID NO12)”；1d(限制酶HaeIII)“5’-ATT GAG ATG GTA TTG CGG AAG A-3’(SEQ ID NO13)”和“5’-CAC ATC GTG CCT TCA AGC TG-3’(SEQ ID NO14)”；和1e(限制酶Sau3AI)“5’-ACA AGG ACG AGG AGG TGG AC-3’(SEQ ID NO15)”和“5’-GCT GCT GCT CTT GCT GTT CA-3’(SEQ ID NO16)”。此外，在1a(限制酶Sau3AI)“SEQ ID NO7”和“SEQ ID NO8”之間以及1f(限制酶NcoI)“5’-CCA GGA AGT TTG AGA AGA CA-3’(SEQ ID NO17)”和“5’-TGC ATTCTG ATG CTT GAT TA-3’(SEQ ID NO18)”之間都檢測(cè)到一個(gè)重組基因(
圖1)。因此，Hd1基因的候選基因區(qū)可限定為約12kb。對(duì)該候選區(qū)的基因預(yù)測(cè)以及序列同源性搜索檢測(cè)出一個(gè)與過(guò)氧化物酶S2539(鑒定為水稻的EST)以及擬南芥(Arabidopsis)CONSTANS(CO)基因(它具有在長(zhǎng)晝條件下促進(jìn)開(kāi)花的功能，并被認(rèn)為是具有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因)的核苷酸序列高度同源的區(qū)域。
分析Hd1候選基因的核苷酸序列對(duì)Nipponbare和它的Hd1近似純合系進(jìn)行RT-CR，發(fā)現(xiàn)S2539(水稻植物的EST)在轉(zhuǎn)錄水平上未發(fā)生變化。因此，用預(yù)測(cè)具有鋅指結(jié)構(gòu)域的基因作為Hd1候選基因繼續(xù)進(jìn)行分析。為確定Kasalath的Hd1候選基因的核苷酸序列，從根據(jù)Kasalath的基因組DNA構(gòu)建的粘粒文庫(kù)選出攜帶所述候選基因的第47號(hào)克隆。利用如此選出的粘粒克隆確定Kasalath的12-kb Hd1候選基因區(qū)的核苷酸序列。在Kasalath的候選基因區(qū)的ORF(SEQ ID NO19)中的11個(gè)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)突變(源于核苷酸的插入、缺失和取代)。最大的突變是在預(yù)測(cè)的外顯子中36-bp的插入和33-bp的缺失(圖2)。
另一方面，分析se1突變株HS66和HS110，以及它們的親本株Ginbozu中上述候選基因區(qū)的核苷酸序列。推測(cè)Se1位于與Hd1相同的基因座上。根據(jù)Nipponbare的核苷酸序列制備能擴(kuò)增Hd1候選基因區(qū)的引物，用這些引物克隆相應(yīng)區(qū)，從而分析核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜有Se1基因的Ginbozu的核苷酸序列除了一段36-bp的插入序列與Kasalath中的序列一樣，并含有一個(gè)核苷酸取代以外，與Nipponbare的序列相同。突變株HS66(SEQ ID NO20)相對(duì)于Ginbozu，在預(yù)測(cè)的外顯子中觀察到一段43-bp的缺失，而在HS110(SEQ ID NO21)內(nèi)含子中檢測(cè)到一段433-bp的插入子(圖2)。
根據(jù)以上結(jié)果，確定帶有鋅指結(jié)構(gòu)域的基因是Hd1基因更可能的候選者，而且也表明Se1基因座很可能就是Hd1基因座。
對(duì)Hd1候選基因的表達(dá)模式的分析對(duì)Nipponbar及其近似純合系(NIL(Hd1))的候選基因進(jìn)行RT-PCR分析，在該近似純合系中，Hd1基因區(qū)已被Kasalath的染色體片段取代。即，從收集的葉片提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNAs，然后用含有在Hd1基因中指定的內(nèi)含子的引物對(duì)進(jìn)行PCR5’-TTC TCC TCT CCA AAG ATT CC-3’(SEQ IDNO22)(有義鏈)和5’-CAT ACG CCT TTC TTG TTT CA-3’(SEQ ID NO23)(反義鏈)。用作模板的RNA的量用以下引物對(duì)經(jīng)PCR來(lái)估測(cè)5’-TCC ATCTTG GCA TCT CTC AG-3’(SEQ ID NO24)(有義鏈)和5’-GTA CCC GCATCA GGC ATC TG-3’(SEQ ID NO25)(反義鏈)，所述引物能擴(kuò)增肌動(dòng)蛋白基因中的片段。結(jié)果，Nipponbare的在Hd1基因座帶有Kasalath基因的近似純合系中，候選基因的轉(zhuǎn)錄水平比Nipponbare中的大大降低，其大小也顯著變小(表1)。表1植株抽穗期2表達(dá)水平3轉(zhuǎn)錄子大小2Nipponbare 111.4±0.55+++ 具有預(yù)計(jì)大小者(Nipponbare)NIL(Hd1)196.2±0.84 + 略小者Ginbozu 118.8±0.84+++ 具有預(yù)計(jì)大小者HS6695.2±0.84 +++ 略小者HS110 99.0±1.00 + 具有預(yù)計(jì)大小者和略大者的混合1是那些包含Hd1基因區(qū)的染色體片段已經(jīng)被具有Nipponbare遺傳背景的Kasalath染色體片段取代了的植株。
2在田間栽培所得數(shù)據(jù)(于4月22日播種)。
3Hd1候選基因的轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)水平和大小通過(guò)RT-PCR來(lái)評(píng)價(jià)。
轉(zhuǎn)錄子的大小與那些可作為標(biāo)準(zhǔn)在Nipponbare中擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄子相當(dāng)。
發(fā)現(xiàn)這種大小的差異與基因組核苷酸序列中檢測(cè)出的缺失相對(duì)應(yīng)。接著，用RT-PCR對(duì)se1突變株HS66和HS110以及它們的親本株“Ginbozu”進(jìn)行類(lèi)似的基因表達(dá)模式分析。在Ginbozu中檢測(cè)到與Nipponbare中類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄子。相比之下，在HS66中，盡管轉(zhuǎn)錄子的量與Ginbozu中的沒(méi)有不同，但擴(kuò)增出一種略小的轉(zhuǎn)錄子。大小的減小程度與基因組核苷酸序列分析所示的43-bp的缺失相對(duì)應(yīng)。而在HS110中，單一大小的轉(zhuǎn)錄子不能經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，使得與Ginbozu的轉(zhuǎn)錄子大小相同的轉(zhuǎn)錄子以及大得多的轉(zhuǎn)錄子被擴(kuò)增(表1)。對(duì)這些擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆，并測(cè)定它們的核苷酸序列，除了與Nipponbare中相同的擴(kuò)增產(chǎn)物以外，還檢測(cè)出一種產(chǎn)物，它含有433-bp插入序列的一部分。這些結(jié)果表明，在HS110中，由于該433-bp的片段插入內(nèi)含子中，使得有可能不發(fā)生正常剪接。
對(duì)候選基因的轉(zhuǎn)錄子與到達(dá)抽穗所需的天數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)到正常轉(zhuǎn)錄子(在Nipponbare和Ginbozu中)時(shí)，到達(dá)抽穗所需的天數(shù)增加，而當(dāng)發(fā)現(xiàn)異常轉(zhuǎn)錄子時(shí)，天數(shù)減少。而且，在HS110中，盡管檢測(cè)到少量正常轉(zhuǎn)錄，到達(dá)抽穗所需的天數(shù)比Ginbozu的少，但比HS66的略多(表1)。這些結(jié)果說(shuō)明，HS110可能沒(méi)有完全喪失Se1的功能。
將核苷酸序列分析和表達(dá)模式分析的結(jié)果綜合，強(qiáng)烈提示了對(duì)應(yīng)于Hd1基因的候選基因，而且Se1基因座與Hd1候選基因座相同。
通過(guò)轉(zhuǎn)化鑒定候選基因的功能將指定為Hdl候選區(qū)的基因組區(qū)(
圖1)中7.1-kb的ApaI片段或3.5-kb的HindIII片段分別插入質(zhì)粒載體pPZP2H-lac，該載體可通過(guò)農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(圖3)。轉(zhuǎn)化用含或不含這些片段的載體，按照Doi，et al.((1997)Plant Mol.Biol.Rep.1516-21)所述方法進(jìn)行。將被轉(zhuǎn)化的品系是NIL(Hd1/Hd2)，它具有Nipponbare的遺傳背景，并且由于Nipponbare的光周期敏感性基因Hd1和Hd2被Kasalath的相應(yīng)基因取代而缺乏光周期敏感性。轉(zhuǎn)化獲得潮霉素抗性植株，其中52個(gè)帶有含7.1-kb片段的載體，44個(gè)帶有含3.5-kb片段的載體，19個(gè)僅帶有載體。
需要導(dǎo)入的區(qū)域是否已經(jīng)導(dǎo)入，可用該候選基因的特異性引物對(duì)SEQID NO14(有義鏈)和SEQ ID NO15(反義鏈)經(jīng)PCR確定。結(jié)果表明，候選基因已整合至所有希望導(dǎo)入7.1-kb或3.5-kb片段的重組體中。
將這些植株轉(zhuǎn)移至自然長(zhǎng)晝條件下的隔離溫室中(已于7月中旬從栽培室轉(zhuǎn)移至隔離溫室中，Tsukuba city)，以及短晝條件下的培養(yǎng)室中(每日光照10hr)，評(píng)價(jià)達(dá)到抽穗所需的天數(shù)。在自然長(zhǎng)晝條件下，抽穗顯著提前的植株出現(xiàn)在轉(zhuǎn)移了7.1-kb片段的植株組中(圖4)。在短晝條件下，含有7.1-kb片段的植株和不含轉(zhuǎn)基因的植株之間抽穗期明顯不同，前者的抽穗期比后者提早7-14天。另一方面，含有3.5-kb基因組片段的植株的抽穗期與僅含有載體的植株相同。
這些結(jié)果證實(shí)，候選基因區(qū)(7.1kb)具有在短晝條件下使抽穗提前的功能?？紤]到當(dāng)植物對(duì)光周期高度敏感時(shí)，可在短晝條件下提前抽穗，因此證實(shí)所導(dǎo)入的基因組片段具有提高光周期敏感性的功能。
而且，從那些在短晝條件下提前抽穗的植株中選出一個(gè)推測(cè)攜有所述轉(zhuǎn)基因的單個(gè)拷貝的植株，將其自花授粉后代在短晝條件下進(jìn)行類(lèi)似栽培(每天光照10hr和避光14hr)。結(jié)果在自花授粉后代中觀察到到達(dá)抽穗期的天數(shù)有很大差異3個(gè)晚熟植株不帶有所述轉(zhuǎn)移基因，而其它早熟植株攜有該轉(zhuǎn)基因(圖5)。根據(jù)PCR分析結(jié)果，4個(gè)最早熟的植株為該轉(zhuǎn)基因的純合子。經(jīng)證實(shí)，所導(dǎo)入的候選基因具有Hd1基因在短晝條件下使抽穗提前的功能。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了水稻品種中的光周期敏感性基因。本發(fā)明的基因賦予植物以光周期敏感性并可用于控制水稻的抽穗期。因此，這些基因?qū)τ谂嘤苓m應(yīng)特定區(qū)域和季節(jié)的水稻品種從而進(jìn)行品種改良十分有效。此外，用本發(fā)明的基因改良水稻品種的方法與傳統(tǒng)方法相比具有優(yōu)勢(shì)，其優(yōu)勢(shì)在于可在短期內(nèi)獲得非?？煽康哪繕?biāo)植物。
本發(fā)明還提供了評(píng)估植物的光周期敏感性的方法。傳統(tǒng)評(píng)估方法需要2-3年的繁重勞動(dòng)來(lái)確定一個(gè)品種的光周期敏感性，它包括將目標(biāo)品種與待檢植物品系雜交，鑒定特定基因的存在；然后通過(guò)分離植物后代的抽穗期來(lái)確定所述基因的存在。根據(jù)本發(fā)明的方法，植物的光周期敏感性可如下測(cè)定僅需(1)播種約2周后收獲秧苗的一部分；(2)從中提取DNA；(3)以所述DNA為模板進(jìn)行PCR并進(jìn)行限制酶處理來(lái)確定。植物后代的光周期敏感程度可在雜交前，根據(jù)所述基因的存在與否來(lái)確定，這種基因是對(duì)選擇并篩選將要雜交的親本植物而言有價(jià)值的信息。而且，光周期敏感性基因在選出的每種植物中的存在與否可利用上述方法輕易測(cè)定。因此，所述基因還可以作為選擇標(biāo)志。
序列表<110>農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所所長(zhǎng)代表的日本國(guó)(JAPAN as represented byDirector General of Ministry of Agriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries，NationalInstitute of Agrobiological Resources)生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)(Bio-oriented Technology Research AdvancementInstitution)社團(tuán)法人農(nóng)林水產(chǎn)先端技術(shù)產(chǎn)業(yè)振興中心(Society for Techno-innovation ofAgriculture，F(xiàn)orestry and Fisheries)<120>植物的光周期敏感性基因及其用途<130>MOA-105PCT<140><141><150>JP 1999-313846<151>1999-11-04<160>25<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>456<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>1Met Ala Gly Arg Phe Gly Thr Phe Leu Met Tyr Leu His Trp Leu Pro1 5 10 15His Thr Gly Ala Pro Ser Lys Lys His Ser Gln Asn Ser Thr Arg Ala20 25 30Met Arg Ala Lys Ala Thr Thr Thr Thr Ser Lys Ala Thr Ser Phe Met35 40 45Asn Tyr Asn Phe Gly Gly Asn Val Phe Asp Gln Glu Val Gly Val Gly50 55 60Gly Glu Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Ser Gly Cys Pro Trp Ala Arg65 70 75 80Pro Cys Asp Gly Cys Arg Ala Ala Pro Ser Val Val Tyr Cys Arg Ala85 90 95Asp Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Ser Cys Asp Ala Arg Val His Ala Ala100 105 110Asn Arg Val Ala Ser Arg His Glu Arg Val Arg Val Cys Glu Ala Cys115 120 125Glu Arg Ala Pro Ala Ala Leu Ala Cys Arg Ala Asp Ala Ala Ala Leu130 135 140Cys Val Ala Cys Asp Val Gln Val His Ser Ala Asn Pro Leu Pro Ala145 150 155 160Ile Thr Ile Pro Ala Thr Ser Val Leu Ala Glu Ala Val Val Ala Thr165 170 175Ala Thr Val Leu Gly Asp Lys Asp Glu Glu Val Asp Ser Trp Leu Leu180 185 190Leu Ser Lys Asp Ser Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asp195 200 205Asn Asp Asn Asn Asp Asn Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asn Asn Gly Met210 215 220Tyr Phe Gly Glu Val Asp Glu Tyr Phe Asp Leu Val Gly Tyr Asn Ser225 230 235 240Tyr Tyr Asp Asn Arg Ile Glu Asn Asn Gln Asp Arg Gln Tyr Gly Met245 250 255His Glu Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Met Gln Lys Glu260 265 270Phe Ala Glu Lys Glu Gly Ser Glu Cys Val Val Pro Ser Gln Ile Thr275 280 285Met Leu Ser Glu Gln Gln His Ser Gly Tyr Gly Val Val Gly Ala Asp290 295 300Gln Ala Ala Ser Met Thr Ala Gly Val Ser Ala Tyr Thr Asp Ser Ile305 310 315 320Ser Asn Ser Ile Ser Phe Ser Ser Met Glu Ala Gly Ile Val Pro Asp325 330 335Ser Thr Val Ile Asp Met Pro Asn Ser Arg Ile Leu Thr Pro Ala Gly340 345 350Ala Ile Asn Leu Phe Ser Gly Pro Ser Leu Gln Met Ser Leu His Phe355 360 365Ser Ser Met Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr Arg Glu Lys Lys370 375 380Lys Ala Arg Lys Phe Glu Lys Thr Ile Arg Tyr Glu Thr Arg Lys Ala385 390 395 400Tyr Ala Glu Ala Arg Pro Arg Ile Lys Gly Arg Phe Ala Lys Arg Ser405 410 415Asp Val Gln Ile Glu Val Asp Gln Met Phe Ser Thr Ala Ala Leu Ser420 425 430Asp Gly Ser Tyr Ala Thr Ser Gly Met Asp Leu Ile Ala Phe Cys Phe435 440 445Glu Met Glu His Ser Pro Asn Ile450 455<210>2<211>4814<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2aaagcaaaga tgaacagagg tggactgttc tccttacaaa tttattgcaa aaaaaaaagt 60agattctcta tggagaggca tatttaacgt tatagcaggg ctataataag aaacagatgg 120ctcaaagaaa atgataagca acaaataacc cataaaggac ccatgtcata tatagatagg 180ccttgcaaac aaacaaaaaa aaggtatgca aggaaataat 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權(quán)利要求
1.一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可提高植物的光周期敏感性，所述DNA選自(a)編碼含有SEQ ID NO1或3所示氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO1或3所示氨基酸序列，但其中一或多個(gè)氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；(c)能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQ ID NO2或4所示核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中該DNA來(lái)自水稻。
3.一種DNA，其編碼與權(quán)利要求1或2的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的反義RNA。
4.一種DNA，其編碼具有特異性消化權(quán)利要求1或2所述DNA之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
5.一種DNA，其編碼能通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)而利用共抑制效應(yīng)來(lái)抑制權(quán)利要求1或2所述DNA的表達(dá)的RNA。
6.權(quán)利要求1或2的DNA，其中所述DNA用于提高植物的光周期敏感性。
7.權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)的DNA，其中所述DNA用于降低植物的光周期敏感性。
8.一種載體，其含有權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的DNA。
9.一種植物細(xì)胞，其被權(quán)利要求8的載體轉(zhuǎn)化。
10.一種植物轉(zhuǎn)化體，其含有權(quán)利要求9的植物細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
12.一種植物轉(zhuǎn)化體，它是權(quán)利要求10或11的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
13.權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的植物轉(zhuǎn)化體的繁殖材料。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求10或11所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，它包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1或2的DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，和(b)從該植物細(xì)胞再生植物。
15.一種提高植物的光周期敏感性的方法，所述方法包括在該植物體中表達(dá)權(quán)利要求1或2的DNA的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中依賴于光周期的植物開(kāi)花時(shí)間通過(guò)提高該植物的光周期敏感性而延遲。
17.一種降低植物的光周期敏感性的方法，該方法包括抑制該植物體的細(xì)胞中權(quán)利要求1或2的DNA表達(dá)的步驟，其中所述DNA為該植物細(xì)胞的內(nèi)源性DNA。
18.權(quán)利要求17的方法，其中權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述DNA是在該植物體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
19.權(quán)利要求17或18的方法，其中依賴于光周期的該植物的開(kāi)花時(shí)間通過(guò)降低該植物的光周期敏感性而提前。
20.權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是水稻。
21.一種評(píng)價(jià)植物的光周期敏感性的方法，它包括檢測(cè)該植物中權(quán)利要求1的DNA存在與否的步驟。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述植物是水稻。
23.一種宿主細(xì)胞，其中已插入了攜有權(quán)利要求1或2所述DNA的載體。
24.由權(quán)利要求1或2的DNA編碼的蛋白。
25.一種產(chǎn)生權(quán)利要求24所述蛋白的方法，它包括以下步驟培養(yǎng)權(quán)利要求23所述宿主細(xì)胞；使所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述DNA所編碼的重組蛋白；并從所述宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中回收所述重組蛋白。
26與權(quán)利要求24所述蛋白結(jié)合的抗體。
27.一種DNA，其中至少15個(gè)核苷酸與由SEQ ID NO2或4所示核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈組成的DNA互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明人從水稻中通過(guò)連鎖分析成功地分離出一種光周期敏感性基因Hdl。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，植物的光周期敏感性可通過(guò)導(dǎo)入該基因或控制該基因的表達(dá)而得到改變。本發(fā)明還證實(shí)，植物的光周期敏感性可通過(guò)檢測(cè)該功能性基因的存在或缺乏來(lái)評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1411510SQ00817402
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2000年11月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月4日
發(fā)明者矢野昌裕, 片寄裕一, 佐佐木卓治, 石丸理佐, 布施拓市, 蘆苅基行 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進(jìn)機(jī)構(gòu)