脂肪酶穩(wěn)定劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種脂肪酶穩(wěn)定劑，該脂肪酶穩(wěn)定劑包括Na2SO4和山梨醇。使用本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑能使米黑根毛霉脂肪酶達到很好的穩(wěn)定效果，為保藏和進一步的應用提供了基礎。
【專利說明】脂肪酶穩(wěn)定劑
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及酶制劑領域，具體來說，本發(fā)明涉及一種脂肪酶穩(wěn)定劑。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶是一種廣泛存在于動物、植物及微生物中的酶，因為微生物具有培養(yǎng)簡單、周期短產(chǎn)量大等特點，因此工業(yè)用途的酶制劑基本上都來源于微生物。
[0003]米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(RML)具有較高sn_l, 3選擇性,廣泛用于結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(Structured lipids)的酶法合成,如SOS、0P0、DAG的合成。就目前工業(yè)化應用前景來看，天然的米黑根毛霉產(chǎn)RML的單位產(chǎn)量較低，且成分不穩(wěn)定，提取純化工藝復雜，生產(chǎn)成本高，使得其應用受到限制。因此利用基因工程技術(shù)，在合適的生產(chǎn)宿主菌中異源表達米黑根毛霉脂肪酶基因已經(jīng)成為主流方向。諾維信公司最早報道了用米曲霉為生產(chǎn)宿主表達米黑根毛霉脂肪酶基因，并獲得工業(yè)化生產(chǎn)。盡管真菌米曲霉不失為一種優(yōu)良的表達載體，但其自身會分泌各種非目標蛋白，如:Νονο的Lipozyme RM酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量遠高于目的蛋白RML脂肪酶，另外，還有很多其他雜蛋白如:蛋白酶等，導致其提取困難，應用受限。
[0004]畢赤酵母作為能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白高效表達的優(yōu)秀宿主菌近年來得到了越來越廣泛的應用。RML在畢赤酵母中的表達研究也比較多，如CN101481695A利用酵母表面展示系統(tǒng)將改良的RML基因在畢赤酵母中表達，并將RML分泌到酵母表面，經(jīng)離心，冷凍干燥獲得菌體凍干粉，利用橄欖油測定RML水解活力為468.8U/g酵母干細胞。CN 102080092A利用7L發(fā)酵罐甲醇誘導畢赤酵母表達米黑根毛霉脂肪酶84h，用對硝基苯酚棕櫚酸酯(pNPP)法測得發(fā)酵液的脂肪酶最`高水解活力為7062.5U/ml。
[0005]畢赤酵母發(fā)酵液經(jīng)提取處理后得到的RM液體脂肪酶，該液體脂肪酶在具體應用的過程中會出現(xiàn)保存期短，酶活降低的現(xiàn)象，限制了米黑根毛霉脂肪酶的進一步開發(fā)利用和研究。目前，關(guān)于提高液體酶穩(wěn)定性的方法有較多的研究和報道。
[0006]郝秋娟等對淀粉液化芽孢桿菌產(chǎn)β -葡聚糖酶穩(wěn)定劑進行了研究。在β -葡聚糖酶溶液中添加大分子親水型多糖黃原膠、動物蛋白明膠、甘油、氯化鈉可明顯提高β_葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。將添加甘油120g/L、黃原膠5g/L復合穩(wěn)定劑的葡聚糖酶溶液60°C處理2h，酶液的殘余酶活比未經(jīng)處理的酶活提高了 55.3% (郝秋娟等，淀粉液化芽孢桿菌產(chǎn)β-葡聚糖酶培養(yǎng)基優(yōu)化以及酶穩(wěn)定劑的研究[J]，中國釀造，2006，(4):18-22)。李品周對擴展青霉堿性脂肪酶的穩(wěn)定性進行了研究，研究發(fā)現(xiàn)液體脂肪酶的最佳組合配方為4mM的Ca2+、0.0313M的四硼酸鈉和4M的丙三醇，在40°C下可提高脂肪酶熱穩(wěn)定性半衰期84h，35°C下提高酶半衰期為790h (李品周，擴展青霉堿性脂肪酶穩(wěn)定性研究[D]，福建師范大學碩士學位論文，2007)。薛正蓮等用大分子親水性多糖黃原膠，明顯提高了糖化酶的耐熱性及儲存穩(wěn)定性。在含有黃原膠、NaCl、甘油的緩沖體系中，糖化酶液于室溫放置6個月，其酶活只損失15.2%，而對照的卻損失了 39.8% (薛正蓮等，糖化酶穩(wěn)定性的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25 (4):38-40)0陳小泉等對青霉脂肪酶的穩(wěn)定劑進行了研究，青霉脂肪酶在一定濃度的鈣離子存在下，顯示出高的活性，當鈣離子濃度為2X10-2M時，酶的相對活性達180%。乙酸鈉和多羥基化合物可以作為洗滌劑的穩(wěn)定劑，其中多羥基高分子化合物對青霉脂肪酶有優(yōu)良的穩(wěn)定和激活效果(陳小泉等，洗滌劑用堿性脂肪酶穩(wěn)定劑研究[J]，南華大學學報(理工版)，2001，15 (2):17-19)。
[0007]Kaushik J K等用核糖核酸酶、α -胰凝乳蛋白酶原、溶菌酶、細胞色素C和胰蛋白酶抑制劑來研究一些有代表性的低分子量的多元醇添加劑的穩(wěn)定效果，表明肌醇效果最好，甘露醇和山梨醇居中，木糖醇最差(KaushikJ K, Bhat R.Thermal stability ofprotein in aqueous polyol solution[J].J PhyChem B, 1998，102:7058-7066)。Costa等研究了多種添加劑對來自桿菌的過氧化氫酶的影響，發(fā)現(xiàn)在4°C和30°C，甘油和聚乙烯乙二醇能增加其儲存穩(wěn)定性(Costa S A, Tzanov T, Carneiro A F, Paar A, Gubitz GM, CavacoPaulo A.Studies of stabilization of native catalase using additives[J].EnzymeMicrob Techno I, 2002, 30:387-391 )。Noel 研究了多羥基醇(山梨醇，木糖醇，赤藻糖醇，甘油以及乙二醇)以及鹽類化合物(NaCl，KCl, KBr, NaBr, LiBr以及LiCl)對脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase)穩(wěn)定性和催化活性的影響,發(fā)現(xiàn)多羥基醇比鹽類化合物對脂肪酶熱變性的保護更加有效，且多羥基醇對該酶熱變性或壓力變性的保護作用隨著多羥基醇濃度以及碳鏈增加而提高，而鹽類化合物對酶熱變性的保護效果主要取決于鹽的濃度、特性以及酶的種類(Noel M, Combes D.Rhizomucor miehei lipase:differetialscanningcalorimetry and pressure/temperature stability studies in presence ofsolubleadditives[J].Enzyme and Microbial Technology, 2003，33:299-308)。
[0008]CN 101297025A公開了一種濃縮的液體酶添加劑，其中包括酶和苯基硼酸或其衍生物和表面活性劑，其中酶以多于1.5g/L的量存在。另外，該專利還公開了用于制備濃縮的液體酶添加劑的方法。CN 101981049A公開了一些肽醛或酮衍生物對于在水性組合物，如液體洗滌劑中穩(wěn)定枯草桿菌蛋白酶類型的蛋白酶特別有效，該組合物包括具有OH-取代的苯丙氨酸作為C-末端殘基的肽化合物。CN 100519745C公開了一種提高、改進臭曲霉ZU-Gl液體發(fā)酵生產(chǎn)的α -半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護劑，重量份組成為:甘露醇18-36 ;棉籽糖76-126 ;海藻糖38-95。使用時向每100ml臭曲霉的粗酶液中加入保護劑130_260mg，采用該保護劑，使得臭曲霉ZU-Gl液體發(fā)酵生產(chǎn)的α -半乳糖苷酶在30°C -60°C酶活保留率提高11.6%-21.7%，耐酸性從pH 4.0下降到pH 3.0，在pH 3.0的環(huán)境中仍保留52%的活性。CN100384993C公開了一種提高地衣芽孢桿菌ZJUEL31410彈性蛋白酶穩(wěn)定性的方法，在該彈性蛋白酶的粗酶液中添加牛血清白蛋白、明膠和水合氯化鈣；牛血清白蛋白與粗酶液的重量體積比為l-3g/100ml，明膠與粗酶液的重量體積比為l_3g/100ml，水合氯化鈣與粗酶液的投料比為l-3mmol/L。采用該方法，能提高地衣芽孢桿菌ZJUEL31410彈性蛋白酶的熱穩(wěn)定性和pH耐受性。
[0009] 然而對于不同的酶，其穩(wěn)定劑的組成和含量千差萬別，同一種穩(wěn)定劑用于不同的酶時，其效果也會存在巨大差異。
[0010]因此，開發(fā)經(jīng)濟、有效的穩(wěn)定劑對于米黑根毛霉脂肪酶的產(chǎn)業(yè)化應用有著重要的研究意義和市場價值。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0011]本發(fā)明的發(fā)明人針對上述問題進行了深入研究，在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，將Na2SO4和山梨醇進行復配，能獲得用于脂肪酶長期保藏的穩(wěn)定劑，其穩(wěn)定效果良好。
[0012]因此，本發(fā)明的第一個目的在于，提供一種畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的液體脂肪酶的穩(wěn)定劑。
[0013]本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑包含=Na2SOjP山梨醇，優(yōu)選的，在所述穩(wěn)定劑中，Na2SO4和山梨醇的重量比為1-5:30-50。
[0014]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑為脂肪酶溶液穩(wěn)定劑。
[0015]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑用于穩(wěn)定脂肪酶溶液時，所述Na2SO4濃度為l_5wt%，所述山梨醇濃度為30-50wt% ;優(yōu)選的，所述山梨醇濃度為40_50wt%，和/或所述Na2SO4濃度為3-5wt%。 [0016]在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑中還包括:(冊14)2504、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一種或多種。優(yōu)選的，所述脂肪酶穩(wěn)定劑用于穩(wěn)定脂肪酶溶液時，
[0017]所述(NH4)2S04 的濃度為 0.5-5wt% ;和 / 或
[0018]所述蔗糖的濃度為25_50wt% ;和/或
[0019]所述海藻糖的濃度為25_50wt% ;和/或
[0020]所述Dextran-1O 的濃度為 10_30wt% ;和 / 或
[0021]所述甘油的濃度為25_50wt%。
[0022]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶。
[0023]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，優(yōu)選的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0024]本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種穩(wěn)定的脂肪酶溶液。
[0025]本發(fā)明提供的穩(wěn)定的脂肪酶溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
[0026]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述Na2SO4濃度為l_5wt%，所述山梨醇濃度為30-50wt%o優(yōu)選的，所述山梨醇的濃度為40-50wt%，和/或所述Na2SO4濃度為3_5wt%。
[0027]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述溶液中還包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一種或多種；優(yōu)選的，
[0028]所述(NH4)2S04 濃度為 0.5-5wt% ;和 / 或
[0029]所述蔗糖的濃度為25_50wt% ;和/或
[0030]所述海藻糖的濃度為25_50wt% ;和/或
[0031]所述Dextran-ΙΟ 的濃度為 10_30wt% ;和 / 或
[0032]所述甘油的濃度為25_50wt%。
[0033]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶。
[0034]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，優(yōu)選的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0035]本發(fā)明還有一個目的在于提供一種穩(wěn)定脂肪酶的方法。
[0036]本發(fā)明提供的穩(wěn)定脂肪酶的方法為，在所述脂肪酶中加入本發(fā)明提供的上述穩(wěn)定劑。
[0037]本發(fā)明還有一個目的在于，提供一種脂肪酶穩(wěn)定劑的用途。[0038]本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑可用于長期保藏脂肪酶。
[0039]使用本發(fā)明提供的穩(wěn)定劑，在脂肪酶，特別是米黑根毛霉脂肪酶的長時間保藏中，能達到很好的穩(wěn)定效果，為脂肪酶，特別是米黑根毛霉脂肪酶的保藏和進一步的應用提供了良好的基礎。
【具體實施方式】
[0040]本文所公開的“范圍”以下限和上限的形式?？梢苑謩e為一個或多個下限，和一個或多個上限。給定范圍是通過選定一個下限和一個上限進行限定的。選定的下限和上限限定了特別范圍的邊界。所有可以這種方式進行限定的范圍是包含和可組合的，即任何下限可以與任何上限組合形成一個范圍。例如，針對特定參數(shù)列出了 60-120和80-110的范圍，理解為60-110和80-120的范圍也是預料到的。此外，如果列出的最小范圍值I和2，和如果列出了最大范圍值3，4和5，則下面的范圍可全部預料到:1-3、1-4、1-5、2-3、2-4和2_5。
[0041]在本發(fā)明中，除非有其他說明，組合物的各組分的含量范圍以及其優(yōu)選范圍之間可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0042]在本發(fā)明中，除非有其他說明，“其組合”表示所述各元件的多組分混合物，例如兩種、三種、四種以及直到最大可能的多組分混合物。
[0043]在本發(fā)明中，除非有其他說明，所有“份”和百分數(shù)(％)都指重量百分數(shù)。
[0044]在本發(fā)明中，除非有其他說明，所有組合物中各組分的百分數(shù)之和為100%。
[0045]在本發(fā)明中，除非有其他說明，數(shù)值范圍“a_b”表示a到b之間的任意實數(shù)組合的縮略表示，其中a和b都是實數(shù)。例如數(shù)值范圍“0-5”表示本文中已經(jīng)全部列出了 “0-5”之間的全部實數(shù)，“0-5”只是這些數(shù)值組合的縮略表示。
[0046]如果沒有特別指出，本說明書所用的術(shù)語“一種”指“至少一種”。
[0047]如果沒有特別指出，本發(fā)明所述的百分數(shù)(包括重量百分數(shù))的基準都是所述組合物的總重量。
[0048]在本文中，除非另有說明，各組分的比例或者重量都指干重。
[0049]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有實施方式以及優(yōu)選實施方式可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0050]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有技術(shù)特征以及優(yōu)選特征可以相互組合形成新的技術(shù)方案。
[0051]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有步驟可以順序進行，也可以隨機進行，但是優(yōu)選是順序進行的。例如，所述方法包括步驟(a )和(b )，表示所述方法可包括順序進行的步驟(a)和(b)，也可以包括順序進行的步驟(b)和(a)。例如，所述提到所述方法還可包括步驟(C)，表示步驟(C)可以任意順序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步驟(a)、(b)和(c),也可包括步驟(a)、(C)和(b),也可以包括步驟(C)、(a)和(b)等。
[0052]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的“包括”表示開放式，也可以是封閉式。例如，所述“包括”可以表示還可以包含沒有列出的其他元件，也可以僅包括列出的元件。
[0053]在本發(fā)明中，如果沒有特別的說明，本文實施例中的具體數(shù)值以及具體物質(zhì)可與本文描述部分的其他特征結(jié)合。例如，本文描述部分提到反應的溫度為10-100°c，而實施例提到的反應溫度為20°C，那么可以認為本文已經(jīng)具體公開了 10-20°C的范圍，或者20-100°C的范圍，且該范圍可以描述部分的其他特征結(jié)合起來形成新的技術(shù)方案。又例如，本文描述部分提到一類化合物醇，而實施例提到的具體的醇為乙醇，那么乙醇可以與描述部分的其他特征結(jié)合起來形成新的技術(shù)方案。
[0054]在本發(fā)明中，除非有相反的說明，所有的比例均為重量比，所有的百分數(shù)均為重量百分數(shù)，溫度的單位為。C，壓力的單位為帕。室溫指實驗室內(nèi)常規(guī)的環(huán)境溫度，隨季節(jié)和位置變化，通常為25°C。另外，本發(fā)明描述的所有數(shù)值范圍均包括端值并且可以包括將公開的范圍的上限和下限互相任意組合得到的新的數(shù)值范圍。例如，如果公開了某種組分的重量百分含量為10-30重量％，優(yōu)選15~25重量％，更優(yōu)選20-23重量％，則相當于同時公開了以下的數(shù)值范圍:10~15重量％、10~25重量％、10^20重量％、10~23重量％、15~30重量％、15~20重量％、15~23重量％、20~25重量％、23~25重量％。
[0055]本發(fā)明的發(fā)明人在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，將Na2SO4和山梨醇進行復配，能獲得用于脂肪酶長期保藏的穩(wěn)定劑，利于脂肪酶的保藏，特別是長期保藏。
[0056]脂肪酶穩(wěn)定劑
[0057]本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑包含=Na2SO4和山梨醇，優(yōu)選的，所述Na2SO4和山梨醇的重量比為1-5:30_50。
[0058]在本發(fā)明中，“穩(wěn)定劑”指的是:能穩(wěn)定酶的特定物質(zhì)(化合物或組合物)，特別是指在酶中加入特定化合物或組合物，(在保藏，特別是長期保藏后)酶的活性能得到很好的保持的物質(zhì)。“酶的活性能得到很好的保持”指的是:與初始時的酶活相比，(在保藏，特別是長期保藏后)該酶的酶活能維持在80%以上，優(yōu)選85%以上，更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選98%以上。
[0059]在本發(fā)明中，Na`2SO4和山梨醇的重量比，例如可以為但不限于:1:30，1:35，1:40，1:45，1: 50，2: 30，2: 32，2:34，2: 36，2: 38，2:40，2:42，2:44，2:46，2:48，2: 50，3: 31，3: 33，3: 35，3:37，3: 39，3:41，3:43，3:45，3:47，3:49，4:30，4: 34，4: 38，4:42，4:46，4: 50，5: 30，5:32，5:35，5:37，5:39，5:42，5:45，5:47，5:50。
[0060]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑包含:l-5wt%Na2S04和30-50wt%山梨醇。
[0061]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑包含:40-50被％山梨醇。優(yōu)選的，所述脂肪酶穩(wěn)定劑包含:3-5wt% Na2SO4和40_50wt%山梨醇。
[0062]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的Na2SO4的濃度為1.0wt%, 1.lwt%, 1.2wt%,
1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，
2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，
3.5wt%，3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，
4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，4.9wt%，5.0wt%。
[0063]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的山梨醇的濃度為30wt%，3 lwt%，32wt%,33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0064]對于本領域的技術(shù)人員而言，在本發(fā)明公開的內(nèi)容的基礎上，對脂肪酶穩(wěn)定劑中Na2SO4和山梨醇的濃度做進一步的調(diào)整，以獲得合適的脂肪酶穩(wěn)定劑也是可能的。如將 Na2SO4 的濃度調(diào)整為 0.1-0.9wt%，如 0.lwt%, 0.2wt%, 0.3wt%, 0.4wt%，0.5wt%，0.6wt%，
0.7wt%，0.8wt%，0.9wt%，或調(diào)整為 6_10wt%，如 6.0wt%，6.lwt%，6.2wt%，6.3wt%，6.4wt%，
6.5wt%，6.6wt%，6.7wt%，6.8wt%，6.9wt%，7.0wt%，7.lwt%，7.2wt%，7.3wt%，7.4wt%，7.5wt%，
7.6wt%，7.7wt%，7.8wt%，7.9wt%，8.0wt%，8.lwt%，8.2wt%，8.3wt%，8.4wt%，8.5wt%，8.6wt%，
8.7wt%，8.8wt%，8.9wt%，9.0wt%，9.lwt%，9.2wt%，9.3wt%，9.4wt%，9.5wt%，9.6wt%，9.7wt%，
9.8wt%，9.9wt%，10.0wt% ;或?qū)⑸嚼娲嫉臐舛日{(diào)整為 10_29wt%，如 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，或調(diào)整為 51_70wt%，如 51wt%，52wt%，53wt%，54wt%，55wt%，56wt%，57wt%，58wt%，59wt%，60wt%，61wt%，62wt%，63wt%，64wt%，65wt%，66wt%，67wt%，68wt%，69wt%，70wt%o
[0065]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶穩(wěn)定劑還包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一種或多種；優(yōu)選的，所述(NH4)2SO4濃度為0.5_5wt%，蔗糖濃度為 25-50wt%，海藻糖濃度為 25-50wt%，Dextran-ΙΟ 濃度為 10_30wt%，甘油濃度為 25_50wt%。
[0066]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶穩(wěn)定劑中加入了(NH4)2SO4，其加入的濃度為 0.5wt %，0.6wt %，0.7wt %，0.8wt %，0.9wt %，1.0wt %，1.1wt %，1.2wt%，1.3wt%，
1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，2.4wt%，
2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，3.5wt%，
3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，4.6wt%，
4.7wt%，4.8wt%，4.9wt% 或 5.0wt%。
[0067]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶穩(wěn)定劑中加入了蔗糖，其加入的濃度為 25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0068]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶穩(wěn)定劑中加入了海藻糖，其加入的濃度為 25wt%，26wt%，27wt%，28wt%,29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%,34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0069]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶穩(wěn)定劑中加入了 Dextran-lO，其加入的濃度為 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%,24wt%,25wt%,26wt%，27wt%,28wt%，29wt%，30wt%o
[0070]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶穩(wěn)定劑中加入了甘油，其加入的濃度為25wt %，26wt %，27wt %，28wt %，29wt %，30wt %，3 Iwt %，32wt %，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，50wt%o
[0071]在本發(fā)明的另一些更優(yōu)選的實施例中，加入了上述濃度的=(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一種或多種。
[0072]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，用于脂肪酶溶液時，所述脂肪酶穩(wěn)定劑由Na2SO4和山梨醇組成，所述溶液中，Na2SO4濃度為1_5被％和山梨醇濃度為30-50wt%。
[0073]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中 ，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶，優(yōu)選的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0074]穩(wěn)定的脂肪酶溶液
[0075]本發(fā)明提供的穩(wěn)定的脂肪酶溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
[0076]在本發(fā)明中，“穩(wěn)定的脂肪酶溶液”指的是:將該脂肪酶溶液進行保藏，特別是長期保藏后，脂肪酶的活性能得到很好的保持。“脂肪酶的活性能得到很好的保持”指的是:與初始時的脂肪酶的酶活相比，(在保藏，特別是長期保藏后)該脂肪酶的酶活能維持在80%以上，優(yōu)選85%以上，更優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選98%以上。
[0077]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述溶液中，Na2SO4濃度為l_5wt%，所述山梨醇濃度為30-50wt%。優(yōu)選的，所述山梨醇的濃度為40-50wt%，和/或所述Na2SO4濃度為3_5wt%。
[0078]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的Na2SO4的濃度為1.0wt%, 1.lwt%, 1.2wt%,
1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，
2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，2.7wt%，2.8wt%，2.9wt%，3.0wt%，3.lwt%，3.2wt%，3.3wt%，3.4wt%，
3.5wt%，3.6wt%，3.7wt%，3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，
4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，4.9wt%，或 5.0wt%。
[0079]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，使用的山梨醇的濃度為30wt%，3 lwt%，32wt%,33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%，41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或 5Qwt%。
[0080]對于本領域的技術(shù)人員而言，在本發(fā)明公開的內(nèi)容的基礎上，對溶液中Na2SO4和山梨醇的濃度做進一步的調(diào)整，以獲得合適的穩(wěn)定的脂肪酶溶液也是可能的。如將Na2SO4的濃度調(diào)整為 0.1-0.9wt%，如 0.lwt%，0.2wt%，0.3wt%，0.4wt%，0.5wt%，0.6wt%，0.7wt%，0.8wt%，或 0.9wt%，或調(diào)整為 6_10wt%，如 6.0wt%，6.lwt%，6.2wt%，6.3wt%，6.4wt%，6.5wt%，
6.6wt%，6.7wt%，6.8wt%，6.9wt%，7.0wt%，7.lwt%，7.2wt%，7.3wt%，7.4wt%，7.5wt%，7.6wt%，
7.7wt%, 7.8wt%, 7.9wt%, 8.0wt%, 8.lwt%，8.2wt%, 8.3wt%, 8.4wt%, 8.5wt%, 8.6wt%, 8.7wt%,
8.8wt%，8.9wt%，9.0wt%，9.lwt%，9.2wt%，9.3wt%，9.4wt%，9.5wt%，9.6wt%，9.7wt%，9.8wt%，
9.9wt%，或 10.0wt% ;或?qū)⑸嚼娲嫉臐舛日{(diào)整為 10-29wt%，如 10wt%，llwt%，12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，或 29wt%，或調(diào)整為 51_70wt%，如 51wt%，52wt%，53wt%，54wt%，55wt%，56wt%，57wt%，58wt%，59wt%，60wt%，61wt%，62wt%，63wt%，64wt%，65wt%，66wt%，67wt%，68wt%，69wt%，或 70wt%。
[0081]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述溶液還包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-ΙΟ、甘油中的一種或多種；優(yōu)選的，所述(NH4)2SO4濃度為0.5_5wt%，蔗糖濃度為25-50wt%，海藻糖濃度為 25-50wt%，Dextran-ΙΟ 濃度為 10_30wt%，甘油濃度為 25_50wt%。
[0082]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶溶液中可加入了(NH4)2SO4,其濃度為
0.5wt%, 0.6wt%, 0.7wt%, 0.8wt%，0.9wt%，1.0wt%，1.lwt%，1.2wt%，1.3wt%，1.4wt%，1.5wt%，
1.6wt%，1.7wt%，1.8wt%，1.9wt%，2.0wt%，2.lwt%，2.2wt%，2.3wt%，2.4wt%，2.5wt%，2.6wt%，
2.7wt%, 2.8wt%, 2.9wt%, 3.0wt%, 3.lwt%，3.2wt%, 3.3wt%, 3.4wt%, 3.5wt%, 3.6wt%, 3.7wt%,
3.8wt%，4.9wt%，4.0wt%，4.lwt%，4.2wt%，4.3wt%，4.4wt%，4.5wt%，4.6wt%，4.7wt%，4.8wt%，
4.9wt%，或 5.0wt%o
[0083]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶溶液中可加入蔗糖，其濃度為25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%, 42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0084]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶溶液中可加入海藻糖，其濃度為25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0085]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶溶液中加入了 Dextran-10，其濃度為10wt%，11wt%,12wt%，13wt%，14wt%，15wt%，16wt%，17wt%，18wt%，19wt%，20wt%，21wt%，22wt%，23wt%，24wt%，25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，或 30wt%。
[0086]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，脂肪酶溶液中加入了甘油，其濃度為25wt%，26wt%，27wt%，28wt%，29wt%，30wt%，31wt%，32wt%，33wt%，34wt%，35wt%，36wt%，37wt%，38wt%，49wt%，40wt%, 41wt%，42wt%，43wt%，44wt%，45wt%，46wt%，47wt%，48wt%，49wt%，或50wt%o
[0087]在本發(fā)明的另一些更優(yōu)選的實施例中，加入了上述濃度的(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一種或多種。
[0088]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶溶液的穩(wěn)定劑由l_5wt%Na2S04和30-50wt%山梨醇組成。
[0089]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶，優(yōu)選的米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0090]用途
[0091]本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑可用于保藏脂肪酶，優(yōu)選的，該脂肪酶穩(wěn)定劑可用于脂肪酶的長期保藏。
[0092]對于本領域的技術(shù)人員而言，本發(fā)明提供的脂肪酶穩(wěn)定劑既然可用于長期保藏脂肪酶，那么在用于脂肪酶的短期保藏中能對脂肪酶起到很好的穩(wěn)定作用則是必然的。
[0093]在本發(fā)明中，“長期保藏”指的是在較低溫度下保藏一段較長的時間，如在4°C條件下保藏時間6個月以上，優(yōu)選I年以上，更優(yōu)選18個月以上，更優(yōu)選2年以上。對于本領域的技術(shù)人員，“長期保藏”后酶活的保存效果，可以通過加速試驗，如高溫加速試驗，進行確定，如根據(jù)在40°C條件下保藏18天的酶活保存的效果，可以預測在4°C條件下，將酶(如本發(fā)明中的脂肪酶)保藏I年，甚至更長時間后，酶活的保存效果。
[0094]優(yōu)點
[0095]使用本發(fā)明提供的穩(wěn)定劑，在脂肪酶，特別是米黑根毛霉脂肪酶的長時間保藏中，能達到很好的穩(wěn)定效果，為脂肪酶，特別是米黑根毛霉脂肪酶的保藏和進一步的應用提供了良好的基礎。
[0096]在閱讀了以上說明書之后，本領域技術(shù)人員可以在本領域所涵蓋的范圍之內(nèi)對以上所述實施方式進行一定程度的改良、替代和組合，從而實施本發(fā)明并獲得類似的技術(shù)效果。所有這些改良、替代和組合也都包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
[0097]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行進一步的詳細論述，以便于人們更深刻而準確地理解本發(fā)明。但是需要指出的是，以下的具體實施例僅僅是用于舉例說明的目的，不會對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制，本發(fā)明的范圍僅僅由權(quán)利要求書限定。
[0098]菌株
[0099]在本發(fā)明的下述實施例中，作為生產(chǎn)菌株使用的工程菌WILMAR-RML的構(gòu)建方法如下:
[0100]按照畢赤酵母表達手冊(Pichia Expression Kit, Invitrogen),在畢赤酵母GS115 (購自Invitrogen)中，轉(zhuǎn)入米黑根毛霉脂肪酶基因RML (序列如SEQ IDN0:1所示)。
[0101]原料
[0102]在本發(fā)明的下述實施例中，使用的試劑均購自BBI。
[0103]設備
[0104]在本發(fā)明的下述實施例中，微濾和超濾步驟在切向流超濾系統(tǒng)中進行，該切向流超濾系統(tǒng)購自美國PALL公司。
[0105]檢測方法
[0106]在本發(fā)明的下述實施例中，
[0107] 酶活力的定義為:40°C，每分鐘催化底物釋放出Iymol脂肪酸所需的酶量，定義為一個酶活單位。
[0108]酶活計算公式:
[0109]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述脂肪酶穩(wěn)定劑包含=Na2SO4和山梨醇，優(yōu)選的，所述Na2SO4和山梨醇的重量比為1-5:30-50。
2.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述脂肪酶穩(wěn)定劑為脂肪酶溶液穩(wěn)定劑。
3.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，用于脂肪酶溶液時，所述Na2SO4濃度為l_5wt%，所述山梨醇濃度為30-50wt%。
4.如權(quán)利要求3所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述山梨醇濃度為40-50wt%。
5.如權(quán)利要求3所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述Na2SO4濃度為3-5wt%。
6.如權(quán)利要求1所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述脂肪酶穩(wěn)定劑中還包括:(NH4)2S04、鹿糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求6所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，用于脂肪酶溶液時， 所述(NH4)2SO4的濃度為0.5-5wt% ;和/或 所述蔗糖的濃度為25-50wt% ;和/或 所述海藻糖的濃度為25-50wt% ;和/或 所述Dextran-1O的濃度為10_30wt% ;和/或 所述甘油的濃度為25-50wt%。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶。
9.如權(quán)利要求8所述的脂肪酶穩(wěn)定劑，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQ ID NO:1 所示。
10.一種穩(wěn)定的脂肪酶溶液，其特征在于，所述溶液中包含Na2SO4和山梨醇。
11.如權(quán)利要求10所述的溶液，其特征在于，所述Na2SO4濃度為l_5wt%，所述山梨醇濃度為 30_50wt%。
12.如權(quán)利要求11所述的溶液，其特征在于，所述山梨醇的濃度為40-50wt%。
13.如權(quán)利要求11所述的溶液，其特征在于，所述Na2SO4濃度為3_5wt%。
14.如權(quán)利要求10所述的溶液，其特征在于，所述溶液中還包括:(NH4)2SO4、蔗糖、海藻糖、Dextran-10、甘油中的一種或多種；優(yōu)選的， 所述(NH4)2SO4濃度為0.5-5wt% ;和/或 所述蔗糖的濃度為25-50wt% ;和/或 所述海藻糖的濃度為25-50wt% ;和/或 所述Dextran-1O的濃度為10_30wt% ;和/或 所述甘油的濃度為25-50wt%。
15.如權(quán)利要求10-14中任一項所述的溶液，其特征在于，所述脂肪酶為米黑根毛霉脂肪酶。
16.如權(quán)利要求15所述的溶液，其特征在于，所述米黑根毛霉脂肪酶的序列如SEQIDNO:1所示。
17.一種穩(wěn)定脂肪酶的方法，其特征在于，在所述脂肪酶中加入權(quán)利要求1-9中任一項所述的穩(wěn)定劑。
18.權(quán)利要求1-9中任一項所述的脂肪酶穩(wěn)定劑用于保藏脂肪酶的用途，優(yōu)選的，所述保藏 為長期保藏。
【文檔編號】C12N9/96GK103773751SQ201210405053
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月22日
【發(fā)明者】顧思天, 關(guān)惠琴, 高霓思, 常桂芳 申請人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司