生產(chǎn)華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種生產(chǎn)華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法，以及所述黑曲霉基因工程菌在生產(chǎn)華根霉脂肪酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]黑曲霉(Aspergillusniger)是一種重要的工業(yè)微生物,在工業(yè)酶制劑方面應(yīng)用廣泛，可以產(chǎn)生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等30多種酶制劑；此外黑曲霉用于食品釀造和加工方面已經(jīng)有上百年的歷史，因此被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS (Generallyrecognized as safe,通常認(rèn)為是安全的)菌株,可以用于食品和藥品級(jí)酶制劑的生產(chǎn)。由于黑曲霉具備出色的蛋白質(zhì)分泌能力、高度的安全性，成熟的發(fā)酵及后處理工藝，因此，常被作為宿主菌用以表達(dá)異源酶基因。
[0003]華根霉脂肪酶(Rhizopus chinensis lipase, RCL)是絲狀真菌華根霉分泌的脂肪酶，研究表明RCL能夠顯著增加面包的比容、改善面包結(jié)構(gòu)、延緩面包老化，與國(guó)內(nèi)同類(lèi)產(chǎn)品相比，RCL在改善面包和饅頭的硬度、彈性、膠著性和咀嚼性方面效果更佳，能夠替代傳統(tǒng)的化學(xué)改良劑(如溴酸鉀)，具有重要應(yīng)用價(jià)值。但是，天然的華根霉產(chǎn)脂肪酶能力有限，而且出于食品安全方面的考慮，它所分泌的脂肪酶不能直接作為食品添加劑。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，RCL的基因被克隆，研究人員在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了 RCL的高效表達(dá)(中國(guó)專(zhuān)利，公開(kāi)號(hào):CN102911888A)，但是畢赤酵母發(fā)酵過(guò)程中需要添加甲醇，甲醇一種劇毒化學(xué)物質(zhì)，微量的甲醇就會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)損害、眼部損害及代謝性酸中毒，因此以甲醇作為誘導(dǎo)劑生產(chǎn)的RCL仍然不能作為食品添加劑。本發(fā)明人研究中發(fā)現(xiàn)，如果將RCL與其它真菌表達(dá)研究中的常用啟動(dòng)子(如構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶啟動(dòng)子PtrpC、黑曲霉糖化酶啟動(dòng)子PglaA等)融合時(shí)，不能有效實(shí)現(xiàn)RCL的表達(dá)；另外，如果將RCL的成熟肽與其它分泌信號(hào)融合時(shí)，在黑曲霉中不能有效地實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)RCL在食品加工領(lǐng)域的應(yīng)用，急需開(kāi)發(fā)一種高產(chǎn)食品級(jí)的RCL的菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種生產(chǎn)華根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制備方法，所述黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品級(jí)的華根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高達(dá)到263 IU/mL，產(chǎn)生的華根霉脂肪酶分泌到胞外，無(wú)需破碎菌體，華根霉脂肪酶存在于培養(yǎng)基中，操作簡(jiǎn)單，便于分離純化；并且該黑曲霉基因工程菌培養(yǎng)條件粗放，適合固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，在產(chǎn)酶條件下不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)食品級(jí)的華根霉脂肪酶。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)方面是涉及一種華根霉脂肪酶表達(dá)盒，所述表達(dá)盒從5’至3’依次包含以下元件:
(1)擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpdp；
(2)華根霉脂肪酶基因RCL;
(3)構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C基因的終止子TtrpC； 所述Pgpdp的序列為SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述RCL的編碼序列為SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
[0006]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，經(jīng)過(guò)大量篩選，意外地發(fā)現(xiàn)，將華根霉RCL編碼基因，擴(kuò)展青霉Pgpdp啟動(dòng)子、構(gòu)巢曲霉TtrpC終止子等元件組合在一起,可以實(shí)現(xiàn)RCL在黑曲霉中的高效表達(dá)。同時(shí)，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，采用RCL自身的信號(hào)肽序列，可以實(shí)現(xiàn)RCL的高效分泌表達(dá)，分泌水平遠(yuǎn)高于RCL的成熟肽與其它分泌信號(hào)組合的情況。另外，采用擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpdp可以實(shí)現(xiàn)RCL的高效表達(dá)，表達(dá)量遠(yuǎn)高于其它啟動(dòng)子，并且生產(chǎn)的RCL分泌到胞外，無(wú)需破碎菌體即可分離純化，操作簡(jiǎn)單，便于后續(xù)產(chǎn)物的回收和精制。黑曲霉為GRAS菌株，它所表達(dá)的RCL可以作為食品添加劑，應(yīng)用于各食品加工領(lǐng)域。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有華根霉脂肪酶表達(dá)盒，并且分泌表達(dá)華根霉脂肪酶。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及一種黑曲霉基因工程菌，所述黑曲霉基因工程菌含有所述的華根霉脂肪酶表達(dá)盒或所述的表達(dá)載體，并且表達(dá)分泌表達(dá)華根霉脂肪酶。
[0009]所述的黑曲霉基因工程菌的制備方法包括如下步驟:
(O獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至目標(biāo)質(zhì)粒上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒；
(2)分別擴(kuò)增華根霉的脂肪酶基因RCL、擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpdp和構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C的終止子TtrpC，得到有強(qiáng)啟動(dòng)子的RCL基因超表達(dá)盒；
(3)將所述RCL基因超表達(dá)盒插入潮霉素抗性的重組質(zhì)粒中，獲得含潮霉素篩選標(biāo)記的RCL基因超表達(dá)載體；
(4)將含潮霉素篩選標(biāo)記的RCL基因超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將RCL基因超表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到黑曲霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。
[0010]進(jìn)一步地，所述的黑曲霉基因工程菌的制備方法包括如下步驟:
(1)利用PCR技術(shù)或限制性酶切技術(shù)獲得潮霉素抗性表達(dá)盒并克隆至質(zhì)粒PCHAMBIA2300上，獲得潮霉素抗性的重組質(zhì)粒pCHAMBIA2302 ；
(2)利用RT-PCR技術(shù)從華根霉RNA中獲得華根霉脂肪酶的編碼基因RCL，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增構(gòu)巢曲霉色氨酸合成酶C的終止子TtrpC，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得RCL-TtrpC的融合片段，將該融合片段克隆至PMD18-T載體，構(gòu)建出pMD18-T: =RCL-TtrpC ；
(3)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因的啟動(dòng)子Pgpdp，然后克隆至 pMD18-T: =RCL-TtrpC 載體上，構(gòu)建出 pMD18_T: =Pgpdp-RCL-TtrpC ；
(4)利用限制性?xún)?nèi)切酶將表達(dá)盒Pgpdp-RCL-TtrpC酶切出來(lái)，克隆至pCHAMBIA2302載體上，構(gòu)建出最終載體 pCHAMBIA2302: =Pgpdp-RCL-TtrpC ；
(5)將載體pCHAMBIA2302::Pgpdp-RCL_TtrpC通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化工程農(nóng)桿菌EHA105，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將RCL基因超表達(dá)盒轉(zhuǎn)化到黑曲霉菌株中，獲得高表達(dá)脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。其中，利用PCR鑒定長(zhǎng)出的黑曲霉轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定為陽(yáng)性的黑曲霉轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步用Southern雜交確認(rèn),Southern雜交確認(rèn)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子用于發(fā)酵和酶活力檢測(cè)。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及一種華根霉脂肪酶的生產(chǎn)方法，包括培養(yǎng)所述的黑曲霉基因工程菌，從培養(yǎng)體系中獲得華根霉脂肪酶。其中，所述的培養(yǎng)采用兩步生長(zhǎng)法，即菌體生長(zhǎng)階段和表達(dá)階段。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
(1)黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品級(jí)的華根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高達(dá)到263IU/mL，并且該黑曲霉基因工程菌培養(yǎng)條件粗放，適合固體培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，在產(chǎn)酶條件下不會(huì)產(chǎn)生真菌毒素和抗生素，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)食品級(jí)的華根霉脂肪酶；
(2)產(chǎn)生的華根霉脂肪酶分泌到胞外，無(wú)需破碎菌體，華根霉脂肪酶存在于培養(yǎng)基中，操作簡(jiǎn)單，便于分離純化；
(3)使用黑曲霉作為宿主菌，它與原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比有以下優(yōu)點(diǎn):a、是食品安全菌株，表達(dá)產(chǎn)物可以應(yīng)用于食品和藥品領(lǐng)域；b、易培養(yǎng)；c、高表達(dá)；d、強(qiáng)大的翻譯、加工和折疊系統(tǒng)；e、發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是華根霉脂肪酶表達(dá)盒；
Pgpdp:擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，RCL:華根霉脂肪酶基因，TtrpC:色氨酸合成酶C基因的終止子；
圖2是黑曲霉表達(dá)質(zhì)粒pCHAMBIA2302::Pgpdp-RCL-TtrpC的物理圖譜；
Pgpdp:擴(kuò)展青霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因啟動(dòng)子，RCL:華根霉脂肪酶基因，TtrpC:色氨酸合成酶C基因的終止子，PtrpC:色氨酸合成酶C基因的終止子的啟動(dòng)子，HygB:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，Sal 1、Spe 1.Pme 1:限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，LB,RB:T_邊界的左邊界、右邊界；
圖3是黑曲霉轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)結(jié)果；
Tl至Τ5:5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，+:陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，WT:未轉(zhuǎn)化的黑曲霉菌株，M:DL-2000Marker ；
圖4是黑曲霉轉(zhuǎn)化子的Southern雜交結(jié)果；T1至T5:5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，+:陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，WT:未轉(zhuǎn)化的黑曲霉菌株；
圖5是黑曲霉轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵酶活力檢測(cè)結(jié)果。T1-T5:5個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子，WT:未轉(zhuǎn)化的黑曲霉囷株。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化