專利名稱：一株深綠木霉菌株及其在制備纖維素酶方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一 株高產(chǎn)纖維素酶的深綠木霉B-8-1-34菌株及其在制備纖維素酶方面的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
纖維素類物質(zhì)是自然界中最為豐富的可再生資源之一。將天然纖維素降解為可利用的糖類，再進一步轉(zhuǎn)化為乙醇、菌體蛋白、氣體燃料等物質(zhì)，對解決當今世界所面臨的環(huán)境污染、糧食短缺、資源緊張和能源危機等問題具有重大現(xiàn)實意義，而纖維素酶是降解纖維素最有效的生物催化劑。酶解法的高成本是生物質(zhì)能源工業(yè)化的主要制約因素之一。降低纖維素酶成本主要涉及降低纖維素酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)基及發(fā)酵成本、提高纖維素酶活性等問題，因此，提供能夠利用廉價原料，發(fā)酵周期短的菌株產(chǎn)生高活性纖維素酶對木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源具有重要的意義。纖維素酶種類繁多，許多微生物特別是真菌具有產(chǎn)生這種復(fù)合酶的能力，其中產(chǎn)酶能力較強的有木霉、曲霉、根霉和青霉等，尤以木霉屬菌種居多。木霉具有較強的分解纖維素的能力，在木質(zhì)素、纖維素豐富的基質(zhì)上生長快。文獻“原生質(zhì)體紫外誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株”(胡婷婷等化學(xué)與生物工程，2008，3，67-67)報道了以綠色木霉為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變獲得突變菌株UVT12，其CMC酶活達到1020. 24U/g。中國發(fā)明專利CN200810023480. 8 “一種提高纖維素酶產(chǎn)量的里氏木霉培養(yǎng)方法”、CN201010040047. 2 “一種高效生產(chǎn)纖維素酶的方法”、CN200910153354. 9 “利用里氏木霉制備纖維素酶”和CN201010176883.3 “一種提高纖維素酶單位活性的液體發(fā)酵工藝”公開了利用里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的方法及工藝；發(fā)明專利CN200710180525. 8 “一種酸性液體纖維素酶的生產(chǎn)方法”、CN200910210154. 2 “一種以造紙短纖維為碳源發(fā)酵生產(chǎn)液體纖維素酶的方法”和CN200910259677. 6 “一種液態(tài)纖維素酶的制備方法”公開了利用綠色木霉生產(chǎn)纖維素酶的方法及工藝。文樣“Trichoderma atroviride mutants with enhanced productionof cellulase and β -glucosidase on pretreated willow，，(Krisztina Kovacs 等，Enzyme and Microbial Technology, 2008,43 :48 - 55)報道了通過誘變獲得了三株深綠木霉 TUB F-1721、TUB F-1741 和 TUB F-1753，濾紙酶活分別達到 I. 14、I. 18 和 I. 14 FPU/ml,η 文獻“Enzymatic hydrolysis of steam-pretreated lignocellulosic materialswith Trichodertm atroviride enzymes produced in-house (Krisztina Kovacs 等，Biotechnology for Biofuels, 2009, 2:14)報道了以深綠木霉 TUB F-1663 生產(chǎn)纖維素酶，以小麥秸桿為底物糖化，其水解率達到60-65%，葡萄糖含量達到9. 6 10. 4 g/L，文獻“Enzymatic hydrolysis and simultaneous saccharification and fermentationof steam-pretreated spruce using crude Trichodertm reesei and Trichodertmatroviride enzymes，，(Krisztina Kovacs 等，Process Biochemistry , 2009, 44:1323 -1329)以云杉木屑為底物進行糖化，其糖化率達到了 62%，葡萄糖含量達到18. 5 g/L。但距工業(yè)化應(yīng)用還有一定距離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過篩選，目的在于提供一株酶活力高的深綠木霉B-8-l-34(7>icAoofe/maatroviriofeB8-1-34)菌株；另一目的在于提供該菌株在生產(chǎn)纖維素酶方面的應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明以木糖渣為唯一碳源，從自然界分離篩選并經(jīng)過紫外線和亞硝基胍誘變選育獲得了產(chǎn)纖維素酶能力較強的菌株B-8，經(jīng)分子鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確定該菌株為深綠木霉(Trichoderma airoririofe),進一步經(jīng)過誘變選育獲得一株高產(chǎn)菌株深綠木霉B-8-1-34。該菌株已于2012年8月10日保藏，保藏號為CGMCC No. 6390。該菌株在制備纖維素酶方面的應(yīng)用，通過液態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)
⑴將菌種保藏號為CGMCC No. 6390的深綠木霉B-8-1-34活化后，制成濃度為IO6 IOVmL的孢子懸液，按I 10%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，26 32°C，150 220 rpm振 蕩培養(yǎng)，得種子液，然后將種子液以2 15%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH4. O 6. O,裝液量為30 60mL/250mL，于26 32°C，150 220rpm搖床中培養(yǎng)60 96h ；
⑵將步驟⑴獲得的發(fā)酵液離心分離，取上清液作為粗酶液；
所述的種子培養(yǎng)基組成羧甲基纖維素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%，CaCl2 O. 04%, KH2PO4 O. 1%，余量為蒸餾水，各組分以重量百分比計；
所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成1 5%的玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣的單一成份或混合物，并添加麩皮O. 05 3%、玉米漿O. 05 5%，蛋白胨O. 05 I. O %或酵母粉O. 05 I. 0%的單一成份或一種以上成份；添加O. 01 O. 5%硝酸鉀、O. 02 O. 3%磷酸二氫鉀、O. 01 O. 08%硫酸鎂和O O. 05%氯化鈣；添加O. 01 O. 2mmol/L的硫酸猛、硫酸亞鐵或氯化鈷,余量為蒸懼水,各組分以重量百分比計。本發(fā)明也可以通過固態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)
(I)將菌種保藏號為CGMCC No. 6390的深綠木霉B-8-1-34活化后，制成濃度為IO6 IOVml的孢子懸液。將孢子懸液直接接種到固體培養(yǎng)基上或接種至種子培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后將種子液以2 15%接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。裝瓶量為6 12 g/250mL,料液比為I :1 2，于26-32°C培養(yǎng)，定期翻料。(2)發(fā)酵60 120h，加入緩沖液浸提O. 5 4h，浸提緩沖液為O. 05 mo I/L ρΗ5· O的醋酸-醋酸鈉緩沖液或O. 05 mo I/L pH5. O檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其加入量為固體物料重量的8 12倍，固液分離制備粗酶液，測定其FPA、CMC酶活及β -葡萄糖苷酶酶活。所述的固體培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基；
所述的種子培養(yǎng)基組成羧甲基纖維素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%,CaCl2 O. 04%,KH2PO4 0.1%，余量為蒸餾水。各組分以重量百分比計。121°C高壓滅菌25 min,于26 32°C，150 220rpm搖床中培養(yǎng)18 26h，即得種子液。將上述制備的種子液以2 15%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣等單一成份或混合物，原料粉碎后過40 60目篩，添加量為10 60%，優(yōu)選為20%木糖渣和40%稻草，添加麩皮(2 40%)、玉米漿(5 40%)、豆餅粉(O. 5 5%)、(MM)2SO4 (O. 3 3%)、硝酸鉀(O. 01 I. 0%)、硝酸銨(O. 01 I. 0%)、蛋白胨(O. 01 1.0%)或尿素(O. 01 1.0%)的一種或兩種以上混合物；添加磷酸二氫鉀(O. 2 2%)、氯化鈣(O. 02 O. 2%)，七水硫酸鎂(O. 01 O. 1%)。各組分以重量百分比計。如上所述液體發(fā)酵或固體發(fā)酵制備的粗酶液，可經(jīng)超濾、鹽析或有機溶劑沉淀等方法獲得纖維素酶粉。通過發(fā)酵并測定所產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活(FPA)、CMC酶活及β-葡萄糖苷酶酶活。該菌株在纖維素酶水解木質(zhì)纖維素方面的應(yīng)用
在O. 05mol/L pH 5. O的醋酸-醋酸鈉或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，將如上制備的粗酶液或酶粉加入到玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣等木質(zhì)纖維素中，45 55°C水解24 120h。料液比為O. 5 2:10，酶添加量為I 6FPA/ml。木質(zhì)纖維素和酶可以一次性加入也可以分批加入。本發(fā)明提供的一株深綠木霉B-8-1-34 (.Trichoderma atroviride B-8-1-34),其 液態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中當以2. 5%木糖渣為碳源時，發(fā)酵66h，F(xiàn)PA達到176. 32IU/g，CMC酶活為238. 4IU/g，β -葡萄糖苷酶酶活為206. 72IU/g。用粗酶液糖化木糖渣和玉米芯48h，還原糖濃度分別達3. 7%和4. 4%。其優(yōu)勢在于發(fā)酵周期短，所產(chǎn)纖維素酶活力高，組分合理，水解木質(zhì)纖維素能力強。本發(fā)明為解決纖維素資源利用中酶活力不高、酶組分不合理導(dǎo)致的生產(chǎn)成本高，糖化效率低等問題提供了新的菌種資源，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，對木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源具有重要的意義。該菌株已于2012年8月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心((北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCC No. 6390。
具體實施例方式實施例I深綠木霉B-8-1-34液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶
將菌種保藏號為CGMCC No. 6390的深綠木霉B-8-1-34菌株活化后制成IO6HiL孢子懸液，按5%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，于30°C，180rpm搖床中培養(yǎng)24h，再以10%接種量接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(裝液量40 mL /250mL)，初始pH為4. O 6. 0，于30°C，200rpm搖床中培養(yǎng)至66時，4000r/min離心IOmin,制備粗酶液。所述的種子培養(yǎng)基組成羧甲基纖維素1%，蛋白胨0.2%，(NH4)2SO4 O. 3%, MgSO4O. 04%, CaCl2 O. 04%, KH2PO4 0.1%，余量為蒸餾水。各組分以重量百分比計。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成2. 5%的玉米秸桿、玉米芯、麥秸桿或木糖渣和稻草
O.5%，并添加麩皮(I. 5%)、玉米漿(4%)，蛋白胨(O. I %);添加O. 3%硝酸鉀、O. 15%磷酸二氫鉀、O. 04%硫酸鎂；添加O. 01 O. 2mmol/L的硫酸錳，余量為蒸餾水。各組分以重量百分比計。測定FPA、CMC酶活、β -葡萄糖苷酶酶活。酶活測定使用DNS法。以在50°C，pH5. O條件下，Imin催化底物水解產(chǎn)生相當于I μ mol葡萄糖的還原糖定義為一個國際酶活力單位，換算成iu/g固體原料表示。深綠木霉B-8-1-34利用不同的木質(zhì)纖維素原料液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶結(jié)果如表I所示。 表I深綠木霉B-8-1-34液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株深綠木霉 B-8-1-34 {Trichoderma atroviride B-8-1-34)菌株,其特征在于，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.6390。
2.利用如權(quán)利要求I所述的保藏號為CGMCCNo. 6390的深綠木霉B-8-1-34菌株在制備纖維素酶方面的應(yīng)用，其特征在于，通過液態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)⑴將菌種保藏號為CGMCC No. 6390的深綠木霉B-8-1-34活化后，制成濃度為IO6 IOVmL的孢子懸液，按I 10%的接種量接入種子培養(yǎng)基中，26 32°C，150 220 rpm振蕩培養(yǎng)，得種子液，然后將種子液以2 15%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，初始pH4. O 6.O,裝液量為30 60mL/250mL，于26 32°C，150 220rpm搖床中培養(yǎng)60 96h ；⑵將步驟⑴獲得的發(fā)酵液離心分離，取上清液作為粗酶液；所述的種子培養(yǎng)基組成羧甲基纖維素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%，CaCl2 O. 04%, KH2PO4 O. 1%，余量為蒸餾水，各組分以重量百分比計；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成1 5%的玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣的單一成份或混合物，并添加麩皮O. 05 3%、玉米漿O. 05 5%，蛋白胨O.05 I. O %或酵母粉O. 05 I. 0%的單一成份或一種以上成份；添加O. 01 O. 5%硝酸鉀、O. 02 O. 3%磷酸二氫鉀、O. 01 O. 08%硫酸鎂和O O. 05%氯化鈣；添加O. 01 O.2mmol/L的硫酸猛、硫酸亞鐵或氯化鈷,余量為蒸懼水,各組分以重量百分比計。
3.利用如權(quán)利要求I所述的保藏號為CGMCCNo. 6390的深綠木霉B-8-1-34菌株在制備纖維素酶方面的應(yīng)用，其特征在于，通過固態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)(1)將菌種保藏號為CGMCCNo. 6390的深綠木霉B-8-1-34活化后，制成濃度為IO6 108/ml的孢子懸液，將孢子懸液直接接種到固體培養(yǎng)基上或接種至種子培養(yǎng)基，于26 32°C，150 220rpm搖床中培養(yǎng)18 26h，得種子液；然后將種子液以2 15%接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)；裝瓶量為6 12 g/250mL,料液比為I :1 2，于26_32°C培養(yǎng)，定期翻料；(2)發(fā)酵60 120h，加入緩沖液浸提O.5 4h，浸提緩沖液為O. 05 mo I/L ρΗ5· O的醋酸-醋酸鈉緩沖液或O. 05 mo I/L pH5. O檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，其加入量為固體物料重量的8 12倍，固液分離制備粗酶液；所述的種子培養(yǎng)基組成羧甲基纖維素1%，蛋白胨0.2%，(NH4) 2S04 O. 3%，MgSO4O. 04%，CaCl2 O. 04%, KH2PO4 O. 1%，余量為蒸餾水，各組分以重量百分比計；所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣的單一成份或混合物，原料粉碎后過40 60目篩，添加量為40 60% ;添加麩皮2 40%、玉米漿5 40%、豆餅粉O. 5 5%、硫酸銨O. 3 3%、硝酸鉀O. 01 I. 0%、硝酸銨O.01 I. 0%、蛋白胨O. 01 I. 0%或尿素O. 01 I. 0%的一種或兩種以上混合物；添加磷酸二氫鉀O. 2 2%，氯化鈣O. 02 O. 2%，七水硫酸鎂O. 01 O. 1%，各組分以重量百分比計。
4.利用如權(quán)利要求I所述的保藏號為CGMCCNo. 6390的深綠木霉B-8-1-34所產(chǎn)纖維素酶在水解木質(zhì)纖維素方面的應(yīng)用，其特征在于，在O. 05mol/L pH 5. O的醋酸-醋酸鈉或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，將保藏號為CGMCC No. 6390的深綠木霉B-8-1-34所產(chǎn)纖維素酶的粗酶液或酶粉加入到木質(zhì)纖維素中，45 55°C水解24 120h，料液比為O. 5 2:10，酶添加量為I 6FPA/mL。
5.如權(quán)利要求4所述的利用深綠木霉B-8-1-34所產(chǎn)纖維素酶在水解木質(zhì)纖維素方面的應(yīng)用，其特征在于，所述木質(zhì)纖維素為玉米秸桿、玉米芯、稻草、稻殼、麥秸桿、高粱桿、木糖渣、甘蔗渣的一種或一種以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)纖維素酶的菌株深綠木霉B-8-1-34(TrichodermaatrovirideB-8-1-34)及其在制備纖維素酶方面的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一株深綠木霉B-8-1-34，已于2012年8月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6390。本發(fā)明公開的深綠木霉B-8-1-34能夠利用含有木質(zhì)纖維素的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物，配合麩皮、玉米漿、豆餅粉等廉價原料，通過液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，其優(yōu)勢在于發(fā)酵周期短，所產(chǎn)纖維素酶活力高，組分合理，水解木質(zhì)纖維素能力強。本發(fā)明為解決纖維素資源利用中酶活力不高、酶組分不合理導(dǎo)致的生產(chǎn)成本高，糖化效率低等問題提供了新的菌種資源。
文檔編號C12N1/14GK102925365SQ201210408018
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者戴桂馥, 吳健, 劉允攀, 師會勤, 高明夫, 房曉敏, 潘靜 申請人:鄭州大學(xué)