專利名稱：疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
普瑞巴林(Pregabalin，簡(jiǎn)稱PGB)，化學(xué)名為(S)-(+)_3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，是 Y -氨基丁酸的 3 位異丁基取代物(Angew. Chem.1nt. Ed. 2008，47:3500-3504)。普瑞巴林屬鈣離子通道調(diào)節(jié)劑，通過調(diào)節(jié)鈣通道減少鈣離子進(jìn)入神經(jīng)末梢，減少谷氨酸和去甲腎上腺素等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的過度釋放(Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6:108-113.),對(duì)癲癇、神經(jīng)病理性疼痛有良好的療效。與傳統(tǒng)藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數(shù)少、副作用小、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、耐受性強(qiáng)。自上市以來(lái)，普瑞巴林全球銷售額快速增長(zhǎng)，成為全球暢銷藥市場(chǎng)的“重磅炸彈”，市場(chǎng)前景十分廣闊。(3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(II)是制備普瑞巴林的關(guān)鍵手性中間體，經(jīng)加熱脫羧、堿性水解和加氫還原即可合成普瑞巴林(I )。美國(guó)Pfizer公司利用Novozymes公司固定化脂肪酶Upolase 選擇性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成
(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸鹽，底物濃度可達(dá)3. 0M,轉(zhuǎn)化率42 48%( Org. ProcessRes.Dev.2008， 12:392-398 ；US2005/0283023)o
權(quán)利要求
1.一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如下的肽段經(jīng)點(diǎn)突變獲得RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的點(diǎn)突變?yōu)橄铝兄换蚱渲袃煞N以上(I)第88位的S突變?yōu)門 ; (2)第99位的A突變?yōu)镹 ; (3)第116位的V突變?yōu)镈。
2.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD。
4.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD 。
5.編碼如權(quán)利要求1所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體的基因。
6.如權(quán)利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧こ基-3_氰基-5-甲基己酸こ酯制備普瑞巴林關(guān)鍵手性中間體(3S)-2-羧こ基-3-氰基-5-甲基己酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼序列及其應(yīng)用。所述一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如SEQ ID No.1的肽段經(jīng)點(diǎn)突變獲得，所述的點(diǎn)突變?yōu)橄铝兄换蚱渲袃煞N以上(1)第88位的S突變?yōu)門；(2)第99位的A突變?yōu)镹；(3)第116位的V突變?yōu)镈。本發(fā)明提供的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體較親本活力大幅提高，即使使用該酶的粗提物或者工程菌全細(xì)胞，反應(yīng)也會(huì)以較高的速率進(jìn)行；此外，本發(fā)明的突變體可以在常溫和相對(duì)較高的溫度例如40~60℃下用于工業(yè)化生產(chǎn)(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，從而進(jìn)一步合成普瑞巴林。
文檔編號(hào)C12N9/20GK103045559SQ20121040783
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 黎小軍, 鄭仁朝, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)