專利名稱：堿性蛋白酶高產菌株及其所產的堿性蛋白酶的制作方法
堿性蛋白酶高產菌株及其所產的堿性蛋白酶技術領域
本發(fā)明屬于生物工程，涉及菌種誘變，尤其涉及一種堿性蛋白酶高產菌株及其所產的堿性蛋白酶。
背景技術：
堿性蛋白酶(Alkaline Protease)屬內肽酶中的絲氨酸蛋白水解酶類，可以在堿性條件下水解蛋白質肽鍵，其最適作用PH—般為9 11，主要應用于加酶洗滌劑工業(yè)，在制革、絲綢、飼料、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等工業(yè)也有廣泛的應用。
該酶種最早在豬的胰臟中發(fā)現(xiàn)。1913年，Rohm首先將胰蛋白酶作為洗滌浸泡劑使用。1945年,瑞士的Dr. Jaag等發(fā)現(xiàn)了微生物堿性蛋白酶,使蛋白酶有可能廣泛應用于洗滌劑工業(yè)。1963年，諾和諾德公司(現(xiàn)諾維信公司)發(fā)現(xiàn)了更適用于洗滌劑的堿性蛋白酶 Alcalase，酶制劑被廣泛地應用于洗滌劑產品中，出現(xiàn)了加酶洗衣粉，隨后的20年中，細菌類蛋白酶是唯一被應用于洗滌劑的商品化酶制劑。目前，在世界范圍內蛋白分解酶是工業(yè)酶中用得最多的一種酶，約占酶總量的60%，其中堿性蛋白酶就占25%。它在商業(yè)中的巨大應用前景及在基礎研究中的重要作用，吸引著國際國內的許多公司及研究單位競相對其進行多方面的研究。
近年來，離子束作為一種新的誘變源在誘變育種方面因其獨特的誘變機理和生物學效應而發(fā)展極為迅速，與傳統(tǒng)誘變源相比，離子注入除了具有能量沉積效應外，還具有動量傳遞、質量沉積及電荷中和與交換等效應，它將物理誘變與化學誘變特性于一身，能夠在低劑量注入的情況下，顯著提高生物的變異率，獲得損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩(wěn)定的誘變效果。離子注入技術被廣泛應用于微生物優(yōu)良菌株的選育和改良研究中，已選育出一些在工業(yè)上具有較大應用前景的生物新品種，并取得了顯著的經濟效益和社會效益。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種采用低能N+離子注入技術誘變選育得到的堿性蛋白酶高產菌株及其所產的堿性蛋白酶，本方法有效提高嗜堿芽孢桿菌產堿性蛋白酶的能力。
本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下
一種堿性蛋白酶高產菌株，名稱為H-7，分類命名為嗜堿芽孢桿菌 (Bacillusalcalophilus)，保藏編號為=CGMCC No. 6537，保藏日期:2012 年 9 月 7 日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
一種堿性蛋白酶，由權利要求I所述的堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵得到。
而且,所述堿性蛋白酶的最適作用pH為10. 5,最適作用溫度為40°C。
而且，所述堿性蛋白酶在pH7 12的范圍內穩(wěn)定，在4(T50°C熱穩(wěn)定性好。
堿性蛋白酶作為洗滌劑添加劑的應用。
堿性蛋白酶在皮革行業(yè)的應用。
堿性蛋白酶在食品行業(yè)的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是
1、本發(fā)明中誘變獲得的產堿性蛋白酶菌株是由嗜堿芽孢桿菌經過低能N+離子注入誘變而得的堿性蛋白酶高產菌株，有效地提高了菌株的產酶能力，其堿性蛋白酶的活力最大值到33560U/mL，較出發(fā)菌株提高了 44. 7%，7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到36700U/mL ；30L 規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到39600U/mL ;200L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到40700U/mL，可降低生產成本，獲得良好的經濟效益。
2、本發(fā)明中，由篩選的菌株發(fā)酵獲得的堿性蛋白酶的最適作用pH為10. 5，最適作用溫度為40°C，大大提高了酶的最適pH，增加了酶的使用范圍。
3、本發(fā)明的堿性蛋白酶在pH7 12、40 °C保溫lh，殘余酶活為86%以上；在 40^500C、ρΗΙΟ. 5保溫lh，殘余酶活在74%以上，具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明N+離子注入對菌株存活率的影響曲線；
圖2為本發(fā)明N+離子注入對菌株突變及正突變率的影響；
圖3為本發(fā)明經低能N+離子注入技術得到的堿性蛋白酶高產菌株H-7的搖瓶發(fā)酵產酶曲線
圖4為本發(fā)明堿性蛋白酶高產菌株H-7的7L發(fā)酵罐發(fā)酵產酶曲線；
圖5為本發(fā)明堿性蛋白酶高產菌株H-7的30L發(fā)酵罐發(fā)酵產酶曲線；
圖6為本發(fā)明堿性蛋白酶高產菌株H-7的200L發(fā)酵罐發(fā)酵產酶曲線；
圖7為本發(fā)明堿性蛋白酶電泳圖；(A. Marker，B.純化后堿性蛋白酶蛋白，C.發(fā)酵液)；
圖8為本發(fā)明堿性蛋白酶在口冊、6、7、8、9、10、11、12、13下的相對酶活；
圖9為本發(fā)明堿性蛋白酶在pH5、6、7、8、9、10、ll、12、13下40°C保溫Ih后的殘余酶活；
圖10為本發(fā)明堿性蛋白酶在30、40、50、60、70、80、90°C下的相對酶活；
圖11為本發(fā)明堿性蛋白酶在ρΗΙΟ. 5下、40、50、60°C分別保溫2h，每隔20min取樣，測定其殘余酶活。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
I、出發(fā)菌株的篩分
從斜面(由本實驗室篩選獲得)上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿芽孢桿菌接入種子培養(yǎng)液中，于34°C、200r/min培養(yǎng)12h，然后涂布到固體培養(yǎng)基中，在34°C的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，從中挑取20個單菌落轉接入斜面，再將這20個斜面菌株接到種子培養(yǎng)基中，每瓶 (50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)接種一個單菌落，200r/min，34°C培養(yǎng)12h，觀察菌液變渾濁、無異味后按2% (v/v)接種量轉接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。34°C，200r/min，擋板三角瓶 (50mL發(fā)酵培養(yǎng)基/250mL擋板三角瓶)中振蕩培養(yǎng)54h，將發(fā)酵液離心后，以福林酚法測定4粗酶液活力，結果如表I所示。
測定堿性蛋白酶活力后，選擇酶活較高且較穩(wěn)定的菌株作為出發(fā)菌株。原始出發(fā)菌株經過復壯后，菌種發(fā)酵液的酶活平均值為19000U/mL 23000U/mL。YH-16最高，為 23200U/mL。
將上述試驗中酶活較高的菌株YH-16進行傳代試驗，連續(xù)傳代20次考察菌株遺傳性狀的穩(wěn)定性。其結果為(見表2):此菌株高產且穩(wěn)定性好，適合作為離子注入誘變的出發(fā)菌株。
2、N+離子注入誘變
⑴樣品的前處理將嗜堿芽孢桿菌出發(fā)菌株于產芽孢培養(yǎng)基中培養(yǎng)至產芽孢期， 取O. ImL芽孢懸液均勻地涂布于無菌平板上，用無菌風吹干后，然后將平板放入低能加速器靶室，靶室抽真空，用能量為30keV的不同劑量的、N+離子束進行注入。
⑵離子注入條件注入能量為30keV，靶室真空度為5_6 X 10_3Kpa，以6s脈沖式注入，間隔為60s，單次注入劑量為I X 1014N+ions/cm2 ;注入劑量分別為5、10、15、20、30、50、 70、100、200。每個注入劑量做一個真空對照。
每個處理及其相應的真空對照在離子注入前預抽真空5min，以消除因真空干燥程度不同可能帶來的影響；
⑶樣品的后處理將經過N+離子注入的培養(yǎng)皿和真空對照的培養(yǎng)皿分別用無菌水洗脫，適當稀釋后涂布于活化平板上，置34°C下培養(yǎng)48h后計數(shù)，用于單菌落的計數(shù)和存活率的挑選。
存活率為經N+離子注入處理的存活菌落數(shù)與經真空對照處理的存活菌落數(shù)的比值。
⑷存活率曲線的繪制吸取離子注入后的孢子懸液lmL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成ICT1稀釋液；反復吹吸ICT1的稀釋液，使其混合均勻后吸取lmL，注入裝有9mL無菌水的試管中，制成10_2稀釋液；按上述程序操作，制備10_3稀釋液；選擇適宜濃度的稀釋液，分別取O. ImL涂布于平皿中，每個稀釋度做3個平行；于341恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后， 取出計數(shù)。
以注入劑量為橫坐標，存活率為縱坐標，繪制存活率與注入劑量的關系曲線。
存活率(%) =N+注入處理菌落數(shù)/真空對照菌落數(shù)X 100%。其結果為(見圖I) 在N+離子注入劑量達到30X 1014N+ionS/Cm2前，菌株存活率隨N+離子注入劑量的增加而迅速降低；注入劑量超過200X 1014N+ionS/Cm2后，存活率基本為零。當N+離子注入劑量在 30 XlO14^O X 1014N+ions/cm2范圍內時，菌種的存活率呈現(xiàn)高-低-高的“馬鞍型”變化趨勢，這種特有的變化被認為是能量、動量作用下?lián)p傷效應和質量、電荷作用下的保護和刺激綜合作用的結果。
(5) N+離子注入對菌株突變率的影響
采用初篩法檢測每個注入劑量下的菌落透明圈直徑與菌落直徑之比變化情況，規(guī)定透明圈直徑大于對照株5%的突變株稱為正突變，小于5%的為負突變，±5%之間為未突變。試驗結果見圖2。
由圖2可知，隨著離子注入劑量的增加，菌株突變率隨之增加；注入劑量在 30 X IO14 50 X 1014N+ions/cm2范圍內菌株的正突變率較高(22% 26%)，注入劑量超過50X1014N+ions/cm2以后，菌株的突變率繼續(xù)增加，但其正突變率呈降低的趨勢。分析原因， 可能是由于低劑量注入后的菌株容易發(fā)生回復突變，而高劑量使DNA及生物膜等生物大分子的損傷嚴重造成較高的突變率和較低的正變率。在“馬鞍”區(qū)域內，注射劑量適宜，突變率相對較高，正突變率也較高。
3、高產菌株的初次篩選
將菌液在最佳注入劑量下進行N+離子注入誘變處理，適當稀釋后涂布于初篩平板上。
初篩選用雙層平板，下層為發(fā)酵固體培養(yǎng)基，上層為牛奶培養(yǎng)基，將隨機挑選的 100株菌依次編號H-1H-100, 對應點接于平板下層培養(yǎng)基；每板點接5株誘變菌，每株菌作一支平行，并點接原始菌做對照，34°C培養(yǎng)54h后，將定量的牛奶培養(yǎng)基均勻傾注于平板上，10°C放置12h，計算透明圈直徑與菌落直徑之比，每板挑選2個比值大于原始菌的突變株。按此方法篩選3輪，初步選定H-2、H-7、H-32、H_65、H_77、H-89六株突變株進行復篩。
4、高產菌株的再次篩選
將初篩篩得的6株菌分別進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，以54h酶活力作為復篩標準，重復三次。各個突變株酶活如表3所示，其中突變株H-7產酶活力最高，達33560U/mL，比初始菌株提聞了 44. 7%。
5、堿性蛋白酶高產菌株的確定
對以上誘變試驗中篩選得到的高產突變株進行連續(xù)傳代試驗，測其酶活力，考察其遺傳性狀的穩(wěn)定性，篩選到可以最終應用于生產上的菌株。
對突變株H-7連續(xù)傳代5次，以54h發(fā)酵粗酶液活力為標準，結果如表4所示，傳代五次后，產酶能力保持穩(wěn)定，這與報道的離子注入誘變后，菌株的優(yōu)良性狀可穩(wěn)定遺傳相一致，突變株H-7即為高產堿性蛋白酶菌株。
6、堿性蛋白酶高產菌株搖瓶水平發(fā)酵產蛋白酶
從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿芽孢桿菌H-7接入種子培養(yǎng)液中(50mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶)，200r/min, 34°C培養(yǎng)12h，2%( v/v)接種量轉接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基。34°C， 200r/min，擋板三角瓶(50mL發(fā)酵培養(yǎng)基/250mL擋板三角瓶)中振蕩培養(yǎng)，每間隔一定時間后，將發(fā)酵液離心，以福林酚法測定粗酶液活力，結果附圖3所示。
7、堿性蛋白酶高產菌株7L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝
從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿芽孢桿菌H-7接入種子培養(yǎng)液中(50mL種子培養(yǎng)基/2501^擋板三角瓶)，2001'/1^11，341培養(yǎng)12h，按照5% (v/v)的接種量轉接入7L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量O. 65。溫度34°C，轉速200 500r/min，通風量1 O. 5 I : 2. 5，溶氧維持在20 30%。發(fā)酵過程中流加氨水及20% (v/v)的鹽酸,使發(fā)酵液pH值維持在 7. O。采用該工藝連續(xù)發(fā)酵三批，如附圖4所示，發(fā)現(xiàn)在該流加工藝控制工藝下，菌株從20h 開始產酶，25h進入產酶高峰期，55h達到最大值，酶活力平均在36700U/mL穩(wěn)定，此后，酶活力開始迅速下降。
8、堿性蛋白酶高產菌株30L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝
從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿芽孢桿菌H-7接入種子培養(yǎng)液中(IOOmL種子培養(yǎng)基/500mL擋板三角瓶)，200r/min, 34°C培養(yǎng)12h，按照5% (v/v)的接種量轉接入30L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量O. 7。溫度34°C;轉速100 600r/min;通風量1 O. 5 I : 2.5; 溶氧維持在20 30%。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20% (v/v)的鹽酸,使發(fā)酵液pH值維持在7. O。采用該工藝連續(xù)發(fā)酵三批，如附圖5所示，發(fā)現(xiàn)在該流加工藝控制工藝下，30h以后，堿性蛋白酶大量合成，到達55h時，酶活力最高39600U/mL。54h以后，產酶速度變慢，活力下降，很快菌體進入消亡期，同時PH值迅速上升。
9、堿性蛋白酶高產菌株200L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝
從斜面上挑取一環(huán)新培養(yǎng)的嗜堿芽孢桿菌H-7接入種子培養(yǎng)液中(IOOmL種子培養(yǎng)基/500mL擋板三角瓶)，34°C振蕩培養(yǎng)12h，按2% (v/v)的接種量于30L種子培養(yǎng)基， 34°C，溶氧維持在20 30%，10h。按照5% (v/v)的接種量轉接入200L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝液量O. 7。溫度34°C ;轉速250 450r/min ;通風量1 O. 5 I : L 5 ;溶氧20 30%。發(fā)酵過程中自動流加氨水及20% (v/v)的鹽酸，使發(fā)酵液pH值維持在7. O。如附圖 6所示，發(fā)現(xiàn)在該流加工藝控制工藝下發(fā)酵36h時，酶活力達到最大值40700U/mL。200L發(fā)酵罐中細胞生長延滯期縮短，生長迅速，產酶期也相應提前，整個產酶期均以較高的速率產酶。
培養(yǎng)基
(I)保藏/活化培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏8，酵母浸粉2，多聚蛋白胨5，NaC12，瓊脂17， 酪蛋白4，K2HPO418，pH自然。
(2)種子培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉5，胰蛋白胨5，葡萄糖10，K2HP0418，pH自然。
(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉17，棉籽餅粉30，麥芽糊精100，檸檬酸鈉3，氯化鈣 2. 6，K2HP0418，pH 自然。
(4)牛奶培養(yǎng)基(g/L):脫脂奶粉100，瓊脂20，pH自然。
(5)產芽孢培養(yǎng)基(g/L):酵母膏 O. 7，蛋白胨 I，葡萄糖 1，(NH4)2SO4O. 2，MgSO4. 7H20 O. 2，K2HPO4I, ρΗ7· 2，固體培養(yǎng)基加 I. 8% (w/v)的瓊脂。
10、堿性蛋白酶活力的測定
采用《中華人民共和國輕工業(yè)標準》QB/T1805. 3-93工業(yè)酶制劑通用實驗方法，即福林(Folin)法。
11、酶的純化工藝取發(fā)酵液100ml，8000r/min離心lOmin。取上清液，以飽和度 70%的固體硫酸按進行鹽析，8000r/mln離心IOmin收集沉淀。將沉淀溶于Tris-HCI (pH8. 8) 緩沖液中，在相同的緩沖液中進行透析除鹽。離心除去少量不溶物，取上清液過 DEAE-S印haroseCL-6B 離子交換柱進行純化，以 20mMTris_Hcl (pH8. 8，含 IOmMNacl)緩沖液進行洗脫。堿性蛋白酶未被吸附，先被洗脫下來，得到無色透明的液體。收集酶液進行真空冷凍干燥，得到純酶粉進行進一步分析。
如圖7所示，SDS-PAGE蛋白電泳表明純化后的樣品己達到電泳純，分子量為 28kDa?；厥章蕿?7. 54%，純化倍數(shù)為5. 23倍，比活力可達18620. 20U/mg。
12、對酶的性質進行研究。
以酪蛋白為底物時，分別測定堿性蛋白酶在pH5、6、7、8、9、10、ll、12、13下的相對酶活(附圖8);在pH5、6、7、8、9、10、ll、12、13下40°C保溫Ih后的殘余酶活(附圖9);在30、 40、50、60、70、80、90°C下的相對酶活(附圖10);在ρΗΙΟ. 5下40、50、60°C分別保溫2h后的殘余酶活(附圖11)。CN 102925388 A書明說6/7頁
可以得到其最適作用pH為10. 5，最適作用溫度為40°C。該酶在pH7 12的范圍內穩(wěn)定，在4(T5(TC左右有較好的熱穩(wěn)定性。
表I原始菌株的酶活
表 2
_株酶活(U/mL)菌株酶活(U/mL)YH-I19180YH-Il21000VH-222020VH-1219800YH-320160YH-1322200YH-419810YH-1421610YH-521950YH-1519930YH-(’21650YH-1623200VH-720060YH-1720420YU-H21750YH-IH21040YH-921950YH-! 921060YH-1020870YH-2019910出發(fā)菌株傳代試驗結果代次堿性蛋白酶活力(U/mL)Fl23200F523980FiO23540FI523460F2023290
表3堿性蛋白酶高產菌株的復篩結果
菌株酶活力(U/mL)相對酶活(%)初始菌23200100H-223900士497103.0 士 2·1H-733560±50!144.7±2.2H-322%00工513127 6 士2·225000士6I2107.8 士 2.6H-7728300士673122.0±2.98
權利要求
1.一種堿性蛋白酶高產菌株，其特征在于名稱為H-7，分類命名為嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)，保藏編號為=CGMCC No. 6537，保藏日期:2012 年 9 月 7 日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
2.一種堿性蛋白酶，其特征在于由權利要求I所述的堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵得到。
3.根據(jù)權利要求2所述的堿性蛋白酶，其特征在于所述堿性蛋白酶的最適作用pH為10.5，最適作用溫度為40°C。
4.根據(jù)權利要求2所述的堿性蛋白酶，其特征在于所述堿性蛋白酶在pH7 12的范圍內穩(wěn)定，在4(T50°C熱穩(wěn)定性好。
5.權利要求所述2的堿性蛋白酶作為洗滌劑添加劑的應用。
6.權利要求所述2的堿性蛋白酶在皮革行業(yè)的應用。
7.權利要求所述2的堿性蛋白酶在食品行業(yè)的應用。
全文摘要
本發(fā)明一種堿性蛋白酶高產菌株及其所產的堿性蛋白酶，一種堿性蛋白酶高產菌株，其特征在于名稱為H-7，分類命名為嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)，保藏編號為CGMCC No.6537，由堿性蛋白酶高產菌株發(fā)酵得到。本發(fā)明中誘變獲得的產堿性蛋白酶菌株是由嗜堿芽孢桿菌經過低能N+離子注入誘變而得的堿性蛋白酶高產菌株，有效地提高了菌株的產酶能力，其堿性蛋白酶的搖瓶活力最大值到33560U/mL，較出發(fā)菌株提高了44.7%，7L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到36700U/mL；30L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到39600U/mL；200L規(guī)模發(fā)酵罐酶活力達到40700U/mL。
文檔編號A23L1/03GK102925388SQ20121041702
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月26日 優(yōu)先權日2012年10月26日
發(fā)明者路福平, 劉逸寒, 劉敏堯, 劉靚, 樊帥, 王春霞, 王建玲 申請人:天津科技大學