專利名稱：一種純化海藻酮糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，屬于海藻酮糖漿的分離純化，具體是一種純化海藻酮糖的方法。
背景技術(shù)：
海藻酮糖(Trehalulose)和異麥芽酮糖(Isomaltulose)都是鹿糖(sucrose)的同分異構(gòu)體，蔗糖是以α，α-1，2_糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖，海藻酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，1-糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖，異麥芽酮糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖以α，α-1，6_糖苷鍵結(jié)合而成的一種二糖。大多數(shù)細(xì)菌和酵母不能發(fā)酵利用海藻酮糖和異麥芽酮糖，因此在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域海藻酮糖和異麥芽酮糖都是良好的蔗糖替代品。雖然海藻酮糖和異麥芽酮糖都是蔗糖的同分異構(gòu)體，但是它們的化學(xué)性質(zhì)和物理性質(zhì)有很大不同，異麥芽酮糖甜度為蔗糖的42%，幾乎不吸水，一般認(rèn)為沒有吸水性，SP 使添加I. 5% 15%的檸檬酸，其吸濕性也不會(huì)增加，因此這種不吸水和不發(fā)粘的特性非常適合用于生產(chǎn)需要干燥保存的食品和藥劑。與異麥芽酮糖不同的是海藻酮糖則具有很高的溶解度和吸水性，甜度是蔗糖的70%，在室溫的條件下其溶解度達(dá)到90%以上，其溶液幾乎不能被結(jié)晶，在溶液中只要添加少量的海藻酮糖就可以有效的減少結(jié)晶析出。自然界中的海藻酮糖在蜂蜜中含量最高，所以純的蜂蜜不容易結(jié)晶。這種高吸水性和不易結(jié)晶的特性非常適合用于生產(chǎn)高級液體飲料、液體狀藥物制劑以及化妝品等。但是自然界中的海藻酮糖的含量很低，即使在含量最高的蜂蜜含量也在5%以下，而且由于海藻酮糖的高吸水性和不易結(jié)晶的特性，也很難和其它糖分離，造成生產(chǎn)上分離純化十分困難，所以需要找到更簡單的海藻酮糖制備方法。目前文獻(xiàn)報(bào)道的可以利用海藻糖合成酶、異麥芽酮糖合成酶和蔗糖異構(gòu)酶三種類型的酶來轉(zhuǎn)化蔗糖獲得海藻糖酮糖。異麥芽酮糖合成酶可以轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻糖酮糖，但其主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是異麥芽酮糖，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的糖漿60-90%為異麥芽酮糖，而海藻糖酮糖僅為10-40%,因此生產(chǎn)成本上是不合算的，而且異麥芽酮糖和海藻糖酮糖同分異構(gòu)體，同樣不容易被微生物同化，給以后的分離純化帶來很大的困難。蔗糖異構(gòu)酶能夠轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻糖酮糖，并且沒有異麥芽酮糖生成，但其酶活力較低，而且轉(zhuǎn)化率也很低，目前還沒有關(guān)于利用蔗糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化蔗糖生產(chǎn)海藻糖酮糖的報(bào)道。海藻糖合成酶能夠轉(zhuǎn)化蔗糖生成海藻糖酮糖，與異麥芽酮糖合成酶不同的，海藻糖合成酶能夠轉(zhuǎn)化蔗糖主要產(chǎn)物為海藻酮，糖漿中海藻酮含量可以達(dá)到為60-80%，而且不會(huì)生成異麥芽酮糖。無論是采用哪一種酶來轉(zhuǎn)化蔗糖來生產(chǎn)海藻酮糖，反應(yīng)結(jié)束后的反應(yīng)液糖組分除了海藻酮糖外還有一部分沒有反應(yīng)的底物蔗糖以及反應(yīng)過程生成的副產(chǎn)物葡萄糖和果糖。海藻糖合成酶只能在反應(yīng)液中生成60-80%的海藻酮糖，反應(yīng)液中的其它組分是蔗糖和葡萄糖，必需要通過一定的純化方法來去除反應(yīng)液中的蔗糖和葡萄糖才能進(jìn)行進(jìn)一步的精制純化獲得高純度的海藻糖酮糖。蔗糖和海藻酮糖是同分異構(gòu)體，且海藻酮糖很難結(jié)晶，不能利用結(jié)晶的方法來分離純化，所以海藻酮糖的分離非常困。
目前國內(nèi)沒有關(guān)于海藻酮糖分離純化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，海藻酮糖與其它糖組分分離方法可以通過凝膠樹脂或離子交換樹脂來使海藻酮糖與其它糖組分分離開來，但是凝膠樹脂或離子交換樹脂分離方法在大規(guī)模使用時(shí)大型色譜柱設(shè)備占用面積大，價(jià)格昂貴，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而且需要用到強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的對樹脂材料進(jìn)行處理和再生，這不僅會(huì)增加對生產(chǎn)環(huán)境壓力，也會(huì)增加海藻酮糖的生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種純化海藻酮糖的方法，能夠利用釀酒酵母細(xì)胞同化糖差異和離心技術(shù)去除海藻酮糖反應(yīng)液中蔗糖和葡萄糖制備單一海藻酮糖組分。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達(dá)到上述目的一種純化海藻酮糖的方法，包括如下步驟
I、培養(yǎng)釀酒酵母細(xì)胞將釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)接種到以下培養(yǎng)基(克/升):葡萄糖20克，蛋白胨20克，酵母提取物10克，然后在25 30°C恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)至0D600為O. 8后，5000rpm離心3分鐘收集酵母細(xì)胞用于下面的同化反應(yīng)步驟。2、利用海藻糖合成酶將蔗糖溶液中蔗糖轉(zhuǎn)化成海藻糖酮糖在20%的蔗糖溶液中加入海藻糖合成酶，在25°C保溫反應(yīng)24個(gè)小時(shí)，每隔2個(gè)小時(shí)檢測一次還原糖的增加量，直到檢測還原糖不再增加，表明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，再進(jìn)行下一步的處理。3、利用釀酒酵母細(xì)胞同化海藻糖酮糖反應(yīng)液將步驟I制備好的酵母細(xì)胞加到步驟2反應(yīng)結(jié)束的海藻糖酮糖反應(yīng)液中，25°C保溫反應(yīng)5個(gè)小時(shí)，每隔I個(gè)小時(shí)用HPLC分析反應(yīng)液中的糖組分，當(dāng)反應(yīng)液只剩下海藻糖酮糖時(shí)，立即進(jìn)行下一步驟處理。4、通過離心去除釀酒酵母細(xì)胞將步驟1. 3的反應(yīng)液5000rpm/分離心3分鐘，除去酵母細(xì)胞沉淀，收集上清液即得到單一糖組分的海藻糖酮糖溶液。方法過程原理由于釀酒酵母很難發(fā)酵利用海藻酮糖，反應(yīng)液中的海藻酮糖不會(huì)被釀酒酵母同化，當(dāng)反應(yīng)液的蔗糖、葡萄糖和果糖被釀酒酵母同化完后，再通過離心去除溶液中的釀酒酵母細(xì)胞就可以得到單一糖組分的海藻酮糖溶液。蔗糖和葡萄糖可以同時(shí)被釀酒酵母細(xì)胞同化，反應(yīng)條件簡單且容易控制，在工業(yè)大規(guī)模使用離心可以采用管式離心機(jī)或者是碟片式離心力來進(jìn)行連續(xù)離心。海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化蔗糖的反應(yīng)液主要成分是海藻酮糖和少量沒有反應(yīng)的蔗糖和反應(yīng)副產(chǎn)物葡萄糖及果糖，釀酒酵母細(xì)胞能同化蔗糖、果糖和葡萄糖，但是很難同化海藻酮糖，而釀酒酵母細(xì)胞可以通過離心的方法來去除。本發(fā)明具有的突出優(yōu)點(diǎn)如下I.與傳統(tǒng)的凝膠樹脂和離子交換樹脂分離方法相比，本發(fā)明方法的優(yōu)勢是不需要額外增加更多的設(shè)備，可以在原有的生產(chǎn)反應(yīng)容器中進(jìn)行反應(yīng)。2.與傳統(tǒng)的凝膠樹脂和離子交換樹脂分離方法相比，本發(fā)明方法的優(yōu)勢是利用釀酒酵母細(xì)胞處理海藻酮糖反應(yīng)液后就可以去除反應(yīng)液中的蔗糖、葡萄糖和果糖，不在需要凝膠樹脂和離子交換樹脂來去除應(yīng)液中的蔗糖、葡萄糖和果糖，工藝更簡單，分離效率更快，還可以減少設(shè)備的使用率，從而可以降低生產(chǎn)設(shè)備的投資。3.可以減少凝膠樹脂和離子交換樹脂的使用，也可以減少強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的使用，這樣可減少強(qiáng)酸和強(qiáng)堿對設(shè)備和生產(chǎn)車間的腐蝕，減少對生產(chǎn)環(huán)境壓力。4.采用離心機(jī)分離糖漿和酵母細(xì)胞時(shí)，在工業(yè)大規(guī)模使用離心可以采用管式離心機(jī)或者是碟片式離心力來進(jìn)行連續(xù)離心，較樹脂分離方法分離速度快、效率高。以上這些優(yōu)勢有利于提高生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)海藻酮糖的生產(chǎn)成本。


圖I是海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化鹿糖后反應(yīng)液的HPLC分析析2是釀酒酵母同化處理后反應(yīng)液的HPLC分析圖
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，下述實(shí)驗(yàn)和實(shí)例所述內(nèi)容屬于本發(fā)明的主要內(nèi)容，有些對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說屬于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法并未在本專利說明書中出現(xiàn)。一種純化海藻酮糖的方法，包括如下步驟I.培養(yǎng)釀酒酵母細(xì)胞將釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)接種到以下培養(yǎng)基(克/升):葡萄糖20克，蛋白胨20克，酵母提取物10克，然后在25 30°C恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)至0D600為O. 8后，5000rpm離心3分鐘收集酵母細(xì)胞用于下面的同化反應(yīng)步驟。2.利用海藻糖合成酶將蔗糖溶液中蔗糖轉(zhuǎn)化成海藻糖酮糖在20%的蔗糖溶液中加入中國專利號為ZL200410073883. 5報(bào)道的來源的來源于Thermobifida fusca海藻糖合成酶,在25°C, pH7. O的條件下,保溫反應(yīng)24個(gè)小時(shí),每隔2個(gè)小時(shí)檢測一次還原糖的增加量，直到檢測還原糖不再增加，表明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，可以進(jìn)行下一步的處理。利用高效液相色譜儀(HPLC)分析此時(shí)反應(yīng)液中的糖組分，分析條件，色譜柱Alltima Amino 100A 5u柱(4. 6mmX250mm);檢測器Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器；流動(dòng)相70%乙腈/30% H2O ;流速lmL/min，柱溫35°C。海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化蔗糖反應(yīng)液中的糖組分的HPLC分析見圖1，表明反應(yīng)液中主要成分為海藻酮糖，還有部分蔗糖、葡萄糖和果糖。3.利用釀酒酵母細(xì)胞同化海藻糖酮糖反應(yīng)液。將步驟I制備好的酵母細(xì)胞加到步驟2反應(yīng)結(jié)束的海藻糖酮糖反應(yīng)液中，25°C保溫反應(yīng)5個(gè)小時(shí)，每隔I個(gè)小時(shí)用HPLC分析反應(yīng)液中的糖組分，當(dāng)反應(yīng)液只剩下海藻糖酮糖時(shí)，立即進(jìn)行下一步驟處理。4.通過離心去除酵母細(xì)胞將上一步驟的反應(yīng)液5000rpm/分離心3分鐘，去除酵母細(xì)胞沉淀，收集上清液就得到單一糖組分的海藻糖酮糖溶液。上清溶液的HPLC分析結(jié)果見圖2，表明海藻糖酮糖反應(yīng)液經(jīng)過釀酒酵母細(xì)胞同化處理后，在溶液中只有海藻酮糖一個(gè)峰了，蔗糖、葡萄糖和果糖已經(jīng)被成功去除。5.從蔗糖制備海藻酮糖在玻璃容器中用pH7. O的磷酸鹽緩沖液配制I升的20%的蔗糖的溶液，然后加入海藻糖合成酶，在在25°C保溫反應(yīng)24個(gè)小時(shí)，反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)測定利用HPLC測定海藻酮糖的含量，并計(jì)算剩余的蔗糖及產(chǎn)生的葡萄糖含量，然后根據(jù)剩余的蔗糖及產(chǎn)生的葡萄糖和果糖含量按照I克濕重酵母細(xì)胞/5克糖，加入酵母細(xì)胞，25°C保溫反應(yīng)，每隔一個(gè)小時(shí)用HPLC分析反應(yīng)液中的糖組分，當(dāng)反應(yīng)液只剩下海藻糖酮糖一個(gè)峰時(shí)，馬上進(jìn)行下離心處理去除酵母細(xì)胞，再用HPLC分析海藻糖酮糖含量，并計(jì)算海藻酮糖得率，結(jié)果見表I。經(jīng)過酵母細(xì)胞處理，海藻酮糖的回收率為15. 0/15. 8=95%。表I :酵母細(xì)胞處理前后的糖組分對比
酵母細(xì)胞處理前酵母細(xì)胞處理后
海藻酮糖濃度(%) 5Γ8ΙδΓ
蔗糖濃度(％)L6O
葡萄糖濃度(%)L3O
果糖濃度(％L3O
權(quán)利要求
1.一種純化海藻酮糖的方法，其特征在于包括如下步驟I. I培養(yǎng)釀酒酵母細(xì)胞將釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)接種到以下培養(yǎng)基(克/升)葡萄糖20克，蛋白胨20克，酵母提取物10克，然后在25 30°C恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)至0D600為O. 8后，5000rpm離心3分鐘收集酵母細(xì)胞用于下面的同化反應(yīng)步驟，I. 2利用海藻糖合成酶將蔗糖溶液中蔗糖轉(zhuǎn)化成海藻糖酮糖在20%的蔗糖溶液中加入海藻糖合成酶，在25°C保溫反應(yīng)24個(gè)小時(shí)，每隔一個(gè)小時(shí)檢測一次還原糖的增加量，直到檢測還原糖不再增加，表明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡，再進(jìn)行下一步的處理，I. 3利用釀酒酵母細(xì)胞同化海藻糖酮糖反應(yīng)液將步驟I制備好的酵母細(xì)胞加到步驟2反應(yīng)結(jié)束的海藻糖酮糖反應(yīng)液中，25°C保溫反應(yīng)5個(gè)小時(shí)，每隔一個(gè)小時(shí)用HPLC分析反應(yīng)液中的糖組分，當(dāng)反應(yīng)液只剩下海藻糖酮糖時(shí)，立即進(jìn)行下一步驟的處理，I. 4通過離心去除酵母細(xì)胞將步驟I. 3的反應(yīng)液5000rpm/分離心3分鐘，除去酵母細(xì)胞沉淀，收集上清液即得到單一糖組分的海藻糖酮糖溶液。
全文摘要
一種純化海藻酮糖的方法，包括如下步驟利用海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化20％蔗糖溶液生成含80％海藻酮糖的混合糖漿，然后利用釀酒酵母細(xì)胞同化混合糖漿中的沒有反應(yīng)的蔗糖和副產(chǎn)物果糖及葡萄糖，而海藻糖很難被酵母降解或同化，再利用離心去除糖漿中釀酒酵母細(xì)胞，從而得到單一糖組分的海藻酮糖溶液，經(jīng)過這樣純化方法，海藻酮糖的回收率可以達(dá)到95％，這種單一糖組分的海藻酮糖，糖漿進(jìn)一步通過濃縮、脫鹽、精制來生產(chǎn)高純度的海藻酮糖。
文檔編號C12P19/12GK102925515SQ201210418359
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月27日
發(fā)明者韋宇拓, 梁甲元, 杜麗琴, 黃日波 申請人:廣西大學(xué)