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      用于hpv檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片的制作方法

      文檔序號(hào):414617閱讀:439來(lái)源:國(guó)知局
      專(zhuān)利名稱(chēng):用于hpv檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種多重核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),尤其涉及一種陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片。
      背景技術(shù)
      人乳頭瘤病毒HPV是一種屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡病毒A屬,是球形DNA病毒。分高危險(xiǎn)型和低危型,低危型HPV如HPV-6,11,13,32,34,40,42,43,44,53,54等與感染生殖器、肛門(mén)、口咽部、食道黏膜,特別是HPV6,11,發(fā)生率最為廣泛。高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要原因,而其中人乳頭瘤病毒16型、18型是與宮頸癌發(fā)生最密切、致病風(fēng)險(xiǎn)最高的2種高危型人乳頭瘤病毒,至少占宮頸癌的40%以上。及時(shí)快速地區(qū)分不同類(lèi)型的重要HPV對(duì)于疾病的預(yù)防和治療具有至關(guān)重要的作用,無(wú)論對(duì)個(gè)人還是社會(huì)都具有重大的意義。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)最早由日本科學(xué)家發(fā)明,該技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、反應(yīng)速度快、反應(yīng)結(jié)果可以直接肉眼判定等優(yōu)點(diǎn),經(jīng)過(guò)近10年的學(xué)術(shù)研究,現(xiàn)以各種檢測(cè)試劑盒的形式進(jìn)入市場(chǎng)。但是LAMP反應(yīng)的“等溫模式”和其復(fù)雜的核酸探針使其很難在同一體系中實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣品中多種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè),即多重檢測(cè)。微流控技術(shù)是在微米尺度結(jié)構(gòu)中操控納升至皮升體積流體的技術(shù)與科學(xué),在該尺度下大幅度增強(qiáng)的層流效應(yīng)、表面張力效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、熱傳導(dǎo)效應(yīng)及擴(kuò)散效應(yīng),使許多物理和化學(xué)過(guò)程發(fā)生了質(zhì)的變化,是當(dāng)前正在急速發(fā)展的高新技術(shù)和科技前沿領(lǐng)域之一,是未來(lái)生命科學(xué)、化學(xué)與信息科學(xué)發(fā)展的重要技術(shù)平臺(tái),該技術(shù)的應(yīng)用可以實(shí)現(xiàn)LAMP反應(yīng)的多重檢測(cè)模式
      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種用于HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種用于高危HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片,它包括毛細(xì)管通道、連接管道、加樣孔、若干擴(kuò)增池和若干探針注入孔,所述加樣孔與毛細(xì)管通道相通,所有擴(kuò)增池的一端均通過(guò)連接管道與毛細(xì)管通道連通,另一端各與一探針注入孔連通;其中,一個(gè)擴(kuò)增池中置有陽(yáng)性探針,該陽(yáng)性探針具有SEQ ID N0.25- SEQID N0.28所示的DNA序列,另一個(gè)擴(kuò)增池中置有陰性探針,所述陰性探針為水,所述陽(yáng)性探針和陰性探針用以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度;其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對(duì)目標(biāo)核酸片段的特異性探針;所述針對(duì)目標(biāo)核酸片段的特異性探針由針對(duì)HPV-6,11的具有SEQ IDN0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針、針對(duì) HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQ IDN0.18所示的DNA序列的探針和針對(duì)HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針中的一種或多種組成。進(jìn)一步地,所述連接管道呈四棱臺(tái)狀,橫截面大的一端與擴(kuò)增池相連,橫截面小的一端與毛細(xì)管通道相連,使微流體從毛細(xì)管通道平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池,且不產(chǎn)生氣泡。所述擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求,其長(zhǎng)度可以隨需求任意改變,寬度和深度的空間尺寸一般£1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和深度一般£0.3mm都可以。本發(fā)明的有益效果是,本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片可應(yīng)用于快速合并檢測(cè)HPV6型和HPVll型的核酸,分型檢測(cè)HPV16型和HPV18型的核酸。


      圖1是陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片的結(jié)構(gòu)示意 圖中,擴(kuò)增池1、連接管道2、毛細(xì)管通道3、加樣孔4、探針注入孔5。
      具體實(shí)施例方式如圖1所示, 本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片包括毛細(xì)管通道3、加樣孔4、若干擴(kuò)增池I和若干探針注入孔5,加樣孔4與毛細(xì)管通道3相通,所有擴(kuò)增池I的一端均通過(guò)連接管道2與毛細(xì)管通道3連通,另一端各與一探針注入孔5連通。一個(gè)擴(kuò)增池I中置有陽(yáng)性探針,該陽(yáng)性探針具有SEQ ID N0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列,一個(gè)擴(kuò)增池中置有陰性探針,所述陰性探針為水,陽(yáng)性探針和陰性探針用以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。除上述分別置有陽(yáng)性探針和陰性探針的擴(kuò)增池I外,其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對(duì)目標(biāo)核酸片段的特異性探針。如針對(duì)HPV-6,11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12 所示的 DNA 序列的探針,針對(duì) HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13- SEQ ID N0.18所示的DNA序列的探針,針對(duì)HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。擴(kuò)增池I的數(shù)量可以根據(jù)目標(biāo)物檢測(cè)的需求設(shè)計(jì),如三重、四重、五重或十重等,不受限制。毛細(xì)管通道3主要是利用其物理限域(低質(zhì)量傳遞系數(shù))的特性限制每個(gè)擴(kuò)增池中的特異性核酸探針和反應(yīng)產(chǎn)物在不同池中的交叉污染,同時(shí)也利用毛細(xì)管的拉力便于樣品和反應(yīng)液的進(jìn)樣。擴(kuò)增池I和毛細(xì)管通道3之間用連接管道2連通,連接管道2呈四棱臺(tái)狀,橫截面大的一端與擴(kuò)增池I相連,橫截面小的一端與毛細(xì)管通道3相連,使微流體從毛細(xì)管通道3平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池4,且不產(chǎn)生氣泡。擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求,其長(zhǎng)度可以隨需求任意改變,寬度和深度的空間尺寸一般£1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和深度一般£0.3_都可以;連接管道2的空間尺寸根據(jù)擴(kuò)增池I和毛細(xì)管通道3的尺寸來(lái)定,主要起到一種均勻連接效果。本發(fā)明陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片通過(guò)以下步驟制備得到:
      1、芯片模板的制作:利用微加工技術(shù)(MEMS、光刻等)的方法制作芯片模板,模板結(jié)構(gòu)與上述陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片相對(duì)應(yīng),模板材料可以為硅材料。2、芯片澆注,脫氣和固化:將二甲基硅氧烷和固化劑按質(zhì)量比5-12:1混合均勻后,小心傾倒于芯片模板上,真空脫氣30 min后80°C固化2h,所述固化劑是烷氧基硅烷,開(kāi)加樣孔4和探針注入孔5后,通過(guò)等離子處理后,與玻片永久鍵合。3、功能化芯片:將目標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的探針,陽(yáng)性探針和陰性探針?lè)謩e通過(guò)冷凍干燥技術(shù)包被于芯片對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增池I中,完成功能化芯片,該芯片可以在4°C左右長(zhǎng)期保存。實(shí)施例我們利用此陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)平臺(tái),開(kāi)發(fā)了一款五通道的人乳頭瘤HPV病毒6/11,16,18分型的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片。在此五槽道陣列式微流控恒溫?cái)U(kuò)增芯片中,我們?cè)贗,2,3擴(kuò)增池中包被上針對(duì)四種重要HPV目的基因的特異性探針(Probe 6+11,Probe 16和Probe 18),在擴(kuò)增池4中包被陽(yáng)性內(nèi)參核酸探針,擴(kuò)增池5中作為陰性內(nèi)參。我們通入2 μ L樣品,再滴入 30 uL LAMP反應(yīng)液,封閉反應(yīng)孔,在63°C下恒溫反應(yīng)I h (LAMP反應(yīng)液成分見(jiàn)表I)。在包被有目標(biāo)物探針的擴(kuò)增池中出現(xiàn)了LAMP信號(hào)的肉眼可見(jiàn)的綠色。我們分別用HPV樣品對(duì)芯片進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如下:對(duì)于樣品HPV6/11, HPV 16和HPV18,在相應(yīng)探針包被的擴(kuò)增池中出現(xiàn)了綠色擴(kuò)增信號(hào),而陰性內(nèi)參對(duì)照池中沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)的出現(xiàn),結(jié)果符合預(yù)期,且沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增池之間的交叉污染,檢測(cè)結(jié)果可靠。
      表I LAMP反應(yīng)液成分
      權(quán)利要求
      1.一種用于HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片,其特征在于,它包括毛細(xì)管通道(3)、加樣孔(4)、若干擴(kuò)增池(I)和若干探針注入孔(5),所述加樣孔(4)與毛細(xì)管通道(3)相通,所有擴(kuò)增池(I)的一端均通過(guò)連接管道(2)與毛細(xì)管通道(3)連通,另一端各與一探針注入孔(5)連通;其中,一個(gè)擴(kuò)增池(I)中置有陽(yáng)性探針,該陽(yáng)性探針具有SEQ IDN0.25- SEQ ID N0.28所示的DNA序列,另一個(gè)擴(kuò)增池中置有陰性探針,所述陰性探針為水,所述陽(yáng)性探針和陰性探針用以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度;其余擴(kuò)增池I中分別包被上針對(duì)目標(biāo)核酸片段的特異性探針;所述針對(duì)目標(biāo)核酸片段的特異性探針為針對(duì)HPV-6,11的具有SEQ ID N0.1-SEQ ID N0.12所示的DNA序列的探針、針對(duì)HPV-16 的具有 SEQ ID N0.13-SEQID N0.18所示的DNA序列的探針或針對(duì)HPV-18的具有SEQ ID N0.19- SEQ ID N0.24所示的DNA序列的探針。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片,其特征在于,所述連接管道(2)呈四棱臺(tái)狀,橫截面大的一端與擴(kuò)增池(I)相連,橫截面小的一端與毛細(xì)管通道(3)相連,使微流體從毛細(xì)管通道(3)平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池(I ),且不產(chǎn)生氣泡。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片,其特征在于,所述擴(kuò)增池空間尺寸根據(jù)其體積需求,其長(zhǎng)度可以隨需求任意改變,寬度和深度的空間尺寸一般£1_ ;毛細(xì)管通道的寬度和 深度一般£0.3_都可以。
      全文摘要
      本發(fā)明公開(kāi)了一種用于HPV檢測(cè)的陣列式多重微流體恒溫?cái)U(kuò)增芯片,該芯片以聚二甲基硅氧烷為材料,利用微加工技術(shù),通過(guò)澆注法制備而成。該芯片基本結(jié)構(gòu)由三部分組成擴(kuò)增池,連接管道和毛細(xì)管通道。空間陣列有序排列的系列擴(kuò)增池通過(guò)冷凍干燥技術(shù)包被上核酸探針,利用擴(kuò)增信號(hào)的空間區(qū)分來(lái)實(shí)現(xiàn)一個(gè)樣品中多重核酸目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè);毛細(xì)管通道通過(guò)毛細(xì)拉力實(shí)現(xiàn)反應(yīng)液和樣品的注入,同時(shí)利用其自身的低質(zhì)量傳遞系數(shù)有效阻止核酸探針和擴(kuò)增產(chǎn)物及信號(hào)在不同擴(kuò)增池間的相互影響;擴(kuò)增池和毛細(xì)管通道之間用連接管道連通,使流體平穩(wěn)均勻的流入擴(kuò)增池。該芯片制作簡(jiǎn)單,操作方便,為L(zhǎng)AMP方法實(shí)現(xiàn)臨床多種病原體同時(shí)檢測(cè)提供了有效方案。
      文檔編號(hào)C12Q1/70GK103114033SQ201210443488
      公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日
      發(fā)明者方雪恩, 徐凌佳, 陳旭 申請(qǐng)人:杭州騰越生物科技有限公司
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