專利名稱：冬蟲夏草合成代謝二十碳五烯酸的△-5-脫氫酶、基因及應(yīng)用的制作方法
冬蟲夏草合成代謝二十碳五烯酸的A -5-脫氫酶、基因及應(yīng)用
(-)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與二十碳四烯輔酶A出發(fā)合成代謝二十碳五烯輔酶A的A -5-脫氫酶(A -5 desaturase),編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。二十碳五烯輔酶A再經(jīng)過水解生成二十碳五烯酸。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護(hù)蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴(yán)格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國內(nèi)外已對蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。
不飽和脂肪酸是指分子中含有一個或多個雙鍵的脂肪酸，其熔點(diǎn)較飽和脂肪酸低。不飽和脂肪酸是構(gòu)成體內(nèi)脂肪的一種脂肪酸，人體必需的脂肪酸，不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸二種。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)相對飽和脂肪酸來說具有更多的功效,它可以降低血中膽固醇和甘油三酯，調(diào)節(jié)心臟功能，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細(xì)胞的活性，增強(qiáng)記憶力和思維能力，增強(qiáng)人體防御系統(tǒng)的功能等，此外它還可以排除人體內(nèi)多余的“垃圾”，也就是由于攝人了過量的飽和脂肪酸形成的多余脂肪，從而達(dá)到減肥的目的。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價值受到了世界的廣泛關(guān)注，引起了食品、醫(yī)藥甚至化妝品等行業(yè)的高度重視。1999 年 Yung-Sheng 引克隆了高山被抱霉(Mortiere Uaalpina)的八6和八12脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進(jìn)行了表達(dá)。2004年，Dyer等人將桐樹中的A 3去飽和酶轉(zhuǎn)入酵母，成功地獲得了產(chǎn)亞麻酸的酵母菌。2007年Maali-Amiri等人將藻青菌(Cyanobacterium)的A 12去飽和酶轉(zhuǎn)入馬鈴薯,成功檢測到馬鈴薯脂肪酸成分發(fā)生了明 顯變化。2008年，Hao等人將卷枝毛霉的A 6去飽和酶轉(zhuǎn)人轉(zhuǎn)基因煙草中，成功獲得了高產(chǎn)Y-亞麻酸的菌株。此外，還有許多脂肪酸去飽和酶相關(guān)的基因被克隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用。由于大部分去飽和酶為膜結(jié)合蛋白，其分離純化十分困難，已經(jīng)分離純化并鑒定的去飽和酶屈指可數(shù)，而絕大多數(shù)的研究是圍繞去飽和酶基因及其表達(dá)調(diào)控來進(jìn)行的。目前，所應(yīng)用的不飽和脂肪酸生產(chǎn)菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝不飽和脂肪酸的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌不飽和脂肪酸合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝二十碳五烯酸的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與二十碳四烯輔酶A出發(fā)合成代謝二十碳五烯輔酶A的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種參與二十碳四烯輔酶A出發(fā)合成代謝二十碳五烯輔酶A的A -5-脫氫酶，與SEQ ID No. I或SEQ ID No. 3所示序列具有90%以上同源性；該酶可催化二十碳四烯輔酶A制備相應(yīng)的二十碳五烯輔酶A，二十碳五烯輔酶A再經(jīng)過水解酶的作用生成二十碳五烯酸。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. I或SEQ ID No. 3所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。優(yōu)選的，所述A -5-脫氫酶氨基酸序列如SEQ ID No. I (記為UnsF1蛋白)或SEQID No. 3所示(記為UnsF2蛋白)。本發(fā)明述A -5-脫氫酶來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢。
由二十碳四烯輔酶A合成代謝獲得對應(yīng)二十碳五烯輔酶A、二十碳五烯輔酶A水解生成二十碳五烯酸的路徑如下所示
權(quán)利要求
1.一種參與二十碳四烯輔酶A合成代謝二十碳五烯輔酶A的A-5-脫氫酶，與SEQ IDNo. I或SEQ ID No. 3所示序列具有90%以上同源性。
2.如權(quán)利要求I所述的A-5-脫氫酶，其特征在于所述A -5-脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No. I 或 SEQ ID No. 3 所示。
3.如權(quán)利要求I或2所述的A-5-脫氫酶，其特征在于該酶來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢。
4.如權(quán)利要求I或2所述的A-5-脫氫酶在生物催化二十碳四烯輔酶A制備二十碳五烯輔酶A中的應(yīng)用。
5.編碼權(quán)利要求I或2所述A-5-脫氫酶的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQID No. 2或SEQID No. 4 所示。
7.如權(quán)利要求5所述的基因在構(gòu)建能夠生物催化二十碳四烯輔酶A制備二十碳五烯輔酶A的基因工程菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與二十碳四烯輔酶A出發(fā)合成代謝二十碳五烯輔酶A的△-5-脫氫酶，編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。所述△-5-脫氫酶氨基酸序列與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示序列具有90%以上同源性。本發(fā)明從原理上對二十碳四烯輔酶A合成二十碳五烯輔酶A的代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)二十碳五烯輔酶A生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主△-5-脫氫酶的高表達(dá)性，為擴(kuò)大二十碳五烯酸的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號C12P19/32GK102978177SQ20121044739
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者鄭裕國, 柳志強(qiáng), 吳暉, 李邦良, 許靜, 林善, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司