專利名稱：一種冬蟲夏草ω-6 脂肪酸-脫氫酶、基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與油酰輔酶A出發(fā)合成代謝亞油?；o酶A的Q-6脂肪酸-脫氫酶(Q-6 fatty acid desaturase),編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。亞油?；o酶A再經(jīng)過水解生成亞油酸。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。近年來，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國內(nèi)外已對蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。不飽和脂肪酸是指分子中含有一個或多個雙鍵的脂肪酸，其熔點較飽和脂肪酸低。不飽和脂肪酸是構(gòu)成體內(nèi)脂肪的一種脂肪酸，人體必需的脂肪酸，不飽和脂肪酸根據(jù)雙鍵個數(shù)的不同，分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸二種。多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs)相對飽和脂肪酸來說具有更多的功效,它可以降低血中膽固醇和甘油三酯，調(diào)節(jié)心臟功能，降低血液黏稠度，改善血液微循環(huán)，提高腦細胞的活性，增強記憶力和思維能力，增強人體防御系統(tǒng)的功能等，此外它還可以排除人體內(nèi)多余的“垃圾”，也就是由于攝人了過量的飽和脂肪酸形成的多余脂肪，從而達到減肥的目的。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價值受到了世界的廣泛關(guān)注，引起了食品、醫(yī)藥甚至化妝品等行業(yè)的高度重視。
1999 年 Yung-Sheng 引克隆了高山被抱霉(Mortiere Uaalpina)的八6和八12脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進行了表達。2004年，Dyer等人將桐樹中的A 3去飽和酶轉(zhuǎn)入酵母，成功地獲得了產(chǎn)亞麻酸的酵母菌。2007年Maali-Amiri等人將藻青菌(Cyanobacterium)的A 12去飽和酶轉(zhuǎn)入馬鈴薯,成功檢測到馬鈴薯脂肪酸成分發(fā)生了明顯變化。2008年，Hao等人將卷枝毛霉的A 6去飽和酶轉(zhuǎn)人轉(zhuǎn)基因煙草中，成功獲得了高產(chǎn)Y-亞麻酸的菌株。此外，還有許多脂肪酸去飽和酶相關(guān)的基因被克隆并轉(zhuǎn)化應(yīng)用。由于大部分去飽和酶為膜結(jié)合蛋白，其分離純化十分困難，已經(jīng)分離純化并鑒定的去飽和酶屈指可數(shù)，而絕大多數(shù)的研究是圍繞去飽和酶基因及其表達調(diào)控來進行的。目前，所應(yīng)用的不飽和脂肪酸生產(chǎn)菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝不飽和脂肪酸的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌不飽和脂肪酸合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝亞油酸的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與油酰輔酶A出發(fā)合成代謝亞油酰基輔酶A的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種參與油酰輔酶A出發(fā)合成代謝亞油?；o酶A的Q-6脂肪酸-脫氫酶，與SEQ ID No. I所示序列具有90%以上同源性；該酶可催化油酰輔酶A制備相應(yīng)的亞油?；o酶A，亞油?；o酶A再經(jīng)過水解酶的作用生成亞油酸。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. I所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。優(yōu)選的，所述Q -6脂肪酸-脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示(記為unsE蛋白)。本發(fā)明所述Q-6脂肪酸-脫氫酶來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢。由各油酰輔酶A合成代謝獲得對應(yīng)亞油?；o酶A、亞油?；o酶A水解生成亞油酸的路徑如下所示
權(quán)利要求
1.一種參與油酰輔酶A合成代謝亞油酰基輔酶A的Ω-6脂肪酸-脫氫酶，與SEQ IDNo. I所示序列具有90%以上同源性。
2.如權(quán)利要求I所述的Ω-6脂肪酸-脫氫酶，其特征在于所述Ω-6脂肪酸-脫氫酶的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.如權(quán)利要求I或2所述的Ω-6脂肪酸-脫氫酶，其特征在于所述Ω-6脂肪酸-脫氫酶來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢。
4.如權(quán)利要求I或2所述的Ω-6脂肪酸-脫氫酶在生物催化油酰輔酶A制備亞油?；o酶A中的應(yīng)用。
5.編碼權(quán)利要求I或2所述Ω-6脂肪酸-脫氫酶的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
7.如權(quán)利要求6所述的基因在構(gòu)建能夠生物催化油酰輔酶A制備亞油?；o酶A的基因工程菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與油酰輔酶A出發(fā)合成代謝亞油?；o酶A的Ω-6 脂肪酸-脫氫酶，編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。所述Ω-6 脂肪酸-脫氫酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明從原理上對油酰輔酶A合成亞油?；o酶A的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)亞油?；o酶A生物合成基因的表達，賦予宿主Ω-6 脂肪酸-脫氫酶的高表達性，為擴大亞油酸的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/645GK102965351SQ201210448830
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者鄭裕國, 柳志強, 吳暉, 李邦良, 許靜, 林善, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司