專利名稱：一種gap基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種GAP基因啟動子，特別是一種來源于產(chǎn)甘油假絲酵母(Candidaglycerinogenes)的啟動子。
背景技術(shù)：
產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerolgenesis，CCTCC M93018)是我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的一株具有優(yōu)良發(fā)酵性能的工業(yè)菌株，在中國專利CN1070235C中公開，公告日2001年8月29日，具有耐高滲、高產(chǎn)量，高轉(zhuǎn)化率，生產(chǎn)強(qiáng)度大的特點(diǎn)，居世界領(lǐng)先地位。它能在25%葡萄糖或5% NaCl的高滲透壓培養(yǎng)基上正常生長繁殖，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵中，甘油產(chǎn)量可達(dá)到12%，即使在工業(yè)化規(guī)模中，甘油產(chǎn)量也可達(dá)10%，這是用釀酒酵母甘油代謝理論難以解釋的?；虮磉_(dá)的最終產(chǎn)物是RNA和蛋白質(zhì)，任何基因表達(dá)調(diào)控程序上的缺陷或紊亂，均會對生物體造成嚴(yán)重后果。因此，基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理研究是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。編碼蛋白質(zhì)基因的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都存在著不同的基因表達(dá)調(diào)控位點(diǎn)。而啟動子的調(diào)控在轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)又占有十分重要的地位。因此，研究啟動子的功能對于基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究具有十分重要的意義。強(qiáng)啟動子對于高效基因表達(dá)是必需的。啟動子區(qū)對驅(qū)動和調(diào)節(jié)基因表達(dá)而言是必需的。這些DNA序列的延伸通常發(fā)現(xiàn)在基因開放閱讀框架的上游。啟動子中的關(guān)鍵遺傳元件包含增強(qiáng)子位點(diǎn)、沉默子位點(diǎn)、上游活化子序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。這些元件對指定生物體的外部環(huán)境作出應(yīng)答從而根據(jù)生長條件調(diào)節(jié)基因表達(dá)。獲得高效啟動子具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新的產(chǎn)甘油假絲酵母基因及其啟動子序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I。如上所述的多核苷酸序列SEQ ID NO. I，來源于產(chǎn)甘油假絲酵母3_磷酸甘油醛脫氫酶基因表達(dá)框。包含所述啟動子的載體，例如表達(dá)載體、克隆載體及穿梭載體均為本專利的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供的載體可應(yīng)用于酵母表達(dá)系統(tǒng)；功能基因的篩選(基因克隆于啟動子后)、鑒定及優(yōu)化；調(diào)控基因的表達(dá)；功能基因的穩(wěn)定表達(dá)(基因克隆于啟動子后)或過表達(dá)(采用多個啟動子或啟動脅迫機(jī)制)。上述關(guān)于啟動子的常規(guī)應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度的驗(yàn)證3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度的的重組表達(dá)載體(圖I)，構(gòu)建過程如下
(I)PCR克隆或采用化學(xué)全合成的方法將產(chǎn)甘油假絲酵母CgGAP基因啟動子PcgGAP 連到質(zhì)粒載體 PYX212 (Regenberg, B.，L. During-Olsen, M. C. Kielland-Brandt andS. Holmberg, (1999)Substrate specificity and gene expression of the amino-acid permeasesin Saccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 36 :317-328.)上，得到載體 PYX212_PGgGAP ;(2)將綠色熒光蛋白基因GFP，連接到載體PYX212_PCgeAP上，得到載體PYX212-PCgGAF-GFP ；(3)將zeocin抗性基因連接到載體PYX212-PCgGAp-GFP上，得到載體PYX212-zeocin-PCgGAP-GFP ；通過構(gòu)建的重組表達(dá)載體PYX212-zeocin-PegeAp-GFP，重組質(zhì)粒用熱擊方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母(ATCC 4098 )，涂布含有zeocin的YETO抗性平板。從YETO抗性平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接添加zeocin(150ug/mL)的YEF1D液體培養(yǎng)基,提取質(zhì)粒,驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。 從平板上挑取陽性克隆，接種于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)20h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接入IOmL的YEH)液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)數(shù) 200r/min。利用Olympus熒光顯微鏡進(jìn)行熒光分析。以綠色熒光蛋白為標(biāo)記證實(shí)了構(gòu)建的整合表達(dá)載體的實(shí)用性及可行性，進(jìn)一步驗(yàn)證了產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種高效的啟動子序列，能廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、功能基因的篩選研究。


圖I :PYX212-zeocin-PCgGAp-GFP 物理圖譜；圖2 :產(chǎn)甘油假絲酵母GAP基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度的熒光驗(yàn)證圖(A)野生釀酒酵母作對照；(B)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 PYX212-zeocin-PCgGAp-GFP 的重組釀酒酵母；
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例I :簡并引物PCR擴(kuò)增Candida glycerinogenes的3_磷酸甘油醒脫氫酶基因片段I.簡并引物的設(shè)計(jì)搜索GeneBank公布的相關(guān)酵母和其他真核生物的序列，通過氨基酸序列的比對分析，找到兩個保守區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸序列為IKVGINGF和YDNEYGYSTR，根據(jù)這兩個保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對簡并引物GAPl TBRTB GGITCHGGYAAYTGGGGAP2 RGCVAYVAYRTTYTTYARIGC2. Candida glycerigenes 基因組 DNA 的提取
產(chǎn)甘油假絲酵母(CCTCC M93018)染色體DNA制備按參考文獻(xiàn)[酵母遺傳學(xué)技術(shù)手冊]進(jìn)行。將提取的DNA用DU640核酸蛋白分析儀進(jìn)行測定，根據(jù)A26tlA28tl的比值判斷所提取的DNA純度，利用260nm下的OD值計(jì)算所提取的DNA濃度，同時，通過瓊脂糖凝膠電泳判定模板的質(zhì)量。3. PCR 擴(kuò)增PCR獲得片段長度約為O. 93kb的核酸分子，膠回收后按pGEM-T-Easy (Promega)試 劑盒操作說明進(jìn)行TA克隆，測序結(jié)果獲得一個的序列。實(shí)施例2 :反向引物PCR擴(kuò)增3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長序列I.反向PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)簡并引物PCR擴(kuò)增獲得的序列結(jié)果，設(shè)計(jì)一對反向PCR引物GAPICCTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTGGAPF CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC2. PCR模板的制備按上述方法提取C. glycerinogenes的基因組DNA,分別用限制酶Sac I各酶切5ug基因組DNA，瓊脂糖電泳檢查酶切效果。用I : I的酚和氯仿等體積抽提酶切產(chǎn)物，然后用
2.5倍體積的無水乙醇沉淀，最后溶于50uL超純水中。在200uL連接體系中，加入O. Iug酶切的DNA，20uL的連接緩沖液和IOU T4DNA連接酶，用水補(bǔ)足體積，16°C過夜。連接產(chǎn)物用無水乙醇沉淀后，溶于25uL無菌超純水中，用于下一步反向PCR擴(kuò)增。3.反向PCR擴(kuò)增反向PCR擴(kuò)增,測序結(jié)果經(jīng)拼接后獲得全長的C. glycerinogenes基因序列和啟動子。實(shí)施例3 C. glycerinogenes基因序列信息和同源性分析本發(fā)明產(chǎn)甘油假絲酵母的核苷酸序列全長，詳細(xì)序列見SEQ ID NO. I，內(nèi)部編碼框內(nèi)不含有內(nèi)含子。將產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因序列及其編碼蛋白用BLAST程序，數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因與其它酵母的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因在蛋白質(zhì)水平上存在較高的同源性，屬于同一家庭蛋白。實(shí)施例4 :產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的結(jié)構(gòu)和功能將產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的氨基酸在blocks數(shù)據(jù)庫(http: //www. blocks, fhcrc. org)中檢索結(jié)構(gòu)域。用在線預(yù)測軟件(http:/www. psort. nibb. ac. jp)進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析。實(shí)施例5 :產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度的驗(yàn)證構(gòu)建的重組表達(dá)載體和對照載體，參見附圖I。具體構(gòu)建過程(I)PCR克隆產(chǎn)甘油假絲酵母GAP基因啟動子Pwmp連到質(zhì)粒載體PYX212 (Regenberg, B. , L. During-Olsen, M. C. Kielland-Brandt and S. Holmberg, (1999)Substrate specificity and geneexpression of the amino-acid permeases inSaccharomyces cerevisiae. Curr. Genet. 36 :317-328.)的 BamH I、Hind III 上，得到載體PYX212-PCgGAP ；
(2)根據(jù)質(zhì)粒載體pCAMBIA1302公布的序列合成綠色熒光蛋白基因GFP，連接到載體 PYX212-PCgeAP 的 Hind III、Sac I 上，得到載體 PYX212-PCgeAP-GFP ； (3)根據(jù)質(zhì)粒載體pPGAPZb公布的序列合成zeocin抗性基因連接到載體PYX212-PCgGAP-GFP 的 EcoR I 上，得到載體 PYX212-zeocin_PCgGAP-GFP ；實(shí)施例6 :重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化和篩選通過構(gòu)建的重組表達(dá)載體PYX212-zeocin-Peg(；Ap-GF，重組質(zhì)粒用熱擊方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母，涂布含有zeocin的YEH)抗性平板。從YETO抗性平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接添加zeocin(150ug/mL)的YEF1D液體培養(yǎng)基,提取質(zhì)粒,驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例7 :酵母培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)和突光分析從平板上挑取陽性克隆，接種于IOmL含有150ug/mL zeocin的YETO液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)20h，離心收集菌體，轉(zhuǎn)接入IOmL的YEH)液體培養(yǎng)基中。30°C培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)數(shù) 200r/min?！だ肙lympus熒光顯微鏡進(jìn)行熒光分析。綠色熒光蛋白是一種極具潛力的標(biāo)記物，其內(nèi)源熒光基因在受到紫外光或藍(lán)光激發(fā)時可高效發(fā)射清晰可見的綠光且熒光性質(zhì)穩(wěn)定，與現(xiàn)有的標(biāo)記物相比，gfp具有無可比擬的優(yōu)勢。因而自gfp被發(fā)現(xiàn)以來，一直作為一個監(jiān)測完整細(xì)胞和組織內(nèi)基因表達(dá)及蛋白定位的理想標(biāo)記。本發(fā)明以綠色熒光蛋白為標(biāo)記證實(shí)了構(gòu)建的整合表達(dá)載體的實(shí)用性及可行性，進(jìn)一步驗(yàn)證了產(chǎn)甘油假絲酵母3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子表達(dá)強(qiáng)度(圖2)。
權(quán)利要求
1.一種GAP基因啟動子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的啟動子，特征在于來源于產(chǎn)甘油假絲酵母染色體基因組。
3.權(quán)利要求I所述啟動子的克隆，以產(chǎn)甘油假絲酵母染色體基因組DNA為模板，通過采用簡并引物PCR和反向PCR法從產(chǎn)甘油假絲酵母基因組DNA中克隆出3-磷酸甘油醛脫氫酶基因及其啟動子序列。
4.含有權(quán)利要求I所述啟動子的載體，其特征在于，為表達(dá)載體、克隆載體及穿梭載體。
5.權(quán)利要求I所述的啟動子應(yīng)用于酵母、植物表達(dá)系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求I或2所述的啟動子應(yīng)用于功能基因的篩選、鑒定及優(yōu)化。
7.權(quán)利要求I或2所述的啟動子應(yīng)用于調(diào)控基因的表達(dá)。
8.權(quán)利要求I或2所述的啟動子應(yīng)用于功能基因的穩(wěn)定表達(dá)或過量表達(dá)。
9.權(quán)利要求I或2所述的啟動子應(yīng)用于產(chǎn)甘油假絲酵母高產(chǎn)甘油的研究。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種GAP啟動子基因及其應(yīng)用，屬于微生物分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的啟動子序列如SEQ ID NO.1所示，來源于產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5-59。該基因及其啟動子的克隆擴(kuò)大了微生物抗?jié)B透壓脅迫研究的基因資源，也為產(chǎn)甘油假絲酵母高產(chǎn)甘油的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。含有本發(fā)明啟動子序列的應(yīng)用如表達(dá)載體可構(gòu)建為篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，用于評估基因克隆的效率。作為產(chǎn)甘油假絲酵母基因敲除的工具，進(jìn)行菌種改良，產(chǎn)生更安全及更具產(chǎn)業(yè)利用性的產(chǎn)甘油假絲酵母種。
文檔編號C12N15/113GK102952800SQ20121045224
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者諸葛斌, 張 成, 方慧英, 宗紅, 諸葛健 申請人:江南大學(xué)