專利名稱：應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毒性檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中大多數(shù)藥物水溶性較差，因此在劑型制備過(guò)程中往往需要一定量的溶齊U。然而，溶劑作為化學(xué)物質(zhì)，對(duì)人或動(dòng)物等也存在一定的潛在威脅，大量的攝入也會(huì)影響人或動(dòng)物的健康。因此，快速檢測(cè)溶劑的毒性，擬定其最高使用限量將變得尤為重要。斑馬魚是一種新穎的模式生物，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優(yōu)勢(shì)，是取代青蛙、果蠅、小白鼠等作為研究對(duì)象的優(yōu)良試驗(yàn)?zāi)Ｊ紧~。斑馬魚喂養(yǎng)和維持的費(fèi)用更便宜，所需空間場(chǎng)地不大，易于室內(nèi)大規(guī)模繁殖。成體魚長(zhǎng)3 4cm，一次交配能獲得100 200個(gè)胚胎，每周產(chǎn)卵一次，這樣中等規(guī)模的魚缸每年就能養(yǎng)殖成魚數(shù)百萬(wàn)只，成本僅為養(yǎng)小鼠的O. 斑馬魚是一種脊椎動(dòng)物，與人類基因的相似度高達(dá)85%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性 強(qiáng)，所以可以利用斑馬魚來(lái)檢測(cè)物質(zhì)的毒性，進(jìn)而初步評(píng)價(jià)其對(duì)人類等的毒性?，F(xiàn)有技術(shù)中也有溶劑對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育影響相關(guān)的報(bào)道。例如王思峰等發(fā)表的“溶劑乙醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響”中，分析了乙醇對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響；李佳等發(fā)表的“助溶劑甲苯和二甲基亞砜對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的復(fù)合毒性效應(yīng)”中，分析了甲苯和二甲基亞砜對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的復(fù)合毒性效應(yīng)的研究。前者是在12hpf(hourspost-fertilization,受精后小時(shí)數(shù))、24hpf時(shí)進(jìn)行處理,而在72hpf進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)；后者雖然是在3hpf時(shí)進(jìn)行處理，但最快也需在12hpf才能調(diào)查胚胎發(fā)育情況。上述兩篇現(xiàn)有技術(shù)所報(bào)道的方法周期均較長(zhǎng)。本發(fā)明發(fā)明人在科研過(guò)程中，有了一個(gè)驚奇的發(fā)現(xiàn)，即當(dāng)使用特殊的胚胎培養(yǎng)液配制溶劑時(shí)，能夠使胚胎對(duì)溶劑的不良反應(yīng)在較短的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出來(lái)，大大縮短了檢測(cè)周期，正是基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法。為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案。本發(fā)明提供一種應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法，其特征在于包含如下步驟配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入有機(jī)溶劑，使得胚胎培養(yǎng)液中有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到測(cè)量需要的濃度，用加入了有機(jī)溶劑的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在6-12小時(shí)觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來(lái)判斷有機(jī)溶劑對(duì)胚胎的毒性。其中胚胎培養(yǎng)液用pH為6. 7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有5mM NaCUO. 17mMKCl、0· 43mM CaCl2 和 0. 33mM MgSO4。上述方法中，斑馬魚胚胎通過(guò)如下方法選擇采卵前一天將性成熟的斑馬魚，按雌雄為I : 2的比例放入配缸內(nèi)并隔開，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，之后后置于胚胎培養(yǎng)液中，29. 3°C進(jìn)行控光培養(yǎng)；當(dāng)2hpf時(shí)，在顯微鏡下挑選來(lái)自同一親本、正常發(fā)育比率達(dá)85%以上且發(fā)育時(shí)期一致的斑馬魚胚胎。上述方法中，培養(yǎng)斑馬魚胚胎的方法如下將斑馬魚胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次，然后移入24孔板的樣孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了有機(jī)溶劑的胚胎培養(yǎng)液，每孔3ml，隨后加蓋封閉，置于培養(yǎng)箱中，在29. 3°C培養(yǎng)斑馬魚胚胎。上述方法中，觀察記錄的時(shí)間是培養(yǎng)后第4、6、8、12小時(shí)，記錄畸形率和死亡率。上述方法中，pH為7. 0-7. 8，優(yōu)選地，pH為7. 2。畸形是指斑馬魚體型與正常的相同培養(yǎng)時(shí)間單用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)的斑馬魚體型有差異。
死亡是指用攪拌棒觸碰斑馬魚尾部時(shí)斑馬魚沒(méi)有任何反應(yīng)。上述方法中,所述的有機(jī)溶劑為任何需要測(cè)量其對(duì)生物的毒性有機(jī)溶劑，優(yōu)選地，有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇和乙醇中任意一種。本發(fā)明配制胚胎培養(yǎng)液所用的氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂以及弱堿性水等均為市購(gòu)，其中無(wú)機(jī)鹽均為AR級(jí)；本發(fā)明試驗(yàn)用溶劑分別為二甲基甲酸胺Sigma-Aldrich(Cat#D1435-lL)；丙酮廣州化學(xué)試劑廠AR級(jí)；甲醇廣州化學(xué)試劑廠AR級(jí)；乙醇廣州化學(xué)試劑廠AR級(jí)。需要特別說(shuō)明的是，弱堿性水可以采用任何通過(guò)光電催化電解水獲得的弱堿性水，該弱堿性水的PH為6. 7-8. 5，可以通過(guò)市場(chǎng)上的弱堿性水制備裝置制備，也可以自行通過(guò)電解的方式制備，需要注意的是本發(fā)明的弱堿性水并不是通過(guò)在水中加入化學(xué)物質(zhì)制備得到的弱堿性水，任何通過(guò)加入化學(xué)物質(zhì)到水中制備的弱堿性水不是本發(fā)明所說(shuō)的弱堿性水。弱堿性水的pH可以在制備中調(diào)節(jié)，而不是通過(guò)加入化學(xué)物質(zhì)調(diào)節(jié)pH。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明使用弱堿性水配制的胚胎培養(yǎng)液來(lái)作為測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的培養(yǎng)液，其不僅因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的水為弱堿性水，還因?yàn)榕囵B(yǎng)液中的無(wú)機(jī)鹽的特定組成，使得斑馬魚胚胎能夠快速測(cè)試有機(jī)溶劑的毒性，縮短了檢測(cè)周期。


圖I :正常斑馬魚；圖2 :二甲基甲酰胺處理時(shí)畸形的斑馬魚；圖3 :丙酮處理時(shí)畸形的斑馬魚；圖4 甲醇處理時(shí)畸形的斑馬魚；圖5 乙醇處理時(shí)畸形的斑馬魚；
具體實(shí)施例方式為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限制于此。
實(shí)施例I最佳胚胎培養(yǎng)液的篩選I. I不同配方的胚胎培養(yǎng)液的配制及培養(yǎng)斑馬魚的效果A用普通水配制包含以下濃度無(wú)機(jī)鹽的胚胎培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH為7. 2，培養(yǎng)斑馬魚胚胎72小時(shí)，觀察斑馬魚的透明度和存活率。具體結(jié)果見(jiàn)表I :表I普通水配制的胚胎培養(yǎng)液對(duì)斑馬魚胚胎的影響
權(quán)利要求
1.本發(fā)明提供一種應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法，其特征在于包含如下步驟 配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入有機(jī)溶劑，使得胚胎培養(yǎng)液中有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到測(cè)量需要的濃度，用加入了有機(jī)溶劑的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在6-12小時(shí)觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來(lái)判斷有機(jī)溶劑對(duì)胚胎的毒性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中胚胎培養(yǎng)液用PH為6.7-8. 5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有 5mM NaCl、O. 17mM KCl、O. 43mM CaCl2 和 O. 33mM MgSO4。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中斑馬魚胚胎通過(guò)如下方法選擇 采卵前一天將性成熟的斑馬魚，按雌雄為I : 2的比例放入配缸內(nèi)并隔開，次日上午9:00自然交配并收集受精卵,用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，之后后置于胚胎培養(yǎng)液中，29. 3°C進(jìn)行控光培養(yǎng)；當(dāng)2hpf時(shí),在顯微鏡下挑選來(lái)自同一親本、正常發(fā)育比率達(dá)85%以上且發(fā)育時(shí)期一致的斑馬魚胚胎。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中培養(yǎng)斑馬魚胚胎的方法如下將斑馬魚胚胎用胚胎培養(yǎng)液清洗兩次，然后移入24孔板的樣孔中，每孔20枚，每孔滴加加入了有機(jī)溶劑的胚胎培養(yǎng)液，每孔3ml,隨后加蓋封閉,置于培養(yǎng)箱中,在29. 3°C培養(yǎng)斑馬魚胚胎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中觀察記錄的時(shí)間是培養(yǎng)后第4、6、8、12小時(shí),記錄畸形率和死亡率。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中pH為7.0-7. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中pH為7.2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，其中有機(jī)溶劑為任何需要測(cè)量其對(duì)生物毒性的有機(jī)溶劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中有機(jī)溶劑為二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇和乙醇中任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用斑馬魚測(cè)試有機(jī)溶劑毒性的方法，其主要步驟為配制胚胎培養(yǎng)液，然后向胚胎培養(yǎng)液中加入有機(jī)溶劑，使得胚胎培養(yǎng)液中有機(jī)溶劑的濃度達(dá)到測(cè)量需要的濃度，用加入了有機(jī)溶劑的胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，然后在6-12小時(shí)觀察記錄斑馬魚胚胎發(fā)育的畸形率和死亡率，來(lái)判斷有機(jī)溶劑對(duì)胚胎的毒性。其中胚胎培養(yǎng)液用pH為6.7-8.5的弱堿性水直接配制，胚胎培養(yǎng)液中含有5mM NaCl、0.17mM KCl、0.43mM CaCl2和0.33mM MgSO4。本發(fā)明使用弱堿性水配制的胚胎培養(yǎng)液使得斑馬魚胚胎能夠快速測(cè)試有機(jī)溶劑的毒性，縮短了檢測(cè)周期。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102899384SQ201210455108
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者陳 峰, 裴端卿, 粱桂嬋, 周興茹, 舒曉東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院, 陳 峰