專利名稱：一種以淀粉為原料的麥芽三糖制備方法及其專用真菌α-淀粉酶的制作方法
一種以淀粉為原料的麥芽三糖制備方法及其專用真菌 α -淀粉酶技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明一種以淀粉為原料的麥芽三糖制備方法及其專用真菌α -淀粉酶，涉及一種麥芽三糖的制備方法，屬于淀粉糖制造和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
麥芽三糖是一種由葡萄糖單元主要通過α -1, 4-糖苷鍵連接形成的寡糖，在糕點等食品中添加麥芽三糖可以起到防止淀粉老化、保持水分等作用。麥芽三糖的制備方法主要分為兩種，一種是以多聚麥芽三糖即普魯蘭多糖為原料，用普魯蘭酶分解獲得 (ZL200910015419. 3)，由于目前普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本較高，因此以此制備麥芽三糖的成本也較高；另一種是以淀粉為原料主要通過麥芽三糖淀粉酶分解而獲得，由于麥芽三糖淀粉酶是一種外切型淀粉酶，因此在實際應(yīng)用中，需要將淀粉用內(nèi)切型淀粉酶(一般為細菌 α -淀粉酶)液化后，再用麥芽三糖淀粉酶水解[徐桂華，劉鐘棟，陳肇錟.小麥淀粉制備麥芽三糖的研究.鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2002，23(3) : 1-4]。使用這一工藝必須準確控制細菌α -淀粉酶對淀粉的水解程度，如果水解程度過高獲得的糊精分子量過小則會嚴重影響麥芽三糖的得率。由于細菌α-淀粉酶具有耐高溫的特點因此在液化結(jié)束后必須以高溫高壓進行滅酶，生產(chǎn)過程需要配備相應(yīng)的壓力容器。麥芽三糖淀粉酶是一種外切酶其對淀粉的水解會被淀粉分子中的α -1, 6糖苷鍵阻擋，因此還需要使用普魯蘭酶等淀粉脫支酶以消除淀粉中α-1，6-糖苷鍵對麥芽三糖淀粉酶的水解作用的影響。扣囊復(fù)膜孢酵母具有分解淀粉的能力，Itoh等克隆了扣囊復(fù)膜孢酵母的α-淀粉酶基因[Itoh T, Yamashita I and Fukui S. Nucleotide sequence of the alpha-amylase gene (ALPl) in the yeast Saccharomycopsis fibuligera. FEBS Lett, 1987, 219(2): 339-342·]。以后人們對扣囊復(fù)膜孢酵母的α-淀粉酶基因(分^ )在細菌及釀酒酵母等宿主中的表達進行了研究，但未見利用重組巴斯德畢赤酵母表達5/ 基因以及重組酶水解淀粉所獲得的產(chǎn)物中大量積累麥芽三糖的現(xiàn)象的報道。本發(fā)明首次以巴斯德畢赤酵母為宿主表達扣 囊復(fù)膜孢酵母的 α-淀粉酶基因，結(jié)果顯示，所表達的重組酶在特定工藝條件下水解淀粉獲得的糖漿中麥芽三糖含量可以達到總糖的46%_55%。這一重組酶可以直接用于淀粉的水解，水解過程不受 α-1，6-糖苷鍵的阻擋，只需要一種酶就可以實現(xiàn)淀粉到糖漿的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明公開以重組巴斯德畢赤酵母制備扣囊復(fù)膜孢酵母α-淀粉酶以及利用重組酶水解淀粉制備麥芽三糖的工藝方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以淀粉為原料制備麥芽三糖的方法，以達到簡化麥芽三糖制備方法，降低生產(chǎn)成本的目的。
本發(fā)明提供的一種制備麥芽三糖的方法，是以多種淀粉質(zhì)(玉米淀粉、紅薯淀粉、 馬鈴薯淀粉、糯米淀粉、小麥淀粉等)為原料，經(jīng)單一酶種液化并糖化，直接獲得麥芽三糖含量46%-55%的糖漿，經(jīng)純化而獲得。
本發(fā)明提供一種專用酶制劑SfA的制備方法。SfA是一種特殊的真菌α _淀粉酶， 是通過基因工程手段從扣囊復(fù)膜孢酵母CICIM Υ1037中獲得真菌α-淀粉酶編碼基因5/ , 并在酵母中實現(xiàn)過量表達而獲得。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種以淀粉為原料利用真菌α -淀粉酶SfA制備麥芽三糖的方法，以植物淀粉質(zhì)為原料，利用真菌α -淀粉酶SfA，進行液化和糖化，獲得麥芽三糖占總糖比例46%_55%的糖漿；通過活性炭吸附和酒精洗脫獲得麥芽三糖占總糖比例不低于90 % 的糖漿。其具體工藝為I)淀粉的液化與糖化配制質(zhì)量濃度不高于5%的淀粉乳，加熱至溫度80-85°C，保溫10 min。上述淀粉醪液冷卻至45 V，用質(zhì)量濃度2%_5%的鹽酸溶液調(diào)整pH至4_5，加入SfA， 加量為O. 1-0. 2 U/g干淀粉,液化與糖化同時進行,于45°C反應(yīng)4-8h。得到麥芽三糖質(zhì)量濃度2 %以上，麥芽三糖占總糖濃度46%-55%的糖漿。
2)麥牙二糖的提取(I)將所得麥芽三糖占總糖含量46%-55%的糖漿裝入活性炭柱頂端，用水洗脫收集葡萄糖在層析玻璃柱中裝入活性炭，從上部加入普通自來水至淹沒活性炭。從上部流加步驟 I)獲得的糖漿，·收集層析柱下方流出的液體，檢測流出液體中還原糖含量，至液體中還原糖含量達到O. 2 %則說明活性炭吸附能力已經(jīng)達到飽和，停止流加糖液。將活性炭柱中的液體放空。此前流出的液體中主要含葡萄糖。
(2)用4. 5%-5· O %酒精溶液洗脫收集麥芽糖關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中主要含麥芽糖。重復(fù)上述操作一次。
(3)用6. 5%-7. 5%酒精溶液洗脫收集麥芽三糖關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡60 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中含麥芽三糖， 麥芽三糖占總糖含量一般在90%以上。
(4)最后用12%的酒精溶液洗脫收集麥芽四糖及其他短鏈糊精關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液為麥芽四糖及其他短鏈糊精。
本發(fā)明提供的一種專用酶制劑真菌α -淀粉酶SfA的制備方法包括以下步驟 (I)以扣囊復(fù)膜孢酵母CICIM Υ1037染色體DNA為模版用PCR方法擴增獲得真菌α-淀粉酶基因SfA。上述擴增片段與表達載體pPIC9K連接，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-SfA。重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序，獲得真菌α -淀粉酶SfA編碼基因序列SEQ ID NO :1。
(2)重組質(zhì)粒pPIC9K_SfA電轉(zhuǎn)化表達宿主菌巴斯德畢赤酵母GS115，篩選獲得重組菌/7ZcAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA。其分類命名為/7ZcAia pas tor is GS115/ pPIC9K-SfA，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCC NO M 2012440。
(3)重組菌細胞發(fā)酵，發(fā)酵液用離心等方法除去菌體，上清液即為專用酶制劑真菌 α -淀粉酶SfA0
材料和方法普通分子生物學(xué)方法除非提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化按照標準的分子生物學(xué)方法進行(Sambix)Ok等分子克隆實驗手冊，1989) ο
除非另外提及，PCR操作使用標準方法和PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)進行，可參見(Samtoook等分子克隆實驗手冊，1989)。
DNA操作所使用的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。
引物均為本專利發(fā)明人設(shè)計并由上海生工生物工程有限公司合成。
克隆載體pPIC9K和巴斯德畢赤酵母ZYcAia pas tori s GS115為Invitrogen公司女口廣叩ο
大腸桿菌JM109由中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。
扣囊復(fù)膜抱酵母fibuligera")CICIM Y1037 由中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心公開。
DNA操作使用的酶和試劑盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性內(nèi)切酶，連接酶等均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品Ex Taq,產(chǎn)品編號為DRR006A。所有DNA操作使用的酶、在反應(yīng)時所使用的緩沖液均為購買酶時附贈， 緩沖液濃度均為反應(yīng)所需濃度的10倍。柱式DNA片段回收試劑盒以及從電泳凝膠中回收 DNA片段的試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號分別為DV807A和DV805A。
其他試劑馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、糯米淀粉、小麥淀粉和玉米淀粉均為浙江菱湖淀粉廠產(chǎn)品。酵母氮基(YNB)為Difco公司0/0型酵母氮基，該產(chǎn)品不含碳源和氨基酸?；钚蕴繛闊o錫志康環(huán)保設(shè)備有限公司生產(chǎn)的凈水專用活性炭。
培養(yǎng)基LB在“Samtoook等分子克隆實驗手冊，1989”中描述。
酵母YEro培養(yǎng)基蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，用鹽酸調(diào)整pH至5. 5-6. O。
MD培養(yǎng)基酵母氮基1-2 g/L，葡萄糖2%，1. 5%瓊脂粉。
MD-G418 :在MD培養(yǎng)基中加入抗生素G418至終濃度為5 mg/mL。
MMS-G418培養(yǎng)基1. 38%酵母氮基，O. 5 %甲醇，2%可溶性淀粉，G418 5 mg/mL,1. 5%瓊脂粉。
碘溶液 按文獻[姜錫瑞等.新編酶制劑實用技術(shù)手冊.2002，北京輕工業(yè)出版社]中第398 頁“稀碘液”配制。
搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀pH 6.0，1. 34% YNB, 4X 105% 生物素，1% 甘油。
搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基1%酵母浸出物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀pH 6. O,1. 34%YNB，4X 105%生物素，1%甲醇。
發(fā)酵罐發(fā)酵相關(guān)培養(yǎng)基I)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基磷酸(含量85%) 2. 67% (體積比)，硫酸鈣O. 93g/L，硫酸鉀18.2 g/L，七水合硫酸鎂14.9 g/L，氫氧化鉀4.13 g/L，甘油40 g/L。用自來水定容，滅菌。
2)微量鹽溶液五水合硫酸銅6.0 g/L，碘化鈉0.08 g/L，一水硫酸錳3.0 g/L, 鑰酸鈉0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，氯化鈷0.5 g/L，硫酸鋅20.0 g/L，七水硫酸亞鐵65. O g/L，生物素0.2 g/L，硫酸0.5% (體積比)。用自來水定容。
3)補料培養(yǎng)基50% (w/v)甘油，每1000 mL中加入12 mL微量鹽溶液。
4)誘導(dǎo)培養(yǎng)基100%甲醇，每升加入12 mL微量鹽溶液。
淀粉酶活力測定按文獻[姜錫瑞等.新編酶制劑實用技術(shù)手冊.2002，北京輕工業(yè)出版社]中α-淀粉酶測定方法進行。酶活定義為一小時液化Ig淀粉所需要的酶量為一個酶活單位，表述為 I U/mL。
淀粉酶解產(chǎn)物HPLC分析以3%-5%淀粉為底物，按O. 1-0. 2 U/g干淀粉的量加入重組酶，45°C反應(yīng)6小時。標準品為葡萄糖，麥芽糖，麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖。
分析條件色譜柱安捷倫H1-Plex Pb色譜柱流動相0. 05% (v/v)硫酸柱溫 70 °C、柱壓 16O. 5 mL/min，進樣體積10 μ L0
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明與已報道的制備麥芽三糖的技術(shù)相比具有以下特點1、本發(fā)明以廉價的淀粉質(zhì)為原料，淀粉液化和糖化一步完成，糖化獲得的糖漿中麥芽三糖在總糖中的含量達到46%-55%。從淀粉到麥芽三糖的整個制備過程具有工藝簡單、生產(chǎn)成本低的特點。
2、本發(fā)明提供了一種扣囊復(fù)膜孢酵母來源的真菌α -淀粉酶SfA的制備方法，以淀粉為原料只使用通過該方法獲得的單一酶制劑進行催化即可獲得麥芽三糖占總糖含量在46%-55%的糖漿。淀粉液化和糖化只使用一種酶，不需要淀粉液化酶和脫支酶等其他酶制劑配合。
生物材料樣品保藏實現(xiàn)真菌α -淀粉酶SfA過量表達的重組菌/7ZcAia pas tor is GSl 15/pPIC9K-SfA，其分類命名為 PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學(xué)，簡稱CCTCC，保藏編號CCTCC NO M 2012440， 保藏日期2012年11月I日。


圖1 :糖標準品的HPLC分析。1、麥芽五糖；2、麥芽四糖；3、麥芽三糖；4、麥芽糖； 5、葡萄糖。
圖2:真菌α -淀粉酶降解淀粉獲得的糖液的HPLC分析。1、麥芽三糖；2、麥芽糖； 3、葡萄糖。
圖3 :真菌α -淀粉酶降解淀粉獲得的糖液的主要組分。
圖4 :表達真菌α -淀粉酶SfA的重組載體pPIC9K_SfA。
圖5 :重組菌PicAia pastor is GS115/pPIC9K_SfA表達SfA的蛋白電泳圖譜；皿為蛋白質(zhì)標準分子量，I為重組菌PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA發(fā)酵上清液，2和3均為含空質(zhì)粒的重組菌Z7ZcAia pas tor is GS115/pPIC9K的發(fā)酵上清液。
具體實施方式
通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，實施例將不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 :麥芽三糖糖漿的制備稱取10 g玉米淀粉，用自來水配置成濃度不高于5%的淀粉乳，加熱至80°C，保溫 IOmin0上述淀粉醪液冷卻至45 V，加入濃度為5%的鹽酸溶液調(diào)整pH至4. 5，加入SfA，加量為O. 15 U/g干淀粉，保溫6h。如圖f 3所示為所獲得的淀粉水解液中糖的分析結(jié)果，其中得到的麥芽三糖約占總糖濃度52%，麥芽糖約占39%。以馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、糯米淀粉和小麥淀粉為原料均獲得相似結(jié)果，所獲得的水解液中麥芽三糖占總糖含量在46%至55% 之間。
實施例2 :麥牙二糖的提取(I)層析玻璃柱中裝入活性炭，從上部加入普通自來水至淹沒活性炭。從層析柱上部流加實施例1獲得的糖漿，收集層析柱下方流出的液體，檢測流出液體中還原糖含量，至液體中還原糖含量達到O. 2 %則說明活性炭吸附能力已經(jīng)達到飽和，停止流加糖液。將活性炭柱中的液體放空。流出溶液中主要為葡萄糖。
(2)關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中主要是葡萄糖和麥芽糖。
(3)關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡60 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中含麥芽三糖，麥芽三糖占總糖含量在90%以上。
(4)關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30 min。將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液為麥芽四糖及其他短鏈糊精。
實施例3表達專用真菌α -淀粉酶SfA重組酵母的構(gòu)建按照文獻介紹的方法[周小玲，沈微，饒志明，王正祥，諸葛健.一種快速提取真菌染色體DNA的方法.微生物學(xué)通報，2004，31(4) : 89-92]提取扣囊復(fù)膜孢酵母 (Saccharomycopsis fibuligera ) CICIM Y1037 染色體 DNA。
根據(jù)Itoh等公布的扣囊復(fù)膜孢酵母真菌α-淀粉酶基因序列[Itoh Τ, Yamashita I and Fukui S. Nucleotide sequence of the alpha-amylase gene (ALPl) in the yeast Saccharomycopsis fibuligera. FEBS Lett, 1987, 219(2): 339-342.]設(shè)計引物5’ -AATTACCGTC TAGACAACCA GTGACTCTAT TC-3’ (SEQ ID NO 2),5’ -AATTACCGTC TAGATTATGA ACAAATGTCA GAAG-3’ (SEQ ID NO :3)以上述提取的扣囊復(fù)膜孢酵母染色體DNA為模板，利用上述引物，用Ex Taq酶進行PCR 擴增得到扣囊復(fù)膜孢酵母的α-淀粉酶基因的成熟肽編碼區(qū)。其中PCR擴增條件為95 V5 min ；95 V 30 S，57 V 30 S，72 V 30 s (30 個循環(huán))；72 V 10 min。
質(zhì)粒pPIC9K用Jkt II酶切，純化，目的基因PCR產(chǎn)物用油a I酶切，純化。將酶切純化的質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物連接Ukt II與油a I為同尾酶)，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。在含氨芐青霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，任選4個轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后送上海生工生物工程公司測序，結(jié)果顯示，其中一個轉(zhuǎn)化子所含質(zhì)粒為5/ 基因正確插入PPIC9K獲得的重組質(zhì)粒， 命名為pPIC9K-SfA。本發(fā)明獲得的分^基因序列列于SEQ ID N0:1。該序列與Itoh等報道的扣囊復(fù)膜孢酵母α -淀粉酶基因有3個堿基差異，其中成熟肽編碼區(qū)序列中第1135個喊基在本專利所獲得的SfA基因中為G,而Itoh等提交的序列中為Α,這一差異使序列中第 379位氨基酸由Itoh報道的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?。其他位置的堿基差異均不改變氨基酸序列。重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖4所示。
將上述重組質(zhì)粒以核酸內(nèi)切酶/^711線性化后轉(zhuǎn)化表達宿主菌巴斯德畢赤酵母 GSl 15。轉(zhuǎn)化方法如下接種巴斯德畢赤酵母PicAia pastor is GS115于100 mL YEI3D培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 0D600=1. 5，離心收集菌體并使用預(yù)冷的無菌水洗滌兩次，再使用冰預(yù)冷的I M山梨醇洗滌兩次。離心后使用O. 3 mL冰預(yù)冷的I M山梨醇懸浮置于冰上，作為感受態(tài)細胞備用。
提取重組質(zhì)粒pPIC9K_SfA，使用汝711酶切線性化，使用DNA片段純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。取2-10 μ L純化后的線性化質(zhì)粒加入50 μ L感受態(tài)細胞中，冰上放置5-10min 后，使用BXT電轉(zhuǎn)化儀電擊，條件為7. 5 Kv, 25 mF, 10 ms。電擊后立即加入I mL預(yù)冷的I M山梨醇，取200 μ L涂布MD培養(yǎng)基，30 °C培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。進行多次轉(zhuǎn)化獲得約2000 個以上的轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子2000個并點種至MD-G418培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)48h，大約獲得 400個可以在MD-G418培養(yǎng)基上生長并形成菌落的轉(zhuǎn)化子。將上述轉(zhuǎn)化子再分別點種到麗S-G418培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后在培養(yǎng)基上噴灑碘液，IOmin后，菌落周圍出現(xiàn)透明圈，選取透明圈較大的100個轉(zhuǎn)化子進行產(chǎn)真菌α-淀粉酶的搖瓶發(fā)酵試驗。重組菌搖瓶發(fā)酵條件如下挑取單菌落于 30 mL的搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，200 r/min,30 °C條件下培養(yǎng)至 0D600 ^ 12，于5000 rpm離心5 min，收集菌體，并全部轉(zhuǎn)接到30 mL的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進行淀粉酶的誘導(dǎo)表達，期間每24 h補加O. 5%甲醇以維持誘導(dǎo)。并每隔I天取樣檢測淀粉酶酶活。其中一株在發(fā)酵5天后酶活最高，達到4. 6 U/mL。該菌株的分類命名為pas tor is GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號 CCTCC NO M 2012440。將重組菌 PicAia pas tor is GS115/pPIC9K_SfA 與含空質(zhì)粒的重組 MPichia pas tor is GSl 15/pPIC9K分別進行搖瓶發(fā)酵，取上清液進行SDS-PAGE電泳檢測， 結(jié)果列于圖5。由圖5可見，/7ZcAiaGS115/pPIC9K_SfA發(fā)酵上清液中出現(xiàn)一條新的分子量約為61 kDa左右的條帶，相比按基因序列推測的理論分子量50 kDa偏大，這是用畢赤酵母分泌表達外源基因時經(jīng)常出現(xiàn)的情況，一般是宿主細胞對表達的目的蛋白在分泌過程中進行了糖基化修飾的結(jié)果。SDS-PAGE電泳證明，扣囊復(fù)膜孢酵母的淀粉酶基因 SfA 在 Pichia pas tor is GS115/pP I C9K_Sf A 中得到了 高效表達。
實施例4重組真菌α -淀粉酶SfA的制備在發(fā)酵罐(德國Braun公司15L發(fā)酵罐)中裝入含有4%甘油的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基6 L，滅菌。將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至30°C，用28%氨水(未稀釋的氨水)調(diào)整培養(yǎng)基pH至5. O。在無菌條件下每升培養(yǎng)基添加4. 35 mL微量鹽溶液。
接種一個重組菌ZYcAia pastor is GS115/pPIC9K_SfA的單菌落于搖瓶發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，于30°C，200 r/min培養(yǎng)24h。在無菌條件下轉(zhuǎn)移O. 5 L培養(yǎng)液至發(fā)酵罐中。以 30°C, 200 r/min條件進行菌體培養(yǎng)。在O. 1-1 wm范圍內(nèi)調(diào)整通風(fēng)量，保證溶氧在20 %以上。培養(yǎng)24h后以100 mL/h的速度補加補料培養(yǎng)基，連續(xù)補料2h。
補料培養(yǎng)基補加結(jié)束后再過2h開始補加誘導(dǎo)培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，補加速度為 20 mL/h，維持4h。隨后以5-10 mL/h的速度補加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，注意觀察溶氧情況，如溶氧下降到20 %以下則應(yīng)該降低補料速度。
按照上述方法進行誘導(dǎo)培養(yǎng)到72h后每隔6h取樣檢測淀粉酶酶活，如出現(xiàn)酶活下降則立即停止發(fā)酵，在所敘述的條件下，酶活最高峰一般出現(xiàn)在誘導(dǎo)培養(yǎng)開始后的72-120h 之間。我們一共進行了 20次試驗,發(fā)酵酶活最高的一次為61 U/mL,最低的一次為50 U/ mL。按上述方法進行一次發(fā)酵大約可以獲得酶液10升，總酶活在5X105 U以上，可以實現(xiàn)2.5-5噸淀粉的液化和糖化。
上述發(fā)酵液離心后取上清液即為重組酶SfA。
權(quán)利要求
1. 一種以淀粉為原料利用真菌α-淀粉酶SfA制備麥芽三糖的方法，其特征在于以植物淀粉質(zhì)為原料，利用真菌α -淀粉酶SfA進行液化和糖化，獲得麥芽三糖占總糖比例46%-55%的糖漿；通過活性炭吸附和酒精洗脫獲得麥芽三糖占總糖比例不低于90 %的糖漿；其工藝為 (1)淀粉的液化和糖化配制質(zhì)量濃度不超過5%的淀粉乳，加熱至80-85°C，保溫10min,淀粉醪液冷卻至45°C，用質(zhì)量濃度為2%_5 %的鹽酸溶液調(diào)整pH至4_5，加入SfA，加量為O. 1-0.2 U/g干淀粉，液化與糖化同時進行，于45°C反應(yīng)Γ8 h，制得麥芽三糖占總糖含量46%-55%的糖漿； (2)麥芽三糖的提取 1、將所得麥芽三糖占總糖含量46%-55%的糖漿裝入活性炭柱頂端，用水洗脫收集葡萄糖在層析玻璃柱中裝入活性炭，從上部加入普通自來水至淹沒活性炭，從上部流加步驟(I)獲得的糖漿，收集層析柱下方流出的洗脫液，檢測流出的洗脫液中還原糖含量，至流出的洗脫液中還原糖含量達到O. 2 %則說明活性炭吸附能力已經(jīng)達到飽和，停止流加糖漿；將活性炭柱中的液體放空，此前流出的洗脫液中主要含葡萄糖； 、用4. 5%-5. O %酒精溶液洗脫收集麥芽糖關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入4. 5%-5. 0%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30min，將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中主要含麥芽糖，重復(fù)上述操作一次； ii1、用6.5%-7. 5%酒精溶液洗脫收集麥芽三糖關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入6. 5%-7. 5%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡60min，將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液中含麥芽三糖，得麥芽三糖占總糖含量不低于90 %的糖漿； iv、最后用12%的酒精溶液洗脫收集麥芽四糖及其他短鏈糊精關(guān)閉活性炭柱下方出口，從活性炭柱上部加入12%的酒精溶液，至酒精溶液淹沒活性炭，平衡30min，將活性炭柱下方出口打開，將酒精溶液放出，此溶液含麥芽四糖及其他短鏈糊精。
2.權(quán)利要求1所述方法中所用的真菌α-淀粉酶SfA的表達重組菌，其分類命名為Pichia pastor I s GS115/pPIC9K_SfA，已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏編號 CCTCC NO M 2012440。
全文摘要
一種以淀粉為原料的麥芽三糖制備方法及其專用真菌α-淀粉酶，屬于淀粉糖制造和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以各種植物淀粉質(zhì)為原料，利用真菌α-淀粉酶SfA進行液化和糖化，獲得麥芽三糖占總糖比例46%-55%的糖漿；通過活性炭吸附和酒精洗脫獲得麥芽三糖占總糖比例不低于90%的糖漿；本發(fā)明還提供真菌α-淀粉酶SfA的高效制備方法。真菌α-淀粉酶SfA基因來源于扣囊復(fù)膜孢酵母CICIMY2037，通過基因重組手段獲得重組巴斯德畢赤酵母，用重組菌進行SfA的高效制備。用真菌α-淀粉酶SfA制備麥芽三糖的方法與現(xiàn)有的方法相比具有原料成本低、不依賴于淀粉液化酶和淀粉脫支酶以及工藝簡單、易于放大的優(yōu)點。
文檔編號C12N9/30GK103014097SQ20121047118
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者沈微, 郭玉婉, 黃雯雯, 樊游, 陳獻忠 申請人:江南大學(xué)