專利名稱：雙峰駝內(nèi)收蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)收蛋白(Adducin)是一個(gè)紅細(xì)胞膜骨架蛋白質(zhì)。由α和β或α和Y兩個(gè)亞基組成的二聚體，它的形態(tài)似不規(guī)則的盤狀物，高5. 4nm,直徑12. 4nm。每個(gè)紅細(xì)胞約有30000個(gè)分子。內(nèi)收蛋白可與肌動(dòng)蛋白及血影蛋白復(fù)合體結(jié)合，并且通過(guò)Ca2+和鈣調(diào)蛋白的作用影響骨架蛋白的穩(wěn)定性，從而影響紅細(xì)胞的形態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)收蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是一種無(wú)處不在的細(xì)·胞膜骨架蛋白。目前認(rèn)為它參與了細(xì)胞連接、膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞的過(guò)程。內(nèi)收蛋白集中在膜收縮蛋白結(jié)點(diǎn)以結(jié)合鈣調(diào)蛋白并且在體內(nèi)是蛋白激酶(PCK)和Rho-聯(lián)合激酶的作用物。內(nèi)收蛋白亞基和序列有關(guān)而且都包含在氨基末端球形區(qū)、頸區(qū)和羧基端敏感蛋白酶尾部區(qū)。所有內(nèi)收蛋白亞基的尾部區(qū)以高度保守的富含丙氨酸的豆蘧酰化的激酶C底物(MARCKS)的22-殘基領(lǐng)域結(jié)束。內(nèi)收蛋白覆蓋了肌動(dòng)蛋白絲的快速生長(zhǎng)端，也優(yōu)先補(bǔ)充了膜收縮蛋白尾絲。內(nèi)收蛋白與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，并可以與血影蛋白-肌動(dòng)白復(fù)合體結(jié)合，促使血影蛋白組裝于該復(fù)合體。對(duì)裝配和維持血影蛋白-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)起重要作用。內(nèi)收蛋白的研究，人類α-內(nèi)收蛋白cDNA存在Gly460Trp多態(tài)性，表現(xiàn)為第640位堿基由G替換為T,從而導(dǎo)致編碼該蛋白第460位的甘氨酸(Gly)替換為色氨酸(Trp)。在高加索人種無(wú)親緣關(guān)系的群體研究中發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓(EH)患者中，Gly460Trp雜合子的的頻率明顯高于正常對(duì)照者。在家系內(nèi)進(jìn)行連鎖分析，也發(fā)現(xiàn)該基因附近位點(diǎn)與EH連鎖。在1997年，Barlassina等人對(duì)a -Adducin的遺傳性和原發(fā)性高血壓病人對(duì)鹽的感受性進(jìn)行了研究。在雙峰駝中，細(xì)胞需要內(nèi)收蛋白進(jìn)行細(xì)胞連接、膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳遞的過(guò)程。是維持細(xì)胞膜骨架蛋白穩(wěn)定性不可缺少的一種蛋白質(zhì)。對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)有十分重要的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供了一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法，該內(nèi)收蛋白是維持細(xì)胞膜骨架蛋白穩(wěn)定性不可缺少的一種蛋白質(zhì)，對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)有十分重要的影響。本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列。下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述基因的核苷酸序列可具有SEQ ID NO. I中108-1412位的序列。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種含有雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的重組蛋白。
下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
上述重組蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。上述重組蛋白可具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。上述重組蛋白可通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝內(nèi)收蛋白中得到雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的克 隆方法，按下述步驟進(jìn)行
第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對(duì)組織樣品進(jìn)行組織總RNA提??；
第二步，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對(duì)的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ；
第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對(duì)待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；
第四步，蛋白基因的克隆，首先對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，最后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行回收。本發(fā)明雙峰駝內(nèi)收蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是維持細(xì)胞膜骨架蛋白穩(wěn)定性不可缺少的一種蛋白質(zhì)，對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)有十分重要的影響，因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為雙峰駝內(nèi)收蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹所用內(nèi)收蛋白氨基酸同源性比較。圖3為不同物種內(nèi)收蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)上述本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)際情況來(lái)確定具體的實(shí)施方式。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步論述
實(shí)施例I，一種雙峰馬它內(nèi)收蛋白基因，該基因的核昔酸序列具有SEQ ID NO. I所不的序列。雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的核苷酸序列是通過(guò)以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的內(nèi)收蛋白基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得雙峰駝內(nèi)收蛋白基因核苷酸序列SEQ ID NO. I?？筛鶕?jù)實(shí)際需要，對(duì)雙峰駝內(nèi)收蛋白基因作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)
雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I中108-1412位的序列。在SEQ IDNO. I中，RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1488bp，電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1，其中108-110位為起始密碼子ATG，1410-1412位為終止密碼子TGA，108-1412位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(CDS);在SEQ ID NO. I,M峰駝內(nèi)收蛋白基因編碼413個(gè)氨基酸。實(shí)施例2，一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的重組蛋白?？筛鶕?jù)實(shí)際需要，對(duì)雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的重組蛋白作進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn) 重組蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。將雙峰駝內(nèi)收蛋白基因cDNA
序列中的編碼序列(⑶S)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO. 2。重組蛋白可具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。將雙峰駝內(nèi)收蛋白基因核苷酸序列中的編碼序列按通用密碼子翻譯成氨基酸序列SEQ ID NO. 2。
通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)弓I物從雙峰駝內(nèi)收蛋白中得到雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。實(shí)施例3，一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行
第一步，總RNA提取
I、組織分離(Isolation)
從內(nèi)蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得樣品，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于一 70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
玻璃制品用0. IM的NaOH浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍，180°C烘烤4小時(shí)；
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20分鐘至30分鐘，再用0. 1%的DEPC水沖洗.由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5%的SDS處理；
Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過(guò)夜，高壓滅菌使DEPC失活；
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0. ImlDEPC液，室溫放置過(guò)夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。(2 )組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣品放入有Iml TrizolCtrizal reagent, invitrogenBRL, USA)的勻漿器管中勻漿；4°C 12000g離心10分鐘；吸取離心后勻漿器管內(nèi)的上清液移入EP管中，15°C至30°C溫育5分鐘；往EP管中加0.2ml氯仿，蓋緊蓋子，用手劇烈震蕩15秒，15-30°C溫育2分鐘至3分鐘，4°C、12000g、離心15分鐘；吸取上一 EP管中上清液于新的EP管內(nèi)，加0. 8ml異丙醇，混合均勻，15°C至30°C溫育10分鐘，4°C、12000g、離心10分鐘，EP管底部白色沉淀即為RNA ;倒掉上一 EP管中上清液，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，4°C、7500g離心、10分鐘；自然干燥或真空干燥RNA，溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。(3)組織總RNA的鑒定
通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定上步得到的RNA溶液中RNA含量，并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡小時(shí)4小時(shí)至5小時(shí)，再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入IXTBE待用；瓊脂糖凝膠用IXTBE配制，在IOul上樣緩沖液(2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2分鐘至3分鐘，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。第二步，引物設(shè)計(jì)及合成
根據(jù) GenBanK 發(fā)表的人(AAB05645. I)、鼠(AAF29504. I)、牛(NP001192928. I)等物種的內(nèi)收蛋白基因mRNA序列ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝內(nèi)收蛋白核苷酸為模版的PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰駝內(nèi)收蛋白基因cDNA序列，引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對(duì)的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:3 (正向)和SEQ ID N0:4 (反向)，序列信息如下 SEQ ID NO:3 (正向)5，- ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，，
SEQ ID NO:4 (反向)01igo dT。第三步，RT-PCR擴(kuò)增
按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver. I. I)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture, 0. 5ulRnase Inhibitor (40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample, I. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20 ul ;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘；PCR擴(kuò)增條件97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)(此處的循環(huán)是否應(yīng)該為變性與退火做為整體循環(huán)？即97°C變性5分鐘、95°C 30秒、55°C 30秒、720C I分鐘為一個(gè)輪回)，使引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；72°C延伸10分鐘，4°C保存。第四步，蛋白基因的克隆
I、PCR擴(kuò)增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，操作過(guò)程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入I. 5mlEP管中，按每IOOmg瓊脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘，將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg離心I分鐘，倒掉管中液體，在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體，在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體，離心I分鐘，將吸附柱放入一個(gè)干凈的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA片段。2、回收DNA片段同T載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過(guò)程如下在EP管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA20-40ng, Solution I 5ul，加dH20至IOul，將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過(guò)夜也可以)，產(chǎn)物為轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。3、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶，IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘，42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加400ul液體LB培養(yǎng)基，370C復(fù)活50分鐘，取IOOul鋪于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒溫培養(yǎng)10小時(shí)至15小時(shí)。4、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落，將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入O. 1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37 °C過(guò)夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)粒回收。5、質(zhì)粒的回收質(zhì)?；厥沼蒙虾ＨA舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入I. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀，細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心，在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮，加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘，加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體，在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl,靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘,將吸附柱放入一個(gè)干凈的I. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。 6、質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III.保證目的片段中無(wú)這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul,Hin d III Iul，IOXK Buffer 2ul，DNA ( lul，加 dH20 至 20ul，30°C反應(yīng) 3 小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。實(shí)施例4，對(duì)實(shí)施例3中重組質(zhì)粒的測(cè)序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序得到SEQ ID NO. I核苷酸序列和SEQ ID NO. 2氨基酸序列。實(shí)施例5 :雙峰駝內(nèi)收蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建
I、雙峰駝內(nèi)收蛋白基因編碼序列同源性比較
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等八種動(dòng)物的內(nèi)收蛋白基因編碼蛋白序列，將其同克隆測(cè)序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. I序列一起，在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較(見(jiàn)附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與豬和馬的內(nèi)收蛋白氨基酸序列同源性為94. 00%ο2、內(nèi)收蛋白基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等八種物種的八條內(nèi)收蛋白基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(見(jiàn)附圖3)，結(jié)果顯示雙峰駝內(nèi)收蛋白基因同豬和馬的親緣關(guān)系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝內(nèi)收蛋白基因。以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來(lái)滿足不同情況的需求。序列表
<110>新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司 〈120〉雙峰駝內(nèi)收蛋白的蛋白編碼序列 〈160〉 4 〈210〉 I 〈211〉 1488〈212〉 DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝〈400〉 I
gagccggagc cggagtcgcc ggagcggacg ggcggctgtc gcactgggac ctaggagctt60
tcgcgctgcc cgccattcgc ctctgaggaa cctagaagga ctgtgcgatg atgaatggtg120
atactcgggc ggcagtggtg acctcaccac ccccgaccac agtccctcac aaggagaggt180
atttcgacag agtggatgag aacaatccag aatacttgcg agagaggaac atggccccag240
accttcgcca ggacttcaac atgatggagc agaagaagag ggtgtccatg attctgcaga300
gccccgcttt ctgtgaagag ctggagtcaa tgatacagga acaatttaag aaggggaaga360·
atcccacagg cctgttggca ttacagcaga ttgcagactt catgaccgcg aatgtcccaa420
acgtctaccc ggcagctcca cagggaggga tggctgcctt aaacatgagt ctcggtatgg480
tgactcctgt gaatgacctt agaggatcag attctattgc ctatgacaaa ggggagaagt540
tattgcggtg taaactggcg gccctttacc gactagcgga tctctttgga tggtcgcagc600
ttatctacaa tcacatcaca accagagtga gctctgagca ggaacacttc ctcatcgtac720
cgtttggact tctctacagt gaagtgactg catccagttt ggttaaaatc aacctacaag780
gagatgtagt agatcgtgga agcactaacc tgggggtcaa tcaggctggc ttcacgctgc840
attctgcaat ttacgctgca cggccggacg tgaagtgtgt tgtgcacatc cacacgccgg900
caggggctgc ggtctctgcg atgaagtgcg gcctcttgcc aatctcccca gaggcacttt960
cccttggaga agtggcttat catgattatc atgggattct ggttgatgag gaagaaaaag1020
ttttaattca gaaaaatttg gggcctaaaa gcaaggtcct cattctccgg aaccacgggc1080
tggtgtccgc tggcgagagt gtggaggagg ccttctatta catccataac ctcgtggttg1140
cgtgtgagat ccaggttcgc actctggcca gtgcaggagg gccagacaac ttagtcctcc1200
tggatcccga gaagtacaaa gccaagtccc gccccgctgg gtctccggcc gcggagggca1260
gcgggtcaac tccccagtgg cagattggtg agcaggagtt tgaagccctc atgcggatgc1320
tcgataatct gggactttgc tgccgctttc tgccggaggc cctctcctgc ttacgggagg1380
ccgtggagcc cagtggggtg caggagccgt gaggccccac gctaacactg tcctgtccgg1440
agcgaccctg gcccgccaga gtccccgact gcgggctgtg gctctggc1488〈210〉 2〈211〉 413〈212〉 PRT
〈213〉阿拉善盟雙峰駝〈400〉 2
MNGDTRMVV TSPPPTTVPH KERYFDRVDE NNPEYLRERN MAPDLRQDFN MMEQKKRVSM60
ILQSPAFCEE LESMIQEQFK KGKNPTGLLA LQQIADFMTA NVPNVYPMP QGGMAALNMS120
LGMVTPVNDL RGSDSIAYDK GEKLLRCKLA ALYRLADLFG WSQLIYNHIT TRVSSEQEHF180
LIVPFGLLYS EVTASSLVKI NLQGDVVDRG STNLGVNQAG FTLHSAIYAA RPDVKCVVHI240
HTPAGMVSA MKCGLLPISP EALSLGEVAY HDYHGILVDE EEKVLIQKNL GPKSKVLILR300
NHGLVSAGES VEEAFYYIHN LVVACEIQVR TLASAGGPDN LVLLDPEKYK AKSRPAGSPA360
AEGSGSTPQff QIGEQEFEAL MRMLDNLGLC CRFLPEALSC LREAVEPSGV QEP413〈210〉 3〈211〉 21〈212〉 DNA〈213〉人工〈400〉 3
ATGAATGGTGATACTCGGGCG21
〈210〉 4
〈211〉 〈212〉 DNA〈213〉人工〈400〉 4Oligo dT 。
權(quán)利要求
1.一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，其特征在于該基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO. I 中 108-1412 位的序列。
3.一種含有權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的重組蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO. 2所示的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白為具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的重組蛋白，其特征在于通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝內(nèi)收蛋白中得到雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組蛋白，其特征在于通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝內(nèi)收蛋白中得到雙峰駝內(nèi)收蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3，， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝內(nèi)收蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步驟進(jìn)行 第一步，總RNA提取，采取雙峰駝組織樣品后，對(duì)組織樣品進(jìn)行組織總RNA提取； 第二步，引物設(shè)計(jì)及合成，引物對(duì)的核苷酸序列信息如下 正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGAATGGTGATACTCGGGCG -3’， 反引物，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT ； 第三步，RT-PCR擴(kuò)增，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)組織樣品中的蛋白基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并對(duì)待擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增； 第四步，蛋白基因的克隆，首先對(duì)PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行回收，然后將回收的DNA片段同T載體連接形成感受態(tài)細(xì)胞，將感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)成單菌落，取少量該單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的單菌落鑒別T載體上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，將單菌落放入培養(yǎng)基中進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，最后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行回收。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝內(nèi)收蛋白基因及其克隆方法，該蛋白基因的核苷酸序列具有SEQIDNO.1所示的序列，本發(fā)明雙峰駝內(nèi)收蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，是維持細(xì)胞膜骨架蛋白穩(wěn)定性不可缺少的一種蛋白質(zhì),對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)有十分重要的影響,因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102952808SQ20121048057
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者陳鋼糧 申請(qǐng)人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司