專利名稱：鹽藻培養(yǎng)基、半連續(xù)培養(yǎng)方式及藻液中原生動物殺滅方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種鹽藻半連續(xù)培養(yǎng)方式及藻液中原生動物污染的消除方法。
背景技術(shù)：
鹽藻(Dunaliella salina)是一種雙鞭毛單細(xì)胞綠藻,可耐高鹽度(20-300%。)。鹽藻在脅迫條件下可大量積累胡蘿卜素，最高可達(dá)干重的14%，為自然界所有生物之首，因此早在1966年，Massyuk就提出可大規(guī)模培養(yǎng)鹽藻生產(chǎn)β -胡蘿卜素；另外鹽藻含有的甘油可達(dá)干重的40 %，具有生產(chǎn)甘油的潛在前途；鹽藻還是一種良好的水產(chǎn)動物飼料。我國具有漫長的海岸線和眾多的內(nèi)陸鹽湖，具有培養(yǎng)鹽藻生產(chǎn)β_胡蘿卜素得天獨(dú)厚的自然條件。海水中無機(jī)碳的存在形式以HC03_為主(90% )，而游離的CO2不足10A。過去人們·一直認(rèn)為，水體中游離CO2是藻類利用外源無機(jī)碳的唯一形式。張學(xué)成的工作表明，螺旋藻培養(yǎng)基中添加50-100mmol/LNaHC03，不僅可以滿足螺旋藻生長的需要，而且有助于保持藻體生長的PH值。林惠民認(rèn)為，NaHCO3可作為藻類生長的碳源。我的研究結(jié)果表明鹽藻可以利用HC03_作為碳源。溫度、光照、鹽度、營養(yǎng)鹽等對鹽藻生長都有重要影響。氮在細(xì)胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、葉啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是鹽藻生長最重要的營養(yǎng)元素。有研究認(rèn)為硝酸態(tài)氮是鹽藻生長的最佳氮源。我的研究顯示NH4NO3用作氮源無論對鹽藻細(xì)胞密度的增加、葉綠素a的合成、β -胡蘿卜素的積累等方面的效果均優(yōu)于NaNO3和NH4Cl,這可能是兩種離子作用互補(bǔ)的結(jié)果。海泥抽出液含有藻類生長所必需的各種無量元素和溶解有機(jī)物質(zhì)及某些輔助生長物質(zhì)；具有類似絡(luò)合劑的作用。在培養(yǎng)液中加入海泥抽出液，實際是解決了微量元素供應(yīng)的問題。碳水化合物是海泥的有機(jī)組成成分，可以補(bǔ)充碳源。陳振奮認(rèn)為，海泥抽取液對牟氏角毛藻生長的促進(jìn)作用強(qiáng)于維生素。我的研究表明，每升培養(yǎng)液添加3-10mL的海泥抽取液對鹽藻生長有較好促進(jìn)作用。人尿中95 %是水，5 %是可溶性無機(jī)鹽，其中約2 %是尿素。在藻細(xì)胞的氮代謝中，氮必須以NH4+的形式與細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋白質(zhì)。已經(jīng)證實許多藻含有尿素酶，在它的催化作用下，尿素分解出氨被微藻利用，酶功能的差異是造成各種微藻利用尿素能力差異的主要原因。孫凌毅指出微藻對銨鹽和尿素的利用強(qiáng)于硝酸鹽。張貴杰等研究指出培養(yǎng)牟氏角毛藻以尿素效果最好，硝酸鈉次之，氯化銨最差。張青田等認(rèn)為以尿素為氮源培養(yǎng)隱藻效果強(qiáng)于氯化銨。本人研究證實2-5mL的尿液對鹽藻生長有較好促進(jìn)作用。目前，鹽藻規(guī)?；囵B(yǎng)存在的主要問題是藻細(xì)胞生長緩慢、倍增時間長、易污染。合適的培養(yǎng)基是實現(xiàn)鹽藻高密度培養(yǎng)的基礎(chǔ)。以前使用的培養(yǎng)基沒有加入碳酸氫鈉和海泥抽取液，但大量實驗表明，鹽藻除了能利用空氣中游離的CO2，還能有效地利用培養(yǎng)液中的HC03_作為碳源。NaHCO3不僅縮短了鹽藻的倍增時間，而且延長了鹽藻的生長時間。我的實驗表明，添加適量的NaHCO3和海泥抽取液及f/2維生素溶液能大大提高生長速度，鹽藻的產(chǎn)量能提高76%。關(guān)于鹽藻的培養(yǎng)方式，以前是采用開放水泥池。缺點(diǎn)是易污染，洗刷不便，現(xiàn)在我用塑料薄膜懸浮吊帶培養(yǎng)代替開放水泥池，好處是成本低、易于操作、不易污染、易于掌控、靈活多樣、不易劃破、安全可靠。鹽藻是耐高鹽的廣鹽性單細(xì)胞綠藻，是自然界最耐鹽的真核生物之一，可耐300%。的高鹽度。在實驗室培養(yǎng)中一般不會造成原生動物等的污染。但在室外水泥池大面積培養(yǎng)中常發(fā)生由耐高鹽的原生動物(變形蟲、鹵蟲、纖毛蟲、鹽生無泡纖蟲)造成的污染,這些生物通過直接捕食鹽藻或爭奪營養(yǎng)鹽或生活空間而使鹽藻的生長繁殖受到嚴(yán)重壓抑，有時鹽藻的密度被限制在30X IO4ceIVmL以下(正常密度為70X 104_90X 104cell/mL)。研究發(fā)現(xiàn)，在較低的鹽度(60-120%。)下鹽藻生長最快，在這種鹽度下，污染原生動物的種類和數(shù)量更多。因此，在鹽藻的規(guī)模生產(chǎn)中，如何防治原生動物特別是變形蟲造成的污染已成為一個亟待解決的問題。雖然較高濃度的(NH4)2CO3對鹽藻和原生動物都有毒害作用，抑制其生長繁殖或直接將其殺死，但我的研究發(fā)現(xiàn)，與鹽藻相比，原生動物對(NH4) 2C03更敏感，更易被殺死，這正是本發(fā)明的理論基礎(chǔ)。(NH4)2CO3加入到培養(yǎng)基中發(fā)生電離并形成水解平衡(NH4) 2C03 — 2NH:+C032+C032++H20 — HCCV+OF
HCO3^H2O — H2co3+or水解產(chǎn)生的大量0!1_使培養(yǎng)基p H值迅速上升，最高可達(dá)9. 5。(NH4) 2C03抑制或毒殺原生動物的原理可能是=NH4+的直接毒殺作用；迅速上升的pH值也可直接殺死原生動物。我的研究表明，用O. 6g/L的(NH4)2CO3處理培養(yǎng)基12小時對殺滅原生動物有極好效果。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種鹽藻培養(yǎng)基配方，配方如下NH4NO3 40毫克，KH2PO4 I. 2毫克，NaHCO3 450毫克，九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升，人尿2毫升，海泥抽取液5暈升，消毒海水1000暈升。其中f/2微量兀素溶液配方ZnSO4 · 4H20 23暈克，MnCl2 · 4H20178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克，F(xiàn)eC6H5O7 · 5H20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7· 3 毫克，CoCl2 · 6Η2012毫克，Na2EDTA 4. 35克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12
O.5暈克，維生素B1 100暈克，維生素HO. 5暈克，純水1000暈升。鹽藻塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括如下步驟采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口。一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器。將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X 400厘米X 85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入O. 8-1. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)。每池吊袋6-8個。飽和鹵水取自內(nèi)陸鹽湖，用蒸餾水稀釋至鹽度120%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。按上述培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等。接種密度3X 104-4X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度28±3°C，光強(qiáng)5000-100001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石。夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時,重復(fù)進(jìn)行。培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)60 X 104-120 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。殺滅藻液中原生動物的方法，其特征在于包括如下步驟當(dāng)培養(yǎng)基使用了 10天以上時，藻液中會出現(xiàn)很多纖毛蟲等原生動物，這時按每升藻液加入O. 6克(NH4)2CO3的量加入(NH4)2CO3,連續(xù)充氣4小時，使之充分溶解并混合均勻，這時藻液中會出現(xiàn)大量沉淀，靜置8小時，棄去沉淀物，將上清液移入到另一潔凈的培養(yǎng)容器中，加入4-5倍體積的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 有益效果鹽藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用f/2培養(yǎng)液配方，生長速度慢，產(chǎn)量低。使用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽藻生長速度快、產(chǎn)量高、胡蘿卜素含量高、成本低，產(chǎn)量能夠提高76%。塑料薄膜懸浮吊帶半連續(xù)培養(yǎng)方法培養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池培養(yǎng)鹽藻，易于操作、不易污染、易于掌控、靈活多樣、不易劃破、安全可靠，透光性好，成本低，生長快，產(chǎn)量高。用
O.6g/L的(NH4)20)3處理藻液12小時能有效殺滅藻液中的尖鼻蟲、游仆蟲、纖毛蟲等原生動物，而且操作簡便，對鹽藻細(xì)胞傷害很小。


圖I為塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)鹽藻的示意圖其中，附圖標(biāo)記如下1塑料薄膜袋2水泥池3藻液4進(jìn)氣管5出氣管6散氣石7普通海水。
具體實施例方式培養(yǎng)基配制方法I)九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；2)加營養(yǎng)鹽的過程中需不斷攪水，而且各種營養(yǎng)鹽按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；3)各種營養(yǎng)鹽特別是f/2微量元素溶液和f/2維生素溶液均需預(yù)先配成母液備用；但放置時間不要超過7天，且最好4°C冰箱冷藏保存；4)全部營養(yǎng)鹽加完后再充氣攪拌15分鐘，即可接種；5)人尿制備取人尿1000毫升，燒瓶煮沸后冷卻備用；6)海泥抽取液制備取比較肥沃又不於黑的海泥，以I份泥加2份淡水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置1-2分鐘，取上層泥漿于鋁鍋中，按每1000毫升泥漿加I克NaOH的量加入NaOH，煮沸20-30分鐘。煮時需不斷攪拌均勻，煮后靜置24小時取上清液備用；
7)所有藥品純度均需化學(xué)純級別；8)此培養(yǎng)基配方對鹽藻各培養(yǎng)階段都適用。9)向藻液加入(NH4)2CO3時，(NH4)2CO3需預(yù)先溶解并不斷攪拌或充氣，免得局部藥物濃度太高，傷害藻細(xì)胞。鹽藻培養(yǎng)基配方，配方如下NH4NO3 40毫克，KH2PO4 I. 2毫克，NaHCO3 450毫克，九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升，人尿2毫升，海泥抽取液5暈升，消毒海水1000暈升。其中f/2微量兀素溶液配方ZnSO4 · 4H20 23暈克，MnCl2 · 4H20178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克，F(xiàn)eC6H5O7 · 5H20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7· 3 毫克，CoCl2 · 6Η2012毫克，Na2EDTA 4. 35克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12
O.5暈克，維生素B1 100暈克，維生素HO. 5暈克，純水1000暈升?！}藻塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，參見附圖采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口。一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器。將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入O. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)。每池吊袋6-8個。飽和鹵水取自內(nèi)陸鹽湖，用蒸餾水稀釋至鹽度120%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。按上述培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等。接種密度3X 104-4X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度28±3°C，光強(qiáng)5000-100001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石。夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時,重復(fù)進(jìn)行。培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)60 X 104-120 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。殺滅藻液中原生動物的方法當(dāng)培養(yǎng)基使用了 10天以上時，藻液中會出現(xiàn)很多纖毛蟲等原生動物，這時按每升藻液加入O. 6克(NH4)2CO3的量加入(NH4)2CO3,連續(xù)充氣4小時，使之充分溶解并混合均勻，這時藻液中會出現(xiàn)大量沉淀，停止充氣，靜置8小時，棄去沉淀物，將上清液移入到另一潔凈的培養(yǎng)容器中，加入4-5倍體積的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。最后應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種鹽藻培養(yǎng)基，其特征在于該鹽藻培養(yǎng)基配方如下 NH4NO3 40毫克，KH2PO4 I. 2毫克，NaHCO3 450毫克，九二 O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升，人尿2毫升，海泥抽取液5毫升，消毒海水1000毫升；其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4 ·4Η20 23毫克，MnCl2 ·4Η20178 毫克，CuSO4 · 5H20 10 毫克，F(xiàn)eC6H5O7 · 5Η20 3. 9 克，Na2MoO4 · 2Η20 7. 3 毫克，CoCl2 · 6Η2012毫克，Na2EDTA4. 35克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12 O. 5毫克，維生素& 100毫克,維生素HO. 5毫克,純水1000毫升。
2.如權(quán)利要求I所述的鹽藻培養(yǎng)基，其特征在于將人尿替換為腐化魚汁2毫升。
3.如權(quán)利要求I所述的鹽藻培養(yǎng)基的半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口 ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X 400厘米X 85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入O. 8-1. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)。每池吊袋6-8個；飽和鹵水取自內(nèi)陸鹽湖，用蒸餾水稀釋至鹽度120%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯，硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止，按權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等。接種密度3X 104-4X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度28±3°C，光強(qiáng)5000-100001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石。夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時,重復(fù)進(jìn)行。培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)60X 104-120X 104cell/mL，采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。
4.使用如權(quán)利要求I所述鹽藻培養(yǎng)基的藻液中原生動物殺滅方法，其特征在于當(dāng)培養(yǎng)基使用了 10天以上時，藻液中會出現(xiàn)很多纖毛蟲等原生動物，這時按每升藻液加入O. 6克(NH4)2CO3的量加入(NH4)2CO3,連續(xù)充氣4小時，使之充分溶解并混合均勻，這時藻液中會出現(xiàn)大量沉淀，停止充氣，靜置8小時，棄去沉淀物，將上清液移入到另一潔凈的培養(yǎng)容器中，加入4-5倍體積的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鹽藻半連續(xù)培養(yǎng)方式及藻液中原生動物污染的消除方法，涉及海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域。鹽藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用f/2培養(yǎng)液配方，生長速度慢，產(chǎn)量低。使用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)鹽藻生長速度快、β-胡蘿卜素含量高、成本低，產(chǎn)量能夠提高76％。塑料薄膜懸浮吊帶培養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池培養(yǎng)鹽藻，易于操作、不易污染、易于掌控、靈活多樣、不易劃破、安全可靠，透光性好，成本低，生長快，產(chǎn)量高。按每升藻液加入0.6克(NH4)2CO3的量加入(NH4)2CO3，處理藻液12小時能有效殺滅藻液中的尖鼻蟲、游仆蟲、纖毛蟲、變形蟲等原生動物，而且操作簡便，對鹽藻細(xì)胞傷害很小。
文檔編號C12R1/89GK102936569SQ20121047968
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者王培磊, 豐培金 申請人:王培磊