專利名稱：高粱抗鹽基因SbSAP14及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及高粱抗鹽基因SbSAPM、含有SbSAPM基因的重組表達載體、基因編碼的蛋白，以及基因在提高植物抗鹽性能上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
非生物脅迫，諸如干旱、鹽、極端溫度、高光、重金屬等，影響了作物的生長和產(chǎn)量，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大威脅，嚴重影響了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。非生物脅迫是全球范圍內(nèi)作物減產(chǎn)的主要原因，幾種最主要的作物平均減產(chǎn)高達50%以上(Vij and Tyagi 2007)。隨著作物栽培擴大到一些并不適宜作物生長的地區(qū)，培育出具有抗逆性的植物品種變得越來越重要(Kathuria et al. 2007)。轉(zhuǎn)基因方法為提高植物對非生物脅迫的耐受力提供了新途徑。因而，克隆、鑒定抗逆相關(guān)基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良和創(chuàng)造作物抗逆新種質(zhì)，對選育抗逆植物新品種具有重要的促進意義。高粱(Sorghum bicolor L. Moench)是禾本科高粱屬的一年生草本植物，是全世界種植的第五大禾谷類作物，具有C4植物高光效特征。作為糧食作物，高粱抗旱、耐鹽堿和貧瘠土壤，在干旱和半干旱農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有及其重要的位置。除此之外，它也是重要的飼料植物和釀造業(yè)原料。高粱遺傳多樣性豐富，雜種優(yōu)勢強，雜優(yōu)利用廣泛?；诟吡蛔陨淼膬?yōu)點，從高粱中克隆到相關(guān)的抗逆基因，并對其進行功能鑒定、明確基因功能，可為作物的分子育種提供理論上的指導，并為創(chuàng)制具有耐 旱、耐鹽性轉(zhuǎn)基因水稻和高粱作物等新種質(zhì)、新材料提供了研究基礎(chǔ)，也為改良和提高干旱、半干旱及鹽堿地區(qū)生長的作物抗逆性提供了候選基因資源。脅迫相關(guān)蛋白(Stress Associated Protein, SAP),是一類涉及脅迫應(yīng)答和脅迫調(diào)控的鋅指蛋白，該家族的典型特征是含有特異性的A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域。近年研究發(fā)現(xiàn)SAP蛋白在植物中具有抗非生物脅迫的功能，因而日漸受到重視。2004年，Mukhopadhyay等人從秈稻中克隆到一個含有A20和ANl鋅指結(jié)構(gòu)的基因，A20和ANl鋅指分別位于N端和C段。這個基因被命名為OsiSAPl，是植物中發(fā)現(xiàn)的第一個SAP基因，超表達OsiSAPl的轉(zhuǎn)基因煙草抵抗多種非生物脅迫的能力增強(Mukhopadhyay et al. , 2004) oVi j等人應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)分析了非生物脅迫對水稻SAP家族基因表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的水稻SAP基因均受到一種或幾種非生物脅迫的誘導(Vij and Tyagi 2006)。在此之后，水稻中另外兩個SAP基因取得了與OsiSAPl相似的研究結(jié)果。受到熱、冷、鹽、干燥、重金屬等多種脅迫誘導。超表達的轉(zhuǎn)基因煙草和水稻植株，對鹽、干旱和冷脅迫的耐受力在種子萌發(fā)期和幼苗期均明顯提高，表現(xiàn)在萌發(fā)率、脅迫恢復(fù)后鮮重獲得量等方面(Kannegantiand Gupta 2008)。值得一提的是，轉(zhuǎn)基因水稻在開花期對鹽和干旱具有抗性，而且與未受脅迫的轉(zhuǎn)基因植株相比產(chǎn)量上沒有損失。超表達Z/P777的轉(zhuǎn)基因煙草植株對低溫和高溫脅迫的耐受力增強，但同時對鹽和干旱脅迫敏感性增強(Huang et al. 2008)。上述研究結(jié)果揭示SAP基因家族在植物應(yīng)答不同的非生物脅迫過程中發(fā)揮不同的功能。超表達該家族基因可以增強植物的抗逆性，表明SAP基因家族是通過基因工程提高作物抗脅迫能力的具有應(yīng)用價值的有效基因。同一家族的基因在不同植物中表達的時間和空間存在差異，而且功能也有所不同。不同的植物可能采用不同的分子機制來調(diào)控植物對各種生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答，因此，研究高粱中的基因在整個脅迫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所起的作用，以及說產(chǎn)基因在抗逆過程的作用，對于對將來利用高粱產(chǎn)基因來改良重要的糧食作物和經(jīng)濟作物得到抗逆能力增強的新品種具有十分重要的實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供高粱抗鹽脅迫基因SbSAPM及其在提高植物抗鹽性能上的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
高粱抗鹽蛋白SbSAP14，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。高粱抗鹽基因SbSAPM,其編碼SEQ ID NO: 2所示的蛋白。高粱抗鹽基因SbSAPM,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。含有高粱抗鹽基因·SbSAPM的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。重組表達載體中的載體為pCAMBIA1390表達載體。高粱SbSAPM基因在提高植物抗鹽性能上的應(yīng)用。所述植物為禾本植物。所述禾本植物為水稻、高粱、大麥、玉米。一種抗鹽轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，是將高粱抗鹽基因SbSAP 14導入目的植物中，得到抗鹽性能有所提高的轉(zhuǎn)基因植物。所述目的植物為水稻、高粱、大麥或玉米。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明克隆得到了高粱抗鹽脅迫基因SbSAP 14，并且驗證高粱基因在提高植物抗鹽性能上的作用。本發(fā)明可以為研究基因在水稻、高粱等禾本植物在抗鹽脅迫過程中的作用提供理論基礎(chǔ)，并為高粱的逆境信號轉(zhuǎn)導途徑網(wǎng)絡(luò)的建立提供理論依據(jù)，并可為將來利用SbSAPM基因來改良高粱或其他重要的糧食作物和經(jīng)濟作物，得到抗鹽植物新品種提供新的基因資源。


圖1是cDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖(M :DNA DL 2000分子量標準；1-4 :PCR產(chǎn)物)；
圖2是表達載體質(zhì)粒酶切鑒定圖(M: Marker;1:表達載體質(zhì)粒2 :表達載體質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物);
圖3是21d齡Ub1::SbSAPM水稻苗的SbSAPM表達水平的RT-PCR檢測結(jié)果圖(WT 日本晴；1..Ub1::SbSAPM-1 ； 2 M1: :SbSAP14~2 ；3 M1: :SbSAP14~3 ；4 -Mb1::SbSAP 14~4 ；5 ..Ub1::SbSAP 14-5 ·, XX) -Mb1::SbSAP 14-10 ；16 -Mb1::SbSAP14~16 ；24 -Mb1::SbSAP14~24 ；27 M1: :SbSAP14-27)；圖4是14d齡的油水稻鹽脅迫3d后的表型(左圖對照，正常條件下培養(yǎng)3d后的水稻苗；右圖250mMNaCl脅迫處理3d后的水稻苗；WT:日本晴；#1:Ub1::SbSAP 14-1 ；#4 M1: :SbSAP14~4 ；#27 M1: :SbSAP14~27)；
圖5是21d齡的Ub1::SbSAPM水稻鹽脅迫IOd再恢復(fù)澆水7d后的表型(上圖對照，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)的水稻苗；下圖250mM NaCl脅迫下的水稻苗；從左至右依次為日本晴；Ub1::SbSAPM-1 ·’ Ub1::SbSAP 14~4 ； Ub1::SbSAP14~27)；
圖6是21d齡的Ub1::SbSAPM水稻受250mM NaCl脅迫IOd再恢復(fù)澆水7d后的存活率統(tǒng)計圖(WT :日本晴；#1 M1::SbSAPM-1 ；#4 M1: :SbSAP14~4 ；#27 M1: :SbSAP14~27 ;*代表/7 < O. 05，** 代表/7 < O. 01)
圖7是Ub1::SbSAPM水稻種子在不同濃度NaCl脅迫下萌發(fā)率的統(tǒng)計圖(CK代表對照組即正常培養(yǎng)條件下；WT :日本晴；#1 -.Ub1::SbSAPM-1 ；#4 -Mb1::SbSAP 14~4 ；#27 Ub1: :SbSAP14-27 涔< O. 05，** 代表/7 < O. 01)
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術(shù)包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等都采用常規(guī)的方法，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黃培堂等譯，2002,北京科學出版社)。實施例1`
一、高粱SbSAPM基因的克隆1、引物設(shè)計
以GenBank數(shù)據(jù)庫公布的水稻基因序列作為查詢探針，采用同源序列比對的方法，在高粱基因組信息庫(http://genome.jgi_psf.org/ Sorbil/ Sorbil. home, html)獲得了與相似性極高的候選基因，并將其命名為A其核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所編碼的蛋白質(zhì)如SEQ ID N0:2所示。根據(jù)基因序列特征，利用Primer Premier 5. 00輔助設(shè)計特異性引物(表I )。
權(quán)利要求
1.高粱抗鹽蛋白SbSAP14，其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.高粱抗鹽基因SbSAP14其編碼權(quán)利要求1所述的蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的高粱抗鹽基因SbSAP14的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體中的載體為PCAMBIA1390表達載體。
6.權(quán)利要求2或3所述的高粱SbSAP14基因在提高植物抗鹽性能上的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為禾本植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述禾本植物為水稻、高粱、大麥、玉米。
9.一種抗鹽轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，是將權(quán)利要求2或3所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗鹽性能有所提高的轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培育方法，其特征在于，所述目的植物為水稻、高粱、大麥或玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了高粱抗鹽基因SbSAP14及其應(yīng)用。高粱抗鹽基因SbSAP14的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其所編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本發(fā)明還驗證了高粱抗鹽基因SbSAP14能夠提高植物抗鹽性能，為SbSAP14基因在高粱的抗鹽脅迫過程中的作用提供理論基礎(chǔ)，并為高粱的逆境信號轉(zhuǎn)導途徑網(wǎng)絡(luò)的建立提供理論依據(jù)，并可為將來利用SbSAP14基因來改良高粱或其他重要的糧食作物和經(jīng)濟作物，得到抗鹽植物新品種提供新的基因資源。
文檔編號C12N15/63GK103044535SQ201210553688
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月18日
發(fā)明者王小菁, 王瑛華, 孫姝蘭, 彭建宗 申請人:華南師范大學