一種提取質(zhì)粒dna的試劑和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取質(zhì)粒DNA的試劑和方法，它包括菌體裂解試劑、蛋白質(zhì)抽提試劑、質(zhì)粒DNA沉淀試劑和質(zhì)粒DNA溶解試劑。用本發(fā)明所述提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒操作時間短，提取質(zhì)粒平均時間為8分鐘；本發(fā)明所用提取質(zhì)粒的試劑組成簡單，均為常見實(shí)驗(yàn)試劑，來源廣泛且價格低，各組分均可以采用國產(chǎn)分析純就可以提取到高產(chǎn)量和純度的質(zhì)粒，大大降低了費(fèi)用；獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高，純庋好，無雜蛋白和RNA的污染，提取到的質(zhì)粒DNA可以直接用于酶切、連接、測序、原核轉(zhuǎn)化和真核轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)，大大方便了生物實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
【專利說明】一種提取質(zhì)粒DNA的試劑和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種提取質(zhì)粒DNA的試劑和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)粒DNA是基因工程常用的載體，可以攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌、動物細(xì)胞或植物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增與表達(dá)，質(zhì)粒DNA的提取和純化是分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛和最基本的技術(shù)，質(zhì)粒提取的效率和質(zhì)量對于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(酶切、PCR擴(kuò)增和測序等)的成功與否有著直接的關(guān)系。目前在國內(nèi)外，很多生物試劑公司都研制了與提取質(zhì)粒技術(shù)相關(guān)的試劑盒，如普洛麥格(promega)、碧云天、生工等。該類試劑盒多以純化柱為主,成本高,價格昂貴,試劑繁雜且耗時較長。若以改良的堿裂解、?)—氯仿抽提方法提取質(zhì)粒，獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量低，質(zhì)量不高，不能滿足下游的酶切和測序的要求，同時多種試劑混合應(yīng)用，無疑加大了實(shí)驗(yàn)的工作量，使得實(shí)驗(yàn)時間顯著延長，影響生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明解決了以上不足，提供了一種提取質(zhì)粒DNA的試劑和方法，本發(fā)明所用提取質(zhì)粒的試劑成本低，提取質(zhì)粒DNA的方法操作簡單，且本發(fā)明所述的試劑和方法提取出的質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度高，本發(fā)明具有快速、高效、高質(zhì)且成本低的優(yōu)點(diǎn)。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:
[0005]一種提取質(zhì)粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白抽提試劑、質(zhì)粒DNA沉淀試劑和質(zhì)粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為:10mM Tris-HClUmMEDTA, 150mM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7.5-7.8 ；所述蛋白質(zhì)抽提試劑的組分為酚和氯仿的體積比為1:1的混合物；所述質(zhì)粒DNA沉淀試劑的組分是PH為7.5的5.5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，其中醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為1: 4 ;所述質(zhì)粒DNA溶解試劑的組分為含有0.15mg/ml RNase的超純水。
[0006]本發(fā)明還提供了一種提取質(zhì)粒DNA的方法，它包括以下步驟:
[0007](1)搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒；將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，置于在30-37.5 °C恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘；
[0008](2)取培養(yǎng)12-15小時OD6tltl達(dá)到0.5~0.6之間的生長狀態(tài)良好的細(xì)菌菌液1.5ml于1.5ml離心管，室溫下以12000g離心30秒，棄上清；
[0009](3)沉淀中加入100 μ I所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻；
[0010](4)加入100 μ I所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻5秒鐘；
[0011](5)室溫下以12000g離心5分鐘以釋放質(zhì)粒DNA ；
[0012](6)收集上清，切勿觸動蛋白質(zhì)界面；
[0013](7)加入20 μ I質(zhì)粒DNA沉淀試劑和200 μ I的無水乙醇，顛倒混勻；
[0014](8)室溫下以12000g離心I分鐘以沉淀質(zhì)粒DNA ；[0015](9)棄上清，并干燥質(zhì)粒DNA ；
[0016](10)用50 μ1質(zhì)粒DNA溶解試劑溶解質(zhì)粒DNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017]與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明的所用試劑采用溶菌酶溶解細(xì)菌，通過酚-氯仿一步法去除蛋白質(zhì)和RNA。用本發(fā)明所述提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒的操作時間短，提取一種質(zhì)粒的時間只需8分鐘；本發(fā)明所用提取質(zhì)粒的試劑組成簡單，均為常見實(shí)驗(yàn)試劑，來源廣泛且價格低，各組分均可以采用國產(chǎn)分析純就可以提取到高產(chǎn)量和純度的質(zhì)粒，大大降低了費(fèi)用；獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高，純度好，無蛋白和RNA的污染，滿足分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)要求，提取到的質(zhì)粒DNA可以直接用于下游的酶切、連接、測序、原核轉(zhuǎn)化和真核轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)，大大方便了生物實(shí)驗(yàn)操作，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0018]圖1，不同方法產(chǎn)品所提取的質(zhì)粒DNA圖譜
[0019](M為標(biāo)準(zhǔn)分子量，1、2為promega純化試劑盒，3、4為使用碧云天柱式純化盒所提取的相應(yīng)質(zhì)粒DNA，5、6為使用本發(fā)明方法所提取的質(zhì)粒DNA)
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0021]實(shí)施例1
[0022]本發(fā)明所述的提取質(zhì)粒DNA的試劑包括四種試劑，分別為菌體裂解試劑Rl ;蛋白抽提試劑R2 ;質(zhì)粒DNA沉淀試劑R3 ;質(zhì)粒DNA溶解試劑R4。
[0023]所述菌體裂解試劑Rl:
[0024]組分:IOmMTris-HCl(pH 7.8)；
[0025]1mM EDTA ；
[0026]150mM 氯化鈉；
[0027]5mg/ml 溶菌酶。
[0028]按如下方法配制100mL的試劑Rl:
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種提取質(zhì)粒DNA的試劑，其特征在于它包括菌體裂解試劑、蛋白質(zhì)抽提試劑、質(zhì)粒DNA沉淀試劑和質(zhì)粒DNA溶解試劑；所述菌體裂解試劑的組分為:10mM Tris-HClUmMEDTA, 150mM氯化鈉和5mg/ml溶菌酶，以超純水為溶劑，所述Tris-HCl的PH值為7.5-7.8 ；所述蛋白質(zhì)抽提試劑的組分為酚和氯仿的體積比為1:1的混合物；所述質(zhì)粒DNA沉淀試劑的組分是PH為7.5的5.5M醋酸鈉溶液和無水乙醇，其中醋酸鈉溶液和無水乙醇體積比為1: 4 ;所述質(zhì)粒DNA溶解試劑的組分為含有0.15mg/ml RNase的超純水。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑提取質(zhì)粒DNA的方法，其特征在于它包括以下步驟: (1)搖菌擴(kuò)增質(zhì)粒；將攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB固體培養(yǎng)基中，挑選單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增培養(yǎng)，置于在30-37.5°C恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200-250轉(zhuǎn)/分鐘； (2)取培養(yǎng)12-15小時OD6tltl達(dá)到0.5~0.6之間的生長狀態(tài)良好的細(xì)菌菌液1.5ml于，1.5ml離心管，室溫下以12000g離心30秒，棄上清； (3)沉淀中加入100μ I所述菌體裂解試劑，充分振蕩混勻； (4)加入100μ I所述蛋白抽提試劑，置于渦旋振蕩儀上混勻5秒鐘； (5)室溫下以12000g離心5分鐘以釋放質(zhì)粒DNA； (6)收集上清，切勿觸動蛋白質(zhì)界面； (7)加入20μ I質(zhì)粒 DNA沉淀試劑和200 μ I的無水乙醇，顛倒混勻； (8)室溫下以12000g離心I分鐘以沉淀質(zhì)粒DNA； (9)棄上清，并干燥質(zhì)粒DNA； (10)用50μ I質(zhì)粒DNA 溶解試劑溶解質(zhì)粒DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12R1/19GK103882007SQ201210563585
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月24日
【發(fā)明者】楊艷菊, 何勝祥 申請人:蘇州中同生物科技有限公司