一種女性陽虛質(zhì)不孕癥的篩查試劑盒的制作方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種女性陽虛質(zhì)不孕癥的篩查試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 不孕的醫(yī)學定義為一年未采取任何避孕措施，性生活正常而沒有成功妊娠。主要 分為原發(fā)不孕及繼發(fā)不孕。原發(fā)不孕為從未受孕；繼發(fā)不孕為曾經(jīng)懷孕W后又不孕。根據(jù) 運種嚴格的定義，不孕是一種常見的問題，大約影響到至少10%~15%的育齡夫婦。引起 不孕的發(fā)病原因分為男性不孕和女性不孕。
[0003] 陽虛是陽虛證和陽虛體質(zhì)的共同病理機制，其主要病機為體內(nèi)陽氣虛衰，W肢寒 身冷等寒象為主要表現(xiàn)。陽虛質(zhì)是陽氣不足、W虛寒現(xiàn)象為主要特征的體質(zhì)狀態(tài)。先天不 足，或病后陽虧，是形成陽虛質(zhì)的主要原因。
[0004] 近年來研究發(fā)現(xiàn)不孕患者中陽虛質(zhì)所占比例位居首位。女性陽虛質(zhì)不孕癥患者， 臨床上多由腎氣虛弱，經(jīng)血不足，沖任失調(diào)；或胞宮虛寒，胞脈失養(yǎng)，運用中醫(yī)專方治療效果 較佳。
[0005] 但是，關(guān)于女性陽虛質(zhì)不孕癥的中醫(yī)診斷和評價，目前均必須依賴于醫(yī)生對患者 的訪問，技術(shù)性強，對檢測人員的專業(yè)要求高，而且工作量非常大。
[0006]testisin是一種糖基憐脂酷肌醇錯定的絲氨酸蛋白酶，其在精子生成、附睪精子 成熟和受精中起重要作用。
[0007] 未見testisin與陽虛不孕之間的關(guān)系的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種女性陽虛質(zhì)不孕癥的篩查試劑盒。
[0009] 本發(fā)明女性陽虛質(zhì)不孕癥的篩查試劑盒，它包括任選的用于檢測testisin基因 表達水平的試劑。
[0010] 優(yōu)選地，所述試劑是用于檢測血清中testisin基因表達水平的試劑。
[0011] 優(yōu)選地，所述testisin基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0012] testisin基因的核巧酸序列如下：
[0013]
[0014]
[0015] 優(yōu)選地，所述檢測testisin基因表達水平的試劑時Ncxrthern-blot檢測方法用試 劑、RT-PCR檢測方法用試劑或原位雜交檢測方法用試劑。進一步優(yōu)選地，所述RT-PCR檢測 方法用試劑包括SEQIDN0:2~3所示的引物對。
[0016] 本發(fā)明還提供了檢測testisin基因表達水平的試劑在制備女性陽虛質(zhì)不孕癥篩 查用試劑中的用途。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑是用于檢測血清中testisin基因表達水平的試劑。
[0018] 優(yōu)選地，所述testisin基因的核巧酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0019] 優(yōu)選地，所述檢測testisin基因表達水平的試劑時Ncxrthern-blot檢測方法用試 劑、RT-PCR檢測方法用試劑或原位雜交檢測方法用試劑。進一步優(yōu)選地，所述RT-PCR檢測 方法用試劑包括SEQIDN0:2~3所示的引物對。
[0020] 本發(fā)明試劑盒通過檢測testisin基因的表達水平，可W判斷待檢人群患女性陽 虛質(zhì)不孕癥的風險：若testisin基因的表達水平高，則患女性陽虛質(zhì)不孕癥的風險低，若 testisin基因的表達水平低，則患女性陽虛質(zhì)不孕癥的風險高，可用于臨床女性陽虛質(zhì)不 孕癥的輔助診斷，臨床應用前景良好。
[0021] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0022] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1testisin基因的表達水平與女性陽虛質(zhì)不孕癥的關(guān)系
[0024] 1.材料與方法 [00巧]1. 1實驗材料
[0026] 1. 1. 1主要實驗儀器
[0027]定量PCR儀 MJResearch,PTC-200
[0028] 紫外分光光度儀 BECKMAN
[0029]C1000ThermalCyclerBIO-RAD
[0030] 1. 1. 2主要實驗材料與試劑
[0031]
[0032] 1. 1. 3試劑配制：
[003引（l)PBS緩沖液（g/l，000血）：
[0034]
[0035] 加入DEPC處理的RNase-Free的水，抑值為7. 3左右，定容至1000血，高壓滅菌。
[0036] 似紅細胞裂解液：
[0037]
[0038] 加入DEPC處理的RNase-Free的水，定容至1000血，過濾除菌。
[0039] (3)血液抗凝劑：10μL0. 5M邸TA/ml血液
[0040] 1. 2臨床資料
[0041] 1.2. 1對象來源
[0042] 來源于2013年12月~2015年1月于成都中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院口診，選取典 型女性陽虛質(zhì)不孕患者為研究對象，選取典型平和體質(zhì)正常健康人為對照組。
[0043] 1. 2. 2不孕的診斷標準（參照第屯版全國高等學校教材《婦產(chǎn)科學》）
[0044] 婚后夫婦同居一年W上，有正常性生活，男方生殖功能正常，未避孕而未能受孕者 稱為不孕癥?；楹笪幢茉卸鴱奈慈焉镎撸Q為原發(fā)不孕。曾經(jīng)妊娠，而后未避孕連續(xù)一年未 再妊娠者，稱為繼發(fā)不孕。
[0045] 1. 2. 3中醫(yī)體質(zhì)類型分類標準（參照中華中醫(yī)藥學會《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》）
[0046] 陽虛質(zhì)：
[0047] 主項：平素畏冷，手足不溫，喜熱飲食，精神不振，睡眠偏多。
[0048] 副項：面色既白，目胞晦暗，口唇色淡，毛發(fā)易落，易出汗，大便漉薄，小便清長，舌 淡胖嫩，邊有齒痕，苔潤，脈象沉遲。
[004引平和質(zhì)：
[0050] 主項：陰陽氣血調(diào)和，W體態(tài)適中、面色紅潤、精力充沛等。
[0051] 副項：面色、膚色潤澤，頭發(fā)稠密有光澤，目光有神，鼻色明潤，嗅覺通利，唇色紅 潤，不宜疲勞，精力充沛，耐受寒熱，睡眠良好，胃納佳，二便正常，舌色淡紅，苔薄白，脈和緩 有力。
[0052] 1. 2. 4納入標準
[0053] (1)年齡21~49歲的育齡期女性；
[0054] 似自愿參加實驗，簽署知情同意書。
[00巧]1. 2. 5排除標準
[0056] (1)合并有肝、腎、屯、血管和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病者；
[0057] 似有嚴重視聽和語言障礙，可能影響對調(diào)查問卷的正確理解和回答者；
[0058] (3)嚴重精神病患者。
[0059] 1.2. 6剔除標準
[0060] (1)不符合納入標準或符合排除標準者；
[0061] (2)未按規(guī)定完整填寫調(diào)查表者。
[0062] 1. 2. 7 -般資料分析
[006引 （1)病例分布情況
[0064] 本實驗共納入受試者28例，最終進入評價的受試者28例：病例組22例，對照組6 例。
[0065] (2)兩組患者基本資料
[0066] 表1對照組體質(zhì)類型
[0067]
[0068] 表2陽虛組體質(zhì)類型
[0069]
[0070] 1. 3實驗方法
[0071] 1. 3. 1中醫(yī)體質(zhì)評定標準
[0072] 依據(jù)最新2009版中華中醫(yī)藥學會《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》標準進行體質(zhì)篩選。陽 虛體質(zhì)診斷標準為：陽虛亞量表轉(zhuǎn)化分> 40分，且平和質(zhì)亞量表中轉(zhuǎn)化分<60分；平和體 質(zhì)診斷標準為：平和質(zhì)亞量表中轉(zhuǎn)化分> 60分，且陽虛及其他偏頗體質(zhì)亞量表轉(zhuǎn)化分<40 分。具體量表見附錄1。
[0073] 1. 3. 2qRT-PCR技術(shù)檢測testisin基因的研究
[0074] (1)樣品制備
[00巧]抽取每例患者新鮮邸TA抗凝血2ml，400-500g離屯、5min，棄上清；
[0076] 加入6-10倍細胞體積的紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，室溫放置4-5min;
[0077] 4°C，400-500g離屯、5min，棄上清；
[007引重復b)和c)
[0079] 洗涂1-2次：加入適量PBS,重懸沉淀，400-500g離屯、3min，棄上清；
[0080]加入 200μLTrizol。
[0081] 似提取RNA，合成cDNA [008引①提取RNA
[0083] 在分離出的每一管細胞中加入200μLTRIZOL用槍頭吹打使細胞全部脫離板底， 將其轉(zhuǎn)入1. 5mL化管中；
[0084] 用5mL帶7號針頭的1次性注射器快速吹打10次進行勻漿W剪切基因組DNA，將 勻漿樣品在室溫解育5minW使核蛋白體完全分解；
[0085] 加40μL氯仿，蓋緊化管蓋，用手劇烈振蕩15s并于室溫解育2-3min;
[0086] 4°C，12, 000Xg離屯、15min。離屯、后混合物分成3層：下層紅色的為苯酪-氯仿 層，中間層為細胞殘渣，