專利名稱：一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕金森癥(Parkinson’s disease,PD)是一種最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病,在全世界40歲以上的人口中，有超過(guò)O. 1%的人受到該疾病的影響。在臨床上多數(shù)病人在表現(xiàn)為活動(dòng)失調(diào)及靜止時(shí)不自主的顫抖，心情煩躁、抑郁或精神異常，給社會(huì)和病人家庭帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)，因而對(duì)此疾病的研究也越來(lái)越受到人們的重視。帕金森癥在病理學(xué)表現(xiàn)為患者大腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的喪失，路易包涵體增多。而路易體主要是由一些稱為α-核突觸蛋白錯(cuò)誤折疊和聚集形成的淀粉樣蛋白質(zhì)纖維組成，另外這種錯(cuò)誤折疊的蛋白在體內(nèi)積累也對(duì)多巴胺神經(jīng)元有很大的毒性，促使其凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)α-核突觸蛋白的過(guò)表達(dá)和錯(cuò)誤折疊在帕金森癥形成過(guò)程中具有重要作用。很多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬可以幫助神經(jīng)元細(xì)胞清除具有細(xì)胞毒性的異常蛋白質(zhì)的積累的作用，而細(xì)胞自噬是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的溶酶體依賴性的降解途徑，與人體生理過(guò)程和疾病有著密切的關(guān)系，例如腫瘤、神經(jīng)變性、微生物感染和老化均與自噬的功能失調(diào)有關(guān)。目前，已有多種納米材料被報(bào)道可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。其中，不同類型的量子點(diǎn)也被Nano Lett和Angew Chem雜志報(bào)道可以使細(xì)胞發(fā)生自曬。而α -核突觸蛋白的異常積聚又與其降解通路的障礙有關(guān)，自噬的激活不僅可以降低聚集體的形成，而且可以明顯改善其行為表現(xiàn)。然而以往對(duì)α-核突觸蛋白降解的研究主要集中在泛素化降解途徑，只是近幾年的報(bào)道顯示，自噬也參與了 α-核突觸蛋白的降解，并發(fā)揮更重要的角色。因而，通過(guò)調(diào)控自噬進(jìn)而促進(jìn)α-核突觸蛋白的清除成為延緩帕金森疾病進(jìn)展的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。但是，直到目前為止，都還未曾出現(xiàn)通過(guò)有效引發(fā)帕金森模式細(xì)胞的自噬進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)有毒的α-核突觸蛋白的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α -核突觸蛋白的方法，包括將帕金森模式細(xì)胞消化獲得的細(xì)胞懸液按每孔3 X IO4IX IO5個(gè)鋪6孔板，待細(xì)胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75ηΜ碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點(diǎn)的作用下得到明顯清除；其中，所述帕金森模式細(xì)胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細(xì)胞。
所述碲化鎘量子點(diǎn)的濃度優(yōu)選為4_18nM。所述締化鎘量子點(diǎn)的濃度優(yōu)選為4nM。所述SH-SY5Y細(xì)胞的帕金森模式細(xì)胞的構(gòu)建方法包括1)細(xì)胞分化將所述SH-SY5Y細(xì)胞在含有O. OlmM全反式維甲酸(ATRA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3天后，換含80nM十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)f 2天；2)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3X IO4^XlO5個(gè)鋪6孔板；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)的培養(yǎng)稀釋液，孵育6(Γ72小時(shí)。其中，所述步驟3)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度優(yōu)選為ImM。所述PC12細(xì)胞的帕金森模式細(xì)胞的構(gòu)建方法包括1)細(xì)胞鋪板將所述PC12細(xì)胞消化獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3X 10，3X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板；2)加藥處 理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMmMl-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)的培養(yǎng)稀釋液2ml，孵育36 48小時(shí)。其中，所述步驟2)中MPP+的濃度優(yōu)選為5mM。所述締化鎘量子點(diǎn)的粒徑為3_5nm。所述碲化鎘量子點(diǎn)由微波法合成。本發(fā)明還提供一種碲化鎘量子點(diǎn)作為制備治療帕金森癥藥物的應(yīng)用。所述締化鎘量子點(diǎn)的粒徑為3_5nm。本發(fā)明人通過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)低濃度碲化鎘量子點(diǎn)具有良好的生物相容性，并且發(fā)現(xiàn)這種低濃度碲化鎘量子點(diǎn)可作為自噬激活劑，引起細(xì)胞自噬，從而有效清除帕金森模型中過(guò)表達(dá)和錯(cuò)誤折疊的α -核突觸蛋白，因此提供了這樣一種采用低濃度碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α -核突觸蛋白的方法，為帕金森癥的預(yù)防和治療指明了方向，并為制備治療帕金森癥的藥物開(kāi)辟了一條嶄新的道路。本發(fā)明所使用的試劑和生物材料均為市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)得到的常規(guī)產(chǎn)品。


圖1是示出了不同濃度的碲化鎘量子點(diǎn)的生物相容性的示意圖；圖2Α和2Β是示出了不同濃度(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)的碲化鎘量子點(diǎn)引發(fā)兩種帕金森模式細(xì)胞產(chǎn)生自曬的不意圖；圖3Α和3Β是示出了不同濃度(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)的碲化鎘量子點(diǎn)引發(fā)兩種帕金森模式細(xì)胞產(chǎn)生自噬從而清除帕金森模式細(xì)胞產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的示意圖。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體的實(shí)施例和圖例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受其限制。實(shí)施例1水溶性碲化鎘量子點(diǎn)的制備(參照CN1693206A制備)I)碲氫化鉀的制備將110. 5毫克KBH4固體和91. 6毫克碲粉放到一個(gè)燒瓶中，力口入3毫升水，在O攝氏度下反應(yīng)20小時(shí)后，可得到KHTe溶液，備用；2)碲化鎘前體溶液的制備將36. 8毫克CdCl2溶于100毫升水，加入O. 05毫升巰基乙酸，用O. 5摩爾/升的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=l1. 0，得到碲化鎘前體溶液，通氮?dú)獬鯕?，氮?dú)獗Ｗo(hù)下存放；3)程序控制微波輻射制備CdTe量子點(diǎn)將制備得到的碲化鎘前體溶液進(jìn)行程序控制微波加熱，得到水溶性碲化鎘量子點(diǎn)。其中微波加熱條件為第一程序微波功率70W，第一程序加熱溫度90攝氏度，第一程序加熱時(shí)間30秒鐘；第二程序微波功率500W，第二程序加熱溫度100攝氏度，第二程序加熱時(shí)間為10分鐘。實(shí)際上，采用微波法合成的粒徑在3_5nm左右的常規(guī)水溶性碲化鎘量子點(diǎn)均適用于本發(fā)明的方法。實(shí)施例2采用噻唑藍(lán)方法對(duì)碲化鎘量子點(diǎn)的生物相容性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法噻唑藍(lán)法(MTT)是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性噻唑藍(lán)還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。PH2. 5的十二烷基硫酸鈉能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免 疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞活性。檢測(cè)過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)將SH-SY5Y細(xì)胞(來(lái)源于人類多巴胺能神經(jīng)母瘤細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))或者PC12細(xì)胞(來(lái)源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)
基中培養(yǎng)；2)細(xì)胞鋪板待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪96孔板，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；3)量子點(diǎn)處理待96孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基,分別加入4nM、18nM、75nM的碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)稀釋液100 μ 1，空白對(duì)照組不做處理，按要求孵育24小時(shí)；4 )加入噻唑藍(lán)按要求孵育24小時(shí)后，每孔(包括空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)加入10 μ I的5mg/ml的噻唑藍(lán)，混勻，孵育4小時(shí)；5)加入十二烷基硫酸鈉待孵育噻唑藍(lán)4小時(shí)后，每孔加入100 μ I十二烷基硫酸鈉(10%，pH2. 5)，37°C孵育過(guò)夜；6)酶標(biāo)儀檢測(cè)加入十二烷基硫酸鈉過(guò)夜后，用酶標(biāo)儀(Bio-Rad Model680,Microplate Reader)在490nm和570nm觀察光吸收值(0D值)。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)X 100%如圖1所示，MTT結(jié)果表明碲化鎘量子點(diǎn)在低濃度(4nM、18nM，75nM)的時(shí)候毒性都較小，SH-SY5Y和PC12的細(xì)胞存活率影響不大，證明4-75nM的碲化鎘量子點(diǎn)的生物相容性良好，其中，4nM的碲化鎘量子點(diǎn)生物相容性最好。實(shí)施例3細(xì)胞是否發(fā)生自噬的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬效應(yīng)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中分子量為18Kd的LC3 I蛋白與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成16Kd的LC3 II，并定位于自噬體膜。LC3 II相對(duì)于LC3 I兩種蛋白含量的比例反映了細(xì)胞的自噬活性，本發(fā)明采用的是免疫印跡法來(lái)檢測(cè)LC3 II /LC3 I的值從而檢測(cè)量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞自噬的影響。檢測(cè)過(guò)程包括以下幾個(gè)步驟
I)細(xì)胞培養(yǎng)將SH-SY5Y或者PC12細(xì)胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2)細(xì)胞鋪板待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；3)碲化鎘量子點(diǎn)處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入4nM、18nM、75nM的碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對(duì)照組不做處理，孵育24小時(shí)；4)裂解細(xì)胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細(xì)胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中，一抗為Novus公司的LC3兔抗人抗體,二抗是購(gòu)自KPL公司HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進(jìn)行ECL反應(yīng)并X光片成像； 6)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到LC3 II /LC3 I的數(shù)據(jù)。如圖2A和2B所示，相對(duì)于空白對(duì)照組，不同濃度的碲化鎘量子點(diǎn)處理的SH-SY5Y細(xì)胞或者PC12細(xì)胞都發(fā)生了明顯的LC3 I向LC3 II的轉(zhuǎn)化，這表明不同濃度的碲化鎘量子點(diǎn)都可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。實(shí)施例4建立SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明應(yīng)用1-甲基-4-苯基-卩比唳離子(MPP+)在體外構(gòu)建全反式維甲酸(ATRA)和十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型，并通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)α-核突觸蛋白的表達(dá)，從而衡量構(gòu)建效果。該構(gòu)建方法僅為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，而本發(fā)明保護(hù)的清除α-核突觸蛋白的方法并不僅限于由該方法制備的帕金森模型。該方法包括以下步驟 I)細(xì)胞培養(yǎng)SH_SY5Y細(xì)胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化、鋪板；2)細(xì)胞分化細(xì)胞在含有O. OlmM ATRA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后，換含80nM TPA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)三天，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；3)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板，分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；4)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入ImMMPP+的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對(duì)照組不做處理，孵育72小時(shí)；5)裂解細(xì)胞吸掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；6)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細(xì)胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗依次孵育最后進(jìn)行ECL反應(yīng)并X光片成像；7)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。實(shí)施例5建立PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明應(yīng)用1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)在體外構(gòu)建高分化的PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型，并通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)α -核突觸蛋白的表達(dá)，從而衡量構(gòu)建效果。該構(gòu)建方法僅為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，而本發(fā)明保護(hù)的清除α-核突觸蛋白的方法并不僅限于由該方法制備的帕金森模型。該方法包括以下步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)將PC12細(xì)胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化、鋪板；2)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入ImMMPP+的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對(duì)照組不做處理，孵育48小時(shí)；4)裂解細(xì)胞吸掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘； 5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細(xì)胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗依次孵育最后進(jìn)行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。實(shí)施例6碲化鎘量子點(diǎn)處理可以清除SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明通過(guò)對(duì)采用生物相容性好的碲化鎘量子點(diǎn)(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)處理的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型中α -核突觸蛋白表達(dá)量的測(cè)定，從而評(píng)價(jià)碲化鎘量子點(diǎn)處理是否可以清除SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α -核突觸蛋白。該方法包括以下步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)采用實(shí)施例4步驟2)中分化好的SH-SY5Y細(xì)胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化；2)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板,分為MPP+處理組、空白對(duì)照組、MPP+及量子點(diǎn)處理組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組(包括MPP+處理組、MPP+及量子點(diǎn)處理組)吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入含有ImM MPP+、含有ImM MPP+及4nM、18nM、75nM碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對(duì)照組不做處理，孵育f 3天，優(yōu)選72小時(shí)；4)裂解細(xì)胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細(xì)胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中一抗為Abcam公司的α -核突觸蛋白兔抗人抗體，二抗為購(gòu)自KPL公司HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進(jìn)行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到α _核突觸蛋白/微絲蛋白(其中，微絲蛋白為內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。如圖3Α所示，其一，相較于空白對(duì)照組，MPP+處理組的細(xì)胞中α-核突觸蛋白的表達(dá)有了明顯的上調(diào)，這表明我們成功構(gòu)建了 SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型；其二，相較于MPP+處理組，量子點(diǎn)與MPP+的共處理可以明顯清除SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)MPP+處理成功構(gòu)建了 SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模式細(xì)胞，并且4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ碲化鎘量子點(diǎn)均可有效清除該帕金森模式細(xì)胞中的α -核突觸蛋白。雖然本實(shí)施例中所使用的MPP+的濃度為ImM，但是實(shí)際上先前已有文獻(xiàn)證明O. 5^50mM MPP+范圍內(nèi)的工作濃度均是可行的。由于MPP+對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，當(dāng)MPP+的濃度為ImM時(shí)可以減輕急性損傷，保證SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模型更好的建立，為最優(yōu)選濃度。鑒于實(shí)施例2中所述，4nM的碲化鎘量子點(diǎn)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有更好的生物相容性，所以有效清除SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森模式細(xì)胞中的α -核突觸蛋白實(shí)驗(yàn)的碲化鎘量子點(diǎn)的濃度最優(yōu)選為4ηΜ 。實(shí)施例7碲化鎘量子點(diǎn)處理可以清除PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白實(shí)驗(yàn)方法本發(fā)明通過(guò)對(duì)采用生物相容性好的碲化鎘量子點(diǎn)(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)處理的PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型中α -核突觸蛋白表達(dá)量的測(cè)定，從而評(píng)價(jià)量子點(diǎn)處理是否可以清除PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α -核突觸蛋白。該方法包括以下步驟I)細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化、鋪板；2)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),按每孔3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板,分為MPP+處理組、空白對(duì)照組、MPP+及量子點(diǎn)處理組和量子點(diǎn)處理組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組(包括MPP+處理組、MPP+及量子點(diǎn)處理組)吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入含有5mM MPP+、含有5mM MPP+及4nM、18nM、75nM碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)稀釋液2ml，孵育Γ3天，優(yōu)選72小時(shí)；4)裂解細(xì)胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細(xì)胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中，一抗為Abcam公司的α -核突觸蛋白兔抗人抗體，二抗為購(gòu)自KPL公司HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進(jìn)行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。如圖3Β所示，其一，相較于空白對(duì)照組，MPP+處理組的細(xì)胞中α-核突觸蛋白的表達(dá)有了明顯的上調(diào)；其二，相較于MPP+處理組，量子點(diǎn)與MPP+的共處理可以明顯清除PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型中過(guò)量表達(dá)的α -核突觸蛋白。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過(guò)MPP+處理成功構(gòu)建了 PC12細(xì)胞損傷的帕金森模式細(xì)胞，并且4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ碲化鎘量子點(diǎn)均可有效清除該帕金森模式細(xì)胞中的α -核突觸蛋白。雖然本實(shí)施例中所使用的MPP+的濃度為5mM，但是實(shí)際上先前已有文獻(xiàn)證明0.5 50mM MPP+范圍內(nèi)的工作濃度均是可行的。由于MPP+對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，當(dāng)MPP+的濃度為5mM時(shí)可以減輕急性損傷，保證PC12細(xì)胞損傷的帕金森模型更好的建立，為最優(yōu)選濃度。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基，但是應(yīng)當(dāng)理解，任何適于普通細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基都適用于本發(fā)明。鑒于實(shí)施例2中所述，4nM的締化鎘量子點(diǎn)對(duì)PC12細(xì)胞具有更好的生物相容性,所以有效清除PC12細(xì)胞損傷的帕金森模式細(xì)胞中的α -核突觸蛋白實(shí)驗(yàn)的碲化鎘量子點(diǎn)的濃度最優(yōu)選為4ηΜ。本發(fā)明公開(kāi)了一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用，其原理是通過(guò)低濃度碲化鎘量子點(diǎn)作為自噬激活劑引起細(xì)胞自噬，從而達(dá)到清除α-核突觸蛋白的目的。相對(duì)于前人的結(jié)論而言對(duì)納米材料的生物學(xué)效應(yīng)有了更深的認(rèn)識(shí)，也將對(duì)量子點(diǎn)和其他納米材料的應(yīng)用起到指導(dǎo)作用。以上雖然描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍是由所附權(quán)利要求書(shū)限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背 離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法，其特征在于，包括 將帕金森模式細(xì)胞消化獲得的細(xì)胞懸液按每孔3 X IO4IX IO5個(gè)鋪6孔板，待細(xì)胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75ηΜ碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點(diǎn)的作用下得到明顯清除； 其中，所述帕金森模式細(xì)胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點(diǎn)的濃度為4ηΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述SH-SY5Y細(xì)胞的帕金森模式細(xì)胞的構(gòu)建方法包括 O細(xì)胞分化將所述SH-SY5Y細(xì)胞在含有全反式維甲酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，換含十四烷酰佛波醇乙酸酯的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)； 2)細(xì)胞鋪板待分化細(xì)胞長(zhǎng)滿后消化獲得細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3 X IO4 3 X IO5個(gè)鋪6孔板; 3)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O.5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子的培養(yǎng)稀釋液，孵育。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度為ImM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PC12細(xì)胞的帕金森模式細(xì)胞的構(gòu)建方法包括 O細(xì)胞鋪板將所述PC12細(xì)胞消化獲得的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔3 X IO4 3 X IO5個(gè)細(xì)胞鋪6孔板； 2)加藥處理待6孔板內(nèi)細(xì)胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子的培養(yǎng)稀釋液，孵育。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度為5mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點(diǎn)的粒徑為3-5nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點(diǎn)由微波法合成。
9.一種碲化鎘量子點(diǎn)作為制備治療帕金森癥藥物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述碲化鎘量子點(diǎn)的粒徑為3-5nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用碲化鎘量子點(diǎn)清除帕金森模式細(xì)胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用，包括將帕金森模式細(xì)胞消化獲得的細(xì)胞懸液按每孔3×104～3×105個(gè)鋪6孔板，待細(xì)胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75nM碲化鎘量子點(diǎn)的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點(diǎn)的作用下得到明顯清除；其中，所述帕金森模式細(xì)胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細(xì)胞。本發(fā)明通過(guò)生物相容性良好的碲化鎘量子點(diǎn)誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生自噬效應(yīng)，從而清除帕金森模式細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的毒性蛋白質(zhì)(α-核突觸蛋白)。
文檔編號(hào)C12N5/09GK103013922SQ20121058612
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者黃慶, 陳楠, 李曉明, 魏敏, 樊春海 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所