專利名稱：一種檢測腸出血性大腸桿菌o157:h7活菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種大腸桿菌的檢測方法，特別是涉及一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌0157:H7(E.coli 0157:H7)是與公共衛(wèi)生有關(guān)的最重要的出血性大腸桿菌的血清類型，對環(huán)境抵抗力較強，耐酸耐低溫，對熱敏感，在自然界的水中可存活數(shù)周甚至數(shù)個月。腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病。凡是體內(nèi)有腸出血性大腸桿菌感染的病人、帶菌者和家畜、家禽等都可傳播本病。腸出血性大腸桿菌0157:H7致病能力和對胃酸的抵抗力均較強，對細胞的破壞性大。人群普遍易感，但以老人和兒童為主，而且老人和兒童感染后癥狀往往較重。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)0157:H7列入新的食源性疾病病原菌。目前，國內(nèi)外檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7的方法主要有平板分離培養(yǎng)法和實時熒光PCR技術(shù)。平板分離培養(yǎng)法操作繁瑣，檢測結(jié)果誤差大，檢測周期長，無法在第一時間對腸出血性大腸桿菌0157:H7的發(fā)生狀況進行掌握和控制。實時熒光PCR技術(shù)是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理，設(shè)計相應(yīng)的突光標記核酸探針，通過PCR反應(yīng)對靶基因進行定性、定量分析的技術(shù)。實時熒光PCR技術(shù)具有特異性強、靈敏度高，可定量，無污染的優(yōu)點，易于標準化和推廣應(yīng)用，在醫(yī)學、軍事、農(nóng)業(yè)、科研等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，但由于在細胞死亡后DNA可繼續(xù)存在一段時間，其檢測結(jié)果并不能真正反映樣品中死菌和活菌的數(shù)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有實時熒光PCR不能有效區(qū)分死菌和活菌，導(dǎo)致對致病菌過高檢測的問題，提供一種定性檢測腸出血性大腸桿菌活菌0157:H7的方法，用以克服現(xiàn)有技術(shù)無法迅速鑒定出環(huán)境中腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的問題。本發(fā)明提供了一種定性檢測腸出血性大腸桿菌活菌0157:H7活菌的方法，該方法首先利用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide, PMA)共價結(jié)合待檢樣品中死菌的DNA,再提取樣本DNA，通過實時熒光PCR檢測樣品中腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌。本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，包括以下步驟:(I)液體樣本離心濃縮處理；用接種環(huán)沾取甘油管保存的待檢樣品菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ;挑取單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基，370C，180rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期；用無菌LB培養(yǎng)基調(diào)整0D600值至1.0，其中菌濃度大于或等于109CFU/mL ;吸取ImL處于對數(shù)期的細菌培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，在沸水浴中處理50s后立即置于冰上冷卻，即為大腸桿菌熱致死菌(2)向Iml大腸桿菌死菌濃度大于或等于109CFU/mL的液體樣品中加入PMA，控制PMA終濃度為15-20 μ g/mL,常溫下于暗處孵育，鹵鎢燈照射處理；(3)提取步驟(2)處理后樣本的基因組DNA ；(4)以步驟(3)提取的樣本基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR定量檢測樣本中的目標菌，反應(yīng)體系中引物終濃度為為5-15μπι01/1，探針終濃度為3-12 μ mol/L ;突光定量PCR所用的引物、熒光標記探針如SEQ ID N0.1所示。優(yōu)選地，實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集FAM熒光，40個循環(huán)。暗處孵育的時間為5min，鹵鎢燈照射處理方法為:距離650W鹵鎢燈15cm照射5min。提取步驟(2)處理后樣本的基因組DNA的方法包括酚/氯仿法、水提法或CTAB法。待檢樣本的不是液體樣本時，還需在步驟(I)前將待檢樣本制成液體。本發(fā)明可應(yīng)用于液體環(huán)境中腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的快速定性檢測。待檢樣本的不是液體樣本時，還需在步驟(I)前將待檢樣本制成液體。例如在無菌均質(zhì)袋內(nèi)，無菌操作剪碎25g固體樣本于225mL滅菌LB液體培養(yǎng)基，利用高效自動均質(zhì)器均質(zhì)。吸取每個樣品10mL,800rpm離心5min,除去固體樣本碎片，上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管,8000rpm離心5min收集菌體并重懸于ImL無菌生理鹽水。本發(fā)明步驟(I)對樣本離心的目的在于對樣本進行濃縮處理，獲得較高的菌濃度，以便后續(xù)的操作。步 驟(3)提取出腸血性大腸桿菌0157:H7 DNA的方法可以是本領(lǐng)域所知的任何方法，包括但不限于酚/氯仿法、水提法、CTAB法等。步驟(4)熒光定量PCR所用的實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明以腸出血性大腸桿菌0157:H7為目標菌，建立了可定性檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，通過I對特定的引物和I個熒光標記探針進行實時熒光PCR擴增，即可定性檢測出樣品中的腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌，表現(xiàn)出快速、靈敏、特異性強的特點。本發(fā)明可排除高濃度死菌背景的干擾，實現(xiàn)對腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的檢測，避免了假陽性的檢測結(jié)果。本發(fā)明為半自動化操作，檢測周期短。本發(fā)明方法的建立和應(yīng)用，將縮短腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的檢測周期，可為今后腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌檢測提供有力的技術(shù)支持。


圖1為實施例1熒光PCR檢測結(jié)果曲線。A、B、C、D、E依次為PMA終濃度為0，5，10，
15,20 μ g/mL樣本的擴增曲線。隨著PMA濃度的增大本發(fā)明以腸出血性大腸桿菌0157:H7為目標菌，建立了可定性檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，通過I對特定的引物和I個熒光標記探針進行實時熒光PCR擴增，即可定性檢測出樣品中的腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌，表現(xiàn)出快速、靈敏、特異性強的特點。本發(fā)明可排除高濃度死菌背景的干擾，實現(xiàn)對腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的檢測，避免了假陽性的檢測結(jié)果。本發(fā)明為半自動化操作，檢測周期短。，PMA對死菌DNA的抑制作用增強。圖2為具體實施方式
2的檢測結(jié)果。&、13、(3、(1、6依次為光照時間為0，1，2，3，51^11樣本的擴增曲線。隨著曝光時間增長，PMA對死菌DNA的抑制作用增強。曝光時間為5min或以上時可以完全抑制來自死菌的DNA的擴增。圖3為具體實施方式
3的檢測結(jié)果。其中左側(cè)為活菌經(jīng)PMA處理后的擴增曲線，右側(cè)為熱滅活菌經(jīng)PMA處理后的擴增曲線。熱處理死菌經(jīng)PMA處理后，經(jīng)熒光PCR檢測無典型擴增曲線，檢測結(jié)果為陰性，活菌的擴增為典型的S型曲線。PMA可以結(jié)合熱處理死菌的DNA，對活菌DNA無影響。
具體實施例方式為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于實施例表述的范圍。實施例1一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，按照以下步驟進行:(I)待檢樣品的預(yù)處理:用接種環(huán)沾取甘油管保存的待檢樣品菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D600 ^ 1.0)。用無菌LB培養(yǎng)基調(diào)整0D600值至1.0，其中菌濃度為109CFU/mL。吸取ImL處于對數(shù)期的細菌培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，在沸水浴中處理50s后立即置于冰上冷卻，即為大腸桿菌熱致死菌。通過該處理，使細胞壁與細胞膜有不同程度損傷而達到病菌受損的目的。(2)向Iml大腸桿菌死菌濃度為109CFU/mL的液體樣品中加入疊氮溴化丙錠(PMA)，控制PMA在大腸桿菌菌液中的終濃度為0，5，10，15，20 μ g/mL,常溫下于暗處孵育IOmin,然后距離650W齒鶴燈15cm距離照射5min ；(3)樣品DNA的提取:以酚/氯仿法提取樣品的DNA ；(4)以步驟(3)提取的樣本基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR定量檢測。針對大腸桿菌0157: H7 Stx基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載所有的相關(guān)序列，通過對序列的比較分析，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，利用生物軟件Primer Express〗.0針對該區(qū)段設(shè)計引物和Taqman探針。并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行了 Blast同源性比對驗證，確保序列與其他物種無交叉。設(shè)計熒光定量PCR所用的引物序列如SEQ ID N0.1所示:上游:5，-GACTGCAAAGACGTATGTAGATTCG-3’下游:5，-ATCTATCCCTCTGACATCAACTGC-3，，探針:5’-FAM-TGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTC-BHQ1熒光定量PCR所用的實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。反應(yīng)體系中引物終濃度為為5 μ mol/L,探針終濃度為10 μ mol/L。圖1為檢測結(jié)果。A、B、C、D、E依次為PMA終濃度為0，5，10，15，20 μ g/mL樣本的擴增曲線。隨著PMA濃度的增大，PMA對死菌DNA的抑制作用增強。從圖1可見，PMA終濃度為15 μ g/mL或以上時可以完全抑制來自死菌的DNA的擴增。與未加PMA的樣本相比，當PMA濃度低于15 μ g/mL時，隨著PMA濃度增大,Ct值有不同程度的增大,但死菌背景沒有被完全去除，仍然對活菌的檢測造成干擾，可能造成“假陽性”檢測結(jié)果。當大腸桿菌死菌濃度為IO9拷貝/mL，PMA濃度大于15 μ g/mL時，Ct值無數(shù)值或大于40，表明結(jié)果為陰性。而不使用PMA的普通熒光PCR，或當PMA濃度小于15 μ g/mL時，Ct值小于40，表明有假陽性結(jié)果存在。實施例2一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，按照以下步驟進行:(I)待檢樣品的預(yù)處理:用接種環(huán)沾取甘油管保存的菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D600 1.0)。用無菌LB培養(yǎng)基調(diào)整0D600值至1.0，其中菌濃度為109CFU/mL。吸取ImL處于對數(shù)期的細菌培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，在沸水浴中處理50s后立即置于冰上冷卻，即為大腸桿菌熱致死菌。通過該處理，使細胞壁與細胞膜有不同程度損傷而達到病菌受損的目的。(2)向Iml大腸桿菌死菌濃度為109CFU/mL的液體樣品中加入PMA的終濃度為15 μ g/mL,常溫下于暗處孵育5min，然后距離650W鹵鎢燈15cm照射I 5min ；(3)樣品DNA的提取:以酚/氯仿法提取樣品的DNA ；(4)以步驟(3)提取的樣本基因組DNA為模板進行熒光PCR檢測，其中，設(shè)計熒光定量PCR所用的引物序列如SEQ ID N0.1所示:
上游:5，-GACTGCAAAGACGTATGTAGATTCG-3’下游:5，-ATCTATCCCTCTGACATCAACTGC-3，，探針:5’ -FAM-TGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTC-BHQI熒光定量PCR所用的實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。反應(yīng)體系中引物終濃度為為5 μ mol/L,探針終濃度為12 μ mol/L。圖2為檢測結(jié)果。a、b、c、d、e依次為光照時間為0,1,2,3, 5min樣本的擴增曲線。隨著曝光時間增長，PMA對死菌DNA的抑制作用增強。曝光時間為5min或以上時可以完全抑制來自死菌的DNA的擴增。當曝光時間< 5min時，隨著曝光時間增長，Ct值增大,但樣品中的死菌DNA未能被完全去除，易對活菌的檢測造成干擾，造成“假陽性”檢測結(jié)果。實施例3(I)待檢樣品的預(yù)處理:用接種環(huán)沾取甘油管保存的菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期(0D600 1.0)。用無菌LB培養(yǎng)基調(diào)整0D600值至1.0，其中菌濃度為109CFU/mL。吸取ImL處于對數(shù)期的細菌培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，在沸水浴中處理50s后立即置于冰上冷卻，即為大腸桿菌熱致死菌。通過該處理，使細胞壁與細胞膜有不同程度損傷而達到病菌受損的目的。(2)對濃度為109CFU/mL的活菌或熱處理死菌樣本分別進行離心處理，向待檢樣本中加入PMA至終濃度為15μ g/mL，于暗處孵育5min，然后距離650W鹵鎢燈15cm照射5min ；(3)采用酚-氯仿法提取處理后樣本的基因組DNA ；(4)以提取的樣本基因組DNA為模板進行實時熒光PCR，定性檢測樣本中的目標菌。設(shè)計熒光定量PCR所用的引物序列如SEQ ID N0.1所示:上游:5，-GACTGCAAAGACGTATGTAGATTCG-3’下游:5，-ATCTATCCCTCTGACATCAACTGC-3，，探針:5’-FAM-TGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTC-BHQ1
熒光定量PCR所用的實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集熒光信號，40個循環(huán)。反應(yīng)體系中引物終濃度為為15 μ mol/L,探針終濃度為3 μ mol/L。如圖3所示，其中左側(cè)為活菌經(jīng)PMA處理后的擴增曲線，右側(cè)為熱滅活菌經(jīng)PMA處理后的擴增曲線。熱處理死菌經(jīng)PMA處理后，熒光PCR檢測無典型擴增曲線，檢測結(jié)果為陰性，活菌的擴增為典型的S型曲線。PMA可以結(jié)合熱處理死菌的DNA，使得死菌的DNA不能被擴增，而對活菌DNA無影響。SEQUENCE LISTING〈110〉華南理工大學<120> 一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法<130>1<160>3<170>PatentIn version 3.5<210>1<211>25<212>DNA<213>Artificial Sequence〈220〉〈223〉上游〈400〉Igactgcaaag acgtatgtag attcg25<210>2<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence〈220〉〈223〉 下游<400>2atctatccct ctgacatcaa ctgc24<210>3<211>30<212>DNA<213>Artificial Sequence〈220〉<223>TGAATGTCATTCGCTCTGCAATAGGTACTC<400>3tgaatgtcat tcgctctgca ataggtactc30
權(quán)利要求
1.一種檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)液體樣本離心濃縮處理；用接種環(huán)沾取甘油管保存的待檢樣品菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h ;挑取單菌落接種于50mL液體LB培養(yǎng)基，37°C，180rpm搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期；用無菌LB培養(yǎng)基調(diào)整0D600值至1.0，其中菌濃度大于或等于109CFU/mL ;吸取ImL處于對數(shù)期的細菌培養(yǎng)液于1.5mL離心管中，在沸水浴中處理50s后立即置于冰上冷卻，即為大腸桿菌熱致死菌； (2)向Iml大腸桿菌死菌濃度大于或等于109CFU/mL的液體樣品中加入PMA，控制PMA終濃度為15-20 μ g/mL，常溫下于暗處孵育，鹵鎢燈照射處理； (3)提取步驟(2)處理后樣本的基因組DNA； (4)以步驟(3)提取的樣本基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR定量檢測樣本中的目標菌，反應(yīng)體系中引物終濃度為為5-15 μ mol/L,探針終濃度為3_12 μ mol/L ;熒光定量PCR所用的引物、突光標記探針如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，其特征在于:實時熒光PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變性2min，每個循環(huán):95°C變性5s，60°C退火40s并收集FAM熒光，40個循環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，其特征在于:暗處孵育的時間為5min，鹵鎢燈照射處理方法為:距離650W鹵鎢燈15cm照射5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，其特征在于:提取步驟(2)處理后樣本的基因組DNA的方法包括酚/氯仿法、水提法或CTAB法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測腸出血性大腸桿菌0157:H7活菌的方法，其特征在于:待檢樣本的不是液體樣本時， 還需在步驟(I)前將待檢樣本制成液體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7活菌的方法，本發(fā)明是要解決現(xiàn)有實時熒光PCR不能有效區(qū)分死菌和活菌，導(dǎo)致對致病菌風險的過高估計的問題。該方法先進行待檢樣本的前處理；然后處理后的液體樣品中加入PMA，控制PMA終濃度為15-20μg/mL，常溫下于暗處孵育，鹵鎢燈照射處理；提取處理后樣本的基因組DNA；以提取的樣本基因組DNA為模板，進行實時熒光PCR定量檢測樣本中的目標菌；熒光定量PCR所用的引物、熒光標記探針如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的方法耗時短，約1.5小時即可完成，大大縮短了檢測時間?？蓮V泛用于食源性致病菌檢測領(lǐng)域。
文檔編號C12R1/19GK103224977SQ20121058573
公開日2013年7月31日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者肖性龍, 余以剛, 李聰聰, 吳暉, 李曉鳳 申請人:華南理工大學