專利名稱：一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的pcr引物及方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的PCR引物及方法。
背景技術：
桃[Prunus persica (L.) Batsch]是薔薇科李屬植物,原產(chǎn)我國西部，因其適應性強、栽培范圍廣、童期短、口感好，深受育種者及廣大消費者喜愛。近10年來，世界桃果實生產(chǎn)一直呈上升趨勢，2010年生產(chǎn)量達到20，274，287噸，其中中國占52.8% (FA0STAT 2012，http://faostat.fa0.0rg/)。隨著新品種不斷引入果品市場,及國際市場對果實鮮食品質(zhì)和加工品質(zhì)的要求，香氣作為品質(zhì)評價的一頂重要指標，越來越受到人們的關注。香氣是評價果實內(nèi)在品質(zhì)的關鍵因子之一。桃果實香氣是多基因控制的復雜性狀，不同桃品種香氣成分及含量差異很大。在桃果實中檢測到了 110多種揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)的合成途徑主要包括:(I)脂肪酸合成代謝中的:1)脂氧合酶途徑；該途徑主要合成清香型物質(zhì)，包括C6醛類、醇類；2) β-氧化途徑；該途徑主要合成桃特征香氣中的內(nèi)酯類物質(zhì),包括占香氣組分95%以上的γ，δ-十內(nèi)酯；?；o酶A氧化酶(ACX)參與β-氧化途徑的第一步反應，為限速酶。席萬鵬等已經(jīng)從兩種桃果肉(白肉桃‘湖景蜜露’和黃肉桃‘錦繡黃桃’)中克隆得到4個ACX基因(PpACXl-4)，發(fā)現(xiàn)桃果實在20°C和貯藏過程中PpACXl表達量和ACX酶活性都會增加，內(nèi)酯含量的變化則與前兩者的變化呈正相關。齊玉潔等根據(jù)國際桃基因組序列信息(WWW.phytozome.0rg/peach)克隆得到5個ACX編碼基因(PpACXl_5),并進行果肉組織特異性表達，發(fā)現(xiàn)五個基因成員中，PpACXl在所研究材料的根、莖、葉、果肉中表達最多，為最關鍵的基因成員。(2)萜類合成途徑；花香型成分芳樟醇主要由該途徑中的單萜合成酶(PTS)催化櫳牛兒酰櫳牛兒基二磷酸(GDP)而合成。在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)有20個萜類合成酶基因在花中表達，Atlg61680基因編碼蛋白對合成(S)-芳樟醇具有催化作用；從薰衣草中克隆得到的I個芳樟醇合成酶基因(LaLINS)可以大量催化合成香氣成分(R)-(-)_芳樟醇。對桃香氣候選基因的研究中，通過區(qū)段定位方法，將4個萜類合成酶基因(STC、STS、TSU TC)分別定位在李屬植物(參照圖譜(TXE))的第一和第四連鎖群上，但是否影響芳樟醇的合成并不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的PCR引物，利用該PCR引物可以對桃PpACXl基因、PTSl基因的基因型進行檢測，并預測桃果實中香氣物質(zhì)的含量。一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的PCR引物， 包括兩對引物，
第一對引物為:上游引物:5’-AGTGGTTGAATCTATAATCCGA-3’ ；下游引物:5’-TTCAACTCCTTTGTCAAGCC-3’ ；第二對引物為:上游引物:5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT-3，；下游引物:5’-ACATTCTTCAATGGCATCCTGT-3’。對與桃香氣組分芳樟醇合成相關的核酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，PTSl (GenBank登錄號:DY639772)內(nèi)含子中含有一個以(AT)為重復的SSR片段，該SSR片段及其兩側(cè)保守片段的序列如SEQ ID N0.1所示。根據(jù)該SSR片段兩端的序列設計了上述的第一對引物(PTSl-SSR)，并在PTSl-SSR上游引物的5’端加上綠色熒光基團。對ACX合成基因PpACXl (桃基因組序列ppa002510m)全長進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因中存在一段以(CT)為重復的SSR片段。該SSR片段及其兩側(cè)保守片段的序列如SEQ IDN0.2所示。根據(jù)該SSR片段兩端的序列設計了上述的第二對引物(ACXl)，該引物的上游序列5’端含有一個通用引物尾巴(M13(-21)-TGTAAAACGACGGCCAGT)，如此可利用通用引物在PCR過程中直接將熒光基團加到產(chǎn)物上。由于SSR片段中串聯(lián)重復數(shù)目不同，且片段兩端的序列高度保守，因此，利用特異設計的引物可擴增出不同長度的PCR產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物的片段大小即決定了樣品的基因型。本發(fā)明還提供了一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的方法，包括:(1)提取桃組織的基因組DNA ；優(yōu)選采用CTAB法提取基因組DNA ;并且由于植物的次生代謝物對核酸提取有干擾作用，但幼嫩的新生組織次生代謝物較少、DNA含量高、易于破碎，所述幼嫩的新生組織可以選用幼嫩葉片。(2)以所述基因組DNA為模板，分別利用所述PCR引物進行PCR擴增；其中，采用引物PTSl-SSR進行PCR的反應體系優(yōu)選為10 μ L，包括:10 X PCRbuffer (Mg2+) 2 μ L, 2mM dNTP 1 μ L, 5U rTaq DNApolymerase 0.1 μ L,正向引物 0.25 μ L,反向引物0.25 μ L,20ng/ μ L DNA模板1 μ L,去離子水4.5 μ L ;反應程序優(yōu)選為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，53°C退火40s，72°C延伸40s，35個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；采用引物ACXl進行PCR的反應體系優(yōu)選為20 μ L，包括:10 X PCRbuffer (Mg2+) 2 μ L, 2mM dNTP 0.2μ L,5U rTaq DNApolymerase 0.lyL，正向引物0.1 μ L，反向引物0.5 μ L，M13 (-21)熒光通用尾巴0.4 μ L，20ng/ μ LDNA模板2 μ L，去離子水 14.7 μ L ;反應程序優(yōu)選為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 10個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin ；其中，第一輪PCR反應主要進行DNA片段的PCR擴增，第二輪PCR則是在已經(jīng)擴增得到的PCR產(chǎn)物末端增加M13 (-21)熒光通用尾巴；(3)對擴增產(chǎn)物進行分析，獲得PpACXl基因和PTSl基因的基因型，預測受檢測品種桃果實香氣物質(zhì)含量；所述桃果實香氣物質(zhì)為十內(nèi)酯和芳樟醇。
首先利用群體遺傳學分析方法對桃品種香氣物質(zhì)含量的表現(xiàn)型和基因型進行關聯(lián)性分析；以獲得的關聯(lián)性分析結果為依據(jù)，對待測樣品的PCR擴增產(chǎn)物進行分析，記錄以片段大小為標準的基因型，預測受檢測桃品種的果實中十內(nèi)酯和芳樟醇的含量。若PpACXI基因的基因型為209/213或213/213，則與其他基因型相比，該基因型的桃果實中十內(nèi)酯的含量較高；若PTSl基因的基因型為183/187，則與其他基因型相比，該基因型的桃果實中芳樟醇的含量較高。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為:(1)利用本發(fā)明的引物可準確高效地鑒定桃品種的香氣物質(zhì)含量基因型，預測桃果實香氣物質(zhì)含量，進而對桃香氣品質(zhì)進行初步鑒定；(2)利用本發(fā)明的引物可在苗期對桃葉片進行檢測，大大提高了高香氣品質(zhì)桃品種的篩選效率，加快了桃果實香氣育種的進程，縮短了育種周期。


圖1為PpACXl基因型和表現(xiàn)型關聯(lián)性分析結果圖；圖2為PTSl基因型和表現(xiàn)型關聯(lián)性分析結果圖。
具體實施例方式I基因組DNA的提取用CTAB法分別提取345個桃品種的基因組DNA，具體方法如下:(1)配制緩沖液CTAB 緩沖液:2% CTAB,0.1M Tris, 20mM EDTA, 1.4M NaCl，ρΗ8.0 ；DNA 溶解緩沖液 TE:10mM Tris ；lmM EDTA ；pH 8.0。(2)提取基因組DNA①用天平迅速稱取約1.0g貯藏于-80°C冰箱中的桃幼嫩葉片組織，用液氮于研缽中充分研磨，加少許PVP防止氧化，將粉末快速轉(zhuǎn)入盛有4mLCTAB溶液與80 μ L β -巰基乙醇(65°C預熱)的IOmL離心管中，65°C水浴Ih ；②加入4mL氯仿/異戊醇(24: I)，混勻，12，OOOrpm離心IOmin,取上清液于新IOmL管中，再次加入4mL氯仿/異戊醇(24: I)，混勻，12，OOOrpm離心IOmin ；③將步驟②離心后所得的上清液轉(zhuǎn)入新IOmL管，并加入等體積_20°C預冷的異丙醇，輕輕混勻，在_20°C放置30min至DNA沉淀。10，OOOrpm離心2min，去上清液；④用75 %的乙醇清洗步驟③DNA沉淀物2次；⑤將步驟④洗滌后的DNA晾干并溶于400 μ L的TE緩沖液中，加入2 μ LRNAase酶(10mg/mL)以去除 RNA ；⑥在步驟⑤得到的DNA粗提液中加入400 μ L的苯酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I)混勻，12，OOOrpm離心lOmin。吸取上清液，加入400 μ L氯仿/異戊醇(24: I)混勻后在同樣條件下離心；⑦吸取步驟⑥中的上清液，用步驟③、④的方法沉淀、清洗DNA后加入200 μ L的TE緩沖液溶解；DNA檢測采用紫外分光光度計(Beckman coulter, USA)，確定其濃度和質(zhì)量，同時取1-2 μ L在1.0%的瓊脂糖凝膠上檢測。DNA原液保存于-20°c，工作液稀釋為20ng/ μ L備用。2引物設計(I)PTSl-SSR①從GenBank中搜索與桃香氣組分“芳樟醇”合成相關的核酸序列4條(GenBank登錄號:DY639772、DY647590、DY646265、DY640744)，分別設計引物4對，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成；②以桃基因組DNA為模板，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物先經(jīng)QiaquickGel ExtractionKit (Qiagen, Germany)回收純化試劑盒純化(直接測序的基因不需進行以下幾步)；③將純化產(chǎn)物連接到pGEM-T (Promega，Madison，Wis.)載體上，轉(zhuǎn)入DH5 α感受態(tài)細胞(Takara Biotechnology, Dalian, China)；④將接種于加有IPTG、甘油、安芐及X-gal的LB培養(yǎng)基上37 °C培養(yǎng)12_16h左右，隨后進行菌斑篩選，選出大小均勻的6-8個白色重組單克隆菌斑經(jīng)過夜搖菌后，各取LOyL送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測序；⑤用DNAstar對測序結果進行序列對比分析，發(fā)現(xiàn)PTSl (GenBank登錄號:DY639772)內(nèi)含子中含有一個以(AT)為重復的SSR片段；⑥跨SSR區(qū)重新設計引物對PTS1-SSR，上游引物5’端加熒光基團HEX，委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成后備用。PTSl-SSR引物的堿基序列見表1，PTS1基因SSR片段及兩端保守片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。(2) ACXl從桃基因組DNA重測序的數(shù)據(jù)中，將ACX合成基因PpACXl (桃基因組序列ppa002510m)全長進行拷貝，用DNAstar進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因存在一段以(CT)為重復的SSR片段；在此SSR片段左右設計引物ACX1，上游引物的5’端含有18bp的通用引物尾巴(Ml3 (-21) -TGTAAAACGACGGCCAGT)，委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。進行PCR時，反應體系中需加入帶熒光基團的通用引物尾巴。各片段的堿基序列見表1，PpACXl基因SSR片段及兩端保守片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。表I引物PTSl-SSR和ACXl相關信息
權利要求
1.一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的PCR引物，其特征在于，包括兩對引物， 第一對引物為: 上游引物:5 ’ -AGTGGTTGAATCTATAATCCGA-3，； 下游引物:5’ -TTCAACTCCTTTGTCAAGCC-3’ ； 第二對引物為:上游引物:5 ’ -TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT-3，； 下游引物:5’ -ACATTCTTCAATGGCATCCTGT-3’。
2.一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的方法，包括: (1)提取桃組織的基因組DNA； (2)以所述基因組DNA為模板，分別利用如權利要求1所述的PCR引物，進行PCR擴增； (3)對擴增產(chǎn)物進行分析，獲得PpACXl基因和PTSl-SSR基因的基因型，預測受檢測品種桃果實香氣物質(zhì)含量； 所述桃果實香氣物質(zhì)為十內(nèi)酯和芳樟醇。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，采用CTAB法提取基因組DNA。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，所述桃組織為桃幼嫩葉片。
5.如權利要求2所述的方`法，其特征在于，步驟⑵中，采用第二對引物進行PCR擴增時，進行兩輪PCR反應。
全文摘要
本發(fā)明公開一種預測桃果實香氣物質(zhì)含量的PCR引物及方法，包括兩對引物，第一對引物為上游引物5’-AGTGGTTGAATCTATAATCCGA-3’；下游引物5’-TTCAACTCCTTTGTCAAGCC-3’；第二對引物為上游引物5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTGCTGCTCTTTAGTCTTCTATGTT-3’；下游引物5’-ACATTCTTCAATGGCATCCTGT-3’。該方法包括提取桃組織的基因組DNA；以基因組DNA為模板，分別利用兩對引物，進行PCR擴增；對擴增產(chǎn)物進行分析，獲得PpACX1和PTS1基因的基因型，預測受檢測品種桃果實香氣物質(zhì)含量。
文檔編號C12Q1/68GK103103260SQ20121059470
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權日2012年12月31日
發(fā)明者高中山, 李雄偉, 賈惠娟, 孟憲橋 申請人:浙江大學